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Dispositivi e attrezzature per la vitrificazione Dr. Lodovico PARMEGIANI GynePro Medical Centers Bologna, Italy Disclosure Lodovico Parmegiani holds an.

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1 Dispositivi e attrezzature per la vitrificazione Dr. Lodovico PARMEGIANI GynePro Medical Centers Bologna, Italy Disclosure Lodovico Parmegiani holds an international patent, PCT/IB2009/ Device and method for sterilizing liquid nitrogen by ultraviolet radiation

2 Vitrificazione di cellule e tessuto riproduttivo umano n ovociti ed embrioni l impiego clinico in costante crescita n spermatozoi e tessuto ovarico testicolare l sperimentale/ impiego meno diffuso u Parmegiani et al, Journal of Reproductive and Stem Cell Biotechnology 2012 n tecnica l volume minimo di terreno di vitrificazione l elevata viscosità u alta concentrazione dei crioprotettori l alta velocità per cooling and warming u dominanza del warming l dispositivi specificamente progettati: carriers l immersione diretta in azoto liquido

3 Open carriers n Open Pulled Straw Vajta et al,1998 n Cryoloop Lane et al, 1999 n Hemi-Straw Vandervoost et al, 2001 n Cryotop Kuwayama et al, 2005 n Cryoleaf Chian et al, 2009 n Cryolock Bernal et al, 2009 n Vitri-inga Almodin et al, 2010 n Plastic-blade Sugiyama et al, 2010 n Rapid-I, Ultravit, etc… n gli open carriers sono solitamente usati per il congelamento di ovociti umani l Antinori et al, 2007; Cobo et al, 2007; Rienzi et al, 2009; Ubaldi et al, 2010; Garcia et al, 2011

4 Closed carriers n Il modello straw-in-straw, isola il carrier interno che contiene le cellule dal LN 2 attraverso una straw esterna saldabile l Kuleshova and Shaw, 2000; Isachenko et al, 2005 n permette buoni risultati con zigoti, embrioni, blastocisti e tessuto ovarico l Liebermann, 2010; Isachenko et al, 2005, 2010 n questo sistema saldato non è preferito per gli ovociti perchè determina una riduzione nella velocità di cooling/warming n in alternativa, sono stati sviluppati single-straw closed systems che permettono un cooling più rapido : l CryoTip Kuwayama et al, 2005 l Cryopette Keskintepe et al, 2009

5 M M M M M M M M M M Oocyte/embryo microorganism LN 2 (-196°C)Culture medium (37°C) M M M M M M Adhesion of frozen microorganisms to oocyte/embryo and on carriers surface Activation of warmed microorganisms and contamination of culture medium Open Pulled Straw Cryoloop Hemi-Straw Cryotop Cryoleaf Cryolock Vitri-inga Plastic-blade VITRIFICATION: Direct plunging in contaminated LN 2 THAWING: Immersion of contaminated carrier in warming solution at 37°C Parmegiani RBM Online 2011

6 M M M MM M M M M M microorganism LN 2 (-196°C)Culture medium (37°C) M M M M M M Adhesion of frozen microorganisms to sealed external straw No contamination of culture medium Straw in Straw High Security Vitrification VITRIFICATION: Direct plunging in contaminated LN 2 THAWING: Immersion of clean inner carrier in warming solution at 37°C Oocyte/embryo Parmegiani RBM Online 2011

7 VITRIFICATION: Direct plunging in contaminated LN 2 M M M M M M M M M M microorganism THAWING: Immersion of contaminated carrier in warming solution at 37°C LN 2 (-196°C) Culture medium (37°C) M M M M M Adhesion of frozen microorganisms to carriers surface Activation of warmed microorganisms and contamination of culture medium CryoTip Cryopette M Oocyte/embryo Parmegiani RBM Online 2011

