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METHODS AND PITFALLS IN THE MEASUREMENT OF ANTI-ACTIN ANTIBODIES IN COELIAC DISEASE Fabbro Elisa, dottoranda primo anno Laboratorio Clinica Pediatrica.

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1 METHODS AND PITFALLS IN THE MEASUREMENT OF ANTI-ACTIN ANTIBODIES IN COELIAC DISEASE Fabbro Elisa, dottoranda primo anno Laboratorio Clinica Pediatrica

2 Anticorpi Anti Actina: nuovi marker sierologici nella celiachia In letteratura sono stati riscontrati differenti valori di sensibilità (82-25%) nella ricerca degli Anti-Actina (A.A.A.); mentre la specifcità ha ottenuto valori prossimi al 100%. (Am. J.Gastroenterol.2004;99:1551. Clin.Exp.Immunol 2004;137: 386).In letteratura sono stati riscontrati differenti valori di sensibilità (82-25%) nella ricerca degli Anti-Actina (A.A.A.); mentre la specifcità ha ottenuto valori prossimi al 100%. (Am. J.Gastroenterol.2004;99:1551. Clin.Exp.Immunol 2004;137: 386). La valutazione retrospettiva degli A.A.A. in sieri conservati a -20 °C ha prodotto valori di sensibilità pari al 43 %.La valutazione retrospettiva degli A.A.A. in sieri conservati a -20 °C ha prodotto valori di sensibilità pari al 43 %. Gli A.A.A. hanno mostrato una significativa correlazione con la lesione istologica della mucosa intestinale.Gli A.A.A. hanno mostrato una significativa correlazione con la lesione istologica della mucosa intestinale.

3 Obbiettivi: Allestire una metodica di immunofluorescenza indiretta per dosare gli A.A.A. al fine di misurare la loro sensibilità e specificità, indipendentemente dalla durata di conservazione dei campioni.Allestire una metodica di immunofluorescenza indiretta per dosare gli A.A.A. al fine di misurare la loro sensibilità e specificità, indipendentemente dalla durata di conservazione dei campioni. Misurare la riproducibilità di questo testMisurare la riproducibilità di questo test di immunofluorescenza indiretto mediante confronto dei risultati tra più operatori. Verificare il ruolo di fattori sierici leganti l Actina, nellinibizione del legame tra la proteina e il suo anticorpo.Verificare il ruolo di fattori sierici (Actin Binding Protein) leganti l Actina, nellinibizione del legame tra la proteina e il suo anticorpo. Realizzare un test immuno-enzimatico su fase solida (ELISA) basato sull antigene actina polimeroRealizzare un test immuno-enzimatico su fase solida (ELISA) basato sull antigene actina polimero

4 La famiglia delle Actin Binding Proteins (ABP) è molto eterogenea e comprende proteine in grado di legare e di modificare la struttura molecolare dellActina. La famiglia delle Actin Binding Proteins (ABP) è molto eterogenea e comprende proteine in grado di legare e di modificare la struttura molecolare dellActina. GelsolinaGelsolina CofilinaCofilina E possibile che tali molecole sieriche sequestrino lActina al legame con anticorpi specifci, inducendo risultati falsamente negativi

5 Materiali e metodi Celiaci diagnosticati tra il 2000 e il 2004 : 102 (12 con lesione istologica 3a, 40 con lesione di tipo3b,48 con lesione 3c); età media : 20 aa; sesso: 57 femmine, 45 maschi; Controlli : 103 donatori di sangue e 76 soggetti malati. I.Allestimento di vetrini attivati con cellule Hep2 II.Trattamento fisico-chimico dei sieri per migliorare la sensibilità diagnostica del test degli A.A.A. III.Lettura al microscopio a fluorescenza

6 1) Risultato: Pz celiaci: =102 =102Controlli sani: sani: =103 =103Controllimalati: =76 =76 % Positivi Sieri non trattati 48 % ( :49) 14,6 % (:15) 18,4 % (:14) Sieri Riscaldati 82,4 % (:84) 24,3 % (:25) 48,7 % (:37) Sieri con E.D.T.A. 76,5 % (:78) 13,5 % (:14) 29 % (:22) Positività degli A.A.A. nei gruppi di studio e nei tre differenti metodi di trattamento dei campioni.

