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Studio del ruolo funzionale e caratterizzazione strutturale del cuprocomplesso TFF1-Cu Dottorato in Biochimica e Patologia dell’Azione dei Farmaci Dipartimento.

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Presentazione sul tema: "Studio del ruolo funzionale e caratterizzazione strutturale del cuprocomplesso TFF1-Cu Dottorato in Biochimica e Patologia dell’Azione dei Farmaci Dipartimento."— Transcript della presentazione:

1 Studio del ruolo funzionale e caratterizzazione strutturale del cuprocomplesso TFF1-Cu Dottorato in Biochimica e Patologia dell’Azione dei Farmaci Dipartimento di Scienze Farmaceutiche e Biomediche IX ciclo Tutor: Prof. Liberato Marzullo Dottorando: Sandro Montefusco 26/01/2012

2 Introduzione: Famiglia dei Trefoil Factors Costituita da: peptide gastrico pS2/TFF1, peptide spasmolitico SP/TFF2 e fattore intestinale ITF/TFF3 Struttura - Motivo caratterizzato da tre anse e stabilizzato da tre ponti disolfuro Funzione - Ruolo essenziale nei processi di restituzione e rigenerazione epiteliale nel tratto GI - Coinvolgimento in cruciali processi fisio- patologici: insorgenza e sviluppo neoplastico, proliferazione, differenziamento, migrazione cellulare, apoptosi

3 Introduzione: Lacrimal Glands Hypothalamus – Hypophysis Bladder Siti di espressione: TFF1 : stomaco, duodeno, colon, pancreas, ghiandole di Brunner, vescica, ghiandole salivari e lacrimali, epitelio respiratorio, ghiandole mammarie, dotti biliari. TFF2 : stomaco, ghiandole di Brunner, epitelio del dotto pancreatico e biliare. TFF3 : epitelio intestinale, cellule goblet, ghiandole Brunner, utero, mammella, ipotalamo, ipofisi.

4 Introduzione: Carcinoma della mammella TFF1 indotto da estrogeni TFF1 marker tumorale Infiammazione Ulcere intestinali, soggetti affetti dal morbo di Crohn e infezioni da H. pylori presentano, nelle aree compromesse, elevati livelli di TFF1 Tumor-suppressor TFF1 ridotto in metaplasie intestinali e adenomi gastrici, TFF1 completamente assente nel 40-60% di carcinomi gastrici Topi tff1 knockout sviluppano adenoma gastrico e carcinoma intramucosale Variazioni dei livelli dei peptidi TFF sembrano essere coinvolte nei processi neoplastici

5 Trefoil Factor 1 TFF1 lega specificamente il rame. L’interazione induce un cambio di conformazione nella struttura terziaria della proteina. L’analisi effettuata su intestino di ratti, resi nutrizionalmente carenti di rame, ha mostrato aumento dell’espressione del peptide TFF1. Real Time tff1

6 - Valutare l’espressione di TFF1 in condizioni di depletamento di rame. - Studiare l’influenza del rame sull’attività biologica della proteina. - Studiare il ruolo del cuprocomplesso TFF1-Cu nelle infezioni da Helicobacter pylori. Obiettivi: - Analizzare il ruolo di TFF1 nei meccanismi di omeostasi del rame.

7 Espressione di TFF1 in cellule AGS L’espressione di TFF1 aumenta in condizioni di depletamento di rame Real Time PCR ** p value = 0,08 * p value < 0,05

8 Analisi del promotore: Saggi di Luciferasi

9 anova p<0,05 Nella regione -583/-435 esistono elementi sensibili alle variazioni di concentrazione del metallo che regolano positivamente l’espressione del gene in condizioni di deprivazione di rame controllo BCS -435

10 Analisi del promotore L’analisi della sequenza -583/-435 con il software Transfac ha mostrato la presenza di un sito putativo Sp1 tra le sequenze consensus con score più elevato

11 sonda: p Sp1 sonda: c Sp1 Analisi del promotore p Sp1: sequenza putativa di legame ad Sp1 del promotore di tff1 m Sp1: sequenza mutata nella regione putativa di legame c Sp1: sequenza di legame canonica ad Sp1 Scr: sequenza scrambled

12 Le proteine degli estratti nucleari legano in modo specifico la sequenza putativa di legame ad Sp1 sonda: p Sp1 sonda: c Sp1 Analisi del promotore p Sp1: sequenza putativa di legame ad Sp1 del promotore di tff1 m Sp1: sequenza mutata nella regione putativa di legame c Sp1: sequenza di legame canonica ad Sp1 Scr: sequenza scrambled

13 - Valutare l’espressione di TFF1 in condizioni di depletamento di rame. - Studiare l’influenza del rame sull’attività biologica della proteina