8 Open vitrification n il rischio di contaminazione del terreno di coltura al warming - a causa del precedente contatto tra le cellule e/o la superficie esterna del carrier - non può essere escluso, se il LN 2 usato per la vitrificazione/stoccaggio è stato accidentalmente contaminato l Bielanski et al, Cryobiology 2000, Theriogenology 2011 n non tutti i closed-carriers sono sicuri l single straw closed carriers u Parmegiani et al, Fertil Steril 2012 l vitrificazione mediante supercooled air u Parmegiani, Fertil Steril 2011 l ultravitrificazione u Parmegiani and Vajta, Fertil Steril 2011

9 Sterilizzazione UV di LN 2 n irradiazione con la dose UV necessaria per deattivare i microorganismi che sopravvivono in LN 2 l Parmegiani PCT/IB2009/ n irradiazione UV erogata in entro un periodo breve prima che lazoto evapori completamente l Time = UV dose/UV intensity (I)

10 Controllo dellefficacia della sterilizzazione di LN 2 Parmegiani et al, Fertil Steril 2010 A: total bacteria B: pseudomonas aeruginosa C: escherichia coli D: aspergillus niger assenza di contaminazione nel dewar che conteneva LN 2 irradiato con UV contaminazione dei dewars prima del riempimento con LN 2 contaminazione nel dewar dopo aggiunta ed evaporazione di LN2

11 Efficiency of LN 2 - UV sterilization n la giusta dose di radiazione UV deattiva la crescita di ogni microrganismo l virus tipo Epatite: 8000 UV dose l fungi tipo Aspergillus niger: UV dose u Parmegiani et al, Hum Reprod 2009 n la decontaminazione di piccoli volumi di LN 2 via UV è facile e rapida l Nterilizer, strumento per la sterilizzazione UV- LN 2 assicura e certifica una dose UV minima di μWs/cm 2 per ogni cliclo di sterilizzazione u Parmegiani et al, RBM Online 2010

12 Stoccaggio n lo stoccaggio dei tessuti riproduttivi è sicuro l nessuna cross-contaminazione in 25 anni u Pomeroy et al, Fertil Steril 2010; Bielanski et al, Theriogenology 2011 n..ma qualsiasi tecnica volta a prevenire il rischio ipotetico di contaminazione deve essere benvenuta l nuove probabili leggi l diffusione della vitrificazione n è urgente stabilire un sistema di vitrificazione che impedisca qualsiasi rischio di ipotetica contaminazione delle cellule riproduttive l questo sistema in futuro potrebbe essere utile anche per altre cellule umane, tessuti, organi interi…

13 European Community regulations n Italian IVF Law (40/2004) l specimens from patients HIV/HBV/HCV positive must be cryostored in separate cryobanks n European Community directives 2006/17/EC- 2006/86/EC-2004/23/EC indicate: l procedures to avoid the risk of contamination l sterile tools and devices for tissue/cells handling l procedures to sterilize tools and devices l suggested certified medical devices n allo stato attuale non ci sono linee guida o regolamenti che impediscano il contatto diretto tra tessuti e/o cellule e LN 2

14 Aseptic open vitrification Parmegiani et al, RBM Online 2011 n usando LN 2 sterilizzato con UV, la vitrificazione può essere eseguita in maniera asettica mediante open carriers che vengono racchiusi in astucci ermetici n primo studio al mondo sullefficacia e sicurezza della sterilizzazione UV del LN 2 combinata con lo stoccaggio ermetico degli ovociti umani l comparazione della performance di ovociti MII fratelli freschi e vitrificati in pazienti infertili l ovociti MII randomizzati per ICSI; gli ovociti fratelli soprannumerari vitrificati l dopo linsuccesso con ovociti freschi: ICSI degli ovociti vitrificati u Clinical Trials Registration number: ISRCTN