7 12 3 IgA anti-actina su celluleHep2. Le tre foto (x40) illustrano la reattività di un siero di celiaco (lesione istologica 3b): 1 siero non trattato; 2 siero eriscaldato; 3 siero in EDTA. La positività del test è evidente nei fotogrammi 2-3, mentre risulta essere poco visibile (freccia) nella foto 1. Il pretrattamento del siero con il riscaldamento o con lEDTA facilita notevolmente losservazione al microscopio e rende il test più sensibile.

8 correlazione tra positività degli A.A.A. (sieri riscaldati) e grado di lesione istologica. LesionecampioniPositivi%POSITIVI 12866,7% ,5% ,7% 2) Risultato

9 sensibilità NTRE specificità trattamento NTRE Riproducibilità degli A.A.A.: i risultati di tre operatori

10 Riproducibilità degli A.A.A.: confronto della lettura tra più operatori Metodica del trattamento Kappa Forza di agreement Landis- Koch Riprodu cibilità Fleiss Non trattato 0,59ModerataBuona RiscaldatoO,61SostanzialeBuona E.D.T.A.0,64SostanzialeBuona Kappa Forza della concordanza < 0,00 Povera 0,00 – 0,020 Lieve 0,21- 0,40 Discreta O,41-0,60Moderata 0,61-0,80Sostanziale 0,81-1 Quasi perfetta KappaRiproducibilità>0,75Eccellente 0,40-0,74Buona 0,00-0,039Marginale Tab. 1: griglia di valutazione di Landis-Koch Tab. 2: griglia di valutazione di Fleiss

11 Attività inibitoria degli ABP Molecole sieriche che mascherano il legame degli A.A.A. alla proteina

12 Sequenza del test dinibizione: 1. Preincubazione delle cellule con pool di sieri A.A.A. negativi. 2. Incubazione con siero di celiaco positivo agli A.A.A. Attività inibitoria di fattori sierici (ABP ?) presenti nel siero di soggetti A.A.A. negativi: Lattività inibitoria del pool A.A.A. negativo viene abolita dalla preincubazione con dosi crescenti di actina monomerica ( μg/ml)

13 Verificare il ruolo degli nellinibizione del legame tra la proteina e il suo anticorpo. Verificare il ruolo degli (ABP) nellinibizione del legame tra la proteina e il suo anticorpo. incubazione delle cellule con il solo pool di sieri sani A.A.A. negativi Prove di localizzazione 1): incubazione delle cellule con il solo pool di sieri sani A.A.A. negativi preincubazione di un pool di sieri A.A.A. negativi + 2 anticorpo: anti ADF e anti Gelsolina Prove di localizzazione 2): preincubazione di un pool di sieri A.A.A. negativi + 2 anticorpo: anti ADF e anti Gelsolina

14 Conclusioni: Il nostro studio conferma che: Il trattamento chimico e fisico migliora la sensibilità del test, anche in sieri conservati a -20°C per 2-4 anni, a scapito di una ridotta specificità (80%). Alcuni fattori sierici appartenenti alla famiglia delle ABP possono interferire con il legame tra l actina e suo anticorpo specifico. Esiste una stretta correlazione tra gli A.A.A. e la lesione intestinale. Come tutti i test operatore-dipendente anche il presente test è caratterizzato da una bassa riproducibilità. Per questo motivo andrebbe organizzata una rete di laboratori per la standardizzazione e i controlli di qualità della ricerca degli A.A.A.

15 Cardiomiopatie (CMPD) e A.A.A.: una nuova associazione La cardiomiopatia dilatativa è caratterizzata da una dilatazione del ventricolo sx dovuta ad una minor resistenza del miocardio nel quale alcune cellule muscolari sono sostituite da tessuto fibroso, con conseguente aumento della cavità cardiaca ma con minor capacità del cuore di pompare sangue. Probabilmente nelle CMPD idiopatiche esistono alcuni meccanismi di autoimmunità diretti contro proteine del citoscheletro (actina ?)

16 Cardiomiopatie e A.A.A.: una nuova associazione Positività degli A.A.A. in un gruppo di pazienti con CMPD e in parenti di primo grado: Positività degli A.A.A. in un gruppo di pazienti con CMPD e in parenti di primo grado: Sieri Riscaldati Probandi: =63 =63Parenti: =84 =84 % Positivi 59,7 % (:36) 21,4 % (:18) A.A.A. : Fattore patogenetico (?)

17 II Leggenda: rosso = A.A.A. + bianco = A.A.A.- marrone = probando CMPD,Famiglia & Autoimmunità II III

18 Obbiettivi futuri: Continuare il lavoro di screening per la ricerca degli A.A.A. in pazienti con CMPD


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