15 Materiali e metodi n n Cryotop l Kuwayama et al, 2005 n n sterilizzazione LN 2 mediante Nterilizer l Parmegiani et al, 2009, 2010, 2011 n n Cryotops racchiusi in goblets di alluminio (pre-raffreddati) per isolarli ermeticamente allo stoccaggio l l precedentemente immersi verticalmente in LN 2 l l Cryotops inseriti nei goblets tenendo la strip con gli ovociti nei vapori N 2 sopra LN 2 l l goblets chiusi ermeticamente con tappi sterilizzati e nastro adesivo

16 Risultati La sterilizzazione UV di LN 2 accoppiata con stoccaggio ermetico non influenza negativamente la competenza di sviluppo degli ovociti vitrificati

17 Efficiency of aseptic open vitrification and hermetical cryostorage of human oocytes n qualsiasi tipo di carrier per la vitrificazione può essere usato n si elimina qualsiasi rischio di contaminazione n si implementa la sicurezza del cryo-banking n si incoraggiano i produttori a progettare, realizzare e commercializzare contenitori ermetici per lo stoccaggio dei carriers

18 Hermetical goblets for cryostorage of human vitrified specimens – Parmegiani et Rienzi, Hum Reprod 2011

19 Applicazioni future n decontaminazione di dewars e criobanche n aseptic open vitrification l tessuto ovarico l cellule staminali l organi interi u ovaio, testicolo, etc.? n procedura di decontaminazione prima del warming

20 Procedura di decontaminazione al warming n microrganismi sopravvivono in LN 2 /NV l Parmegiani et al, Fertil Steril 2010; Grout and Morris, Theriogenology 2009 n patogeni rinvenuti in criobanche di cellule/tessuti riproduttivi umani l stoccaggio in LN 2/ /NV u Morris, Cryobiology 2005; Bielanski,Theriogenology 2012 n lesposizione a LN 2 /NV è potenzialmente pericolosa l stoccaggio non ermetico l procedure di vitrificazione aperta n contaminazione delle cellule riproduttive umane e terreno di coltura durante lo scongelamento/warming l Parmegiani et al, RBM Online 2011; Hum Reprod 2011

21 3 wash procedure Parmegiani et al, Fertility and Sterility, In Press n n procedura di lavaggio prima dello scongelamento l l minimizza il rischio ipotetico di contaminazione della coltura n n 2 lotti di LN 2 contaminati sperimentalmente l l Batteri: Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Stenotrophomonas maltophilia l l Funghi: Aspergillus niger l l inoculazione di 10 9 CFU u u volte più alta di quella mai rinvenuta in criobanche per uso umano n n 232 carriers per la vitrificazione immersi in LN 2 contaminato l l Cryotop, Cryoleaf, Cryopette u u 117 in LN 2 con batteri u u 25 in LN 2 con funghi n n carriers testati microbiologicamente l l randomizzati mediante software u u senza alcun lavaggio (controllo) u u dopo tre lavaggi successivi con azoto sterile certificato

22 3-Wash with Sterile Liquid Nitrogen (SLN 2 ) WARMING CRYOBANK SLN 2 NTERILIZER Device for sterilization and certification of LN 2 Parmegiani et al, Hum Reprod 2009 Fertil steril 2010; RBM Online 2011 NTERILIZER Device for sterilization and certification of LN 2 Parmegiani et al, Hum Reprod 2009 Fertil steril 2010; RBM Online 2011

23 3-Wash with SLN 2 - risultati e conclusioni n efficiente decontaminazione in condizioni sperimentali estreme l scongelamento di cellule riproduttive umane in crio-contenitori "non-ermetici u carriers per la vitrificazione, straws non ermetiche, etc n certificazione della sterilità del lotto di SLN 2 l traccia dellavvenuta decontaminazione u Controllo Qualità o per le legislazioni restrittive

24 n la vitrificazione sta emergendo come il metodo di criopreservazione più impiegato per le cellule riproduttive umane n lottimizzazione di alcuni aspetti tecnici, come la sterilizzazione di LN 2, permette di migliorare lefficacia e la sicurezza della vitrificazione Dispositivi e attrezzature per la vitrificazione Lodovico Parmegiani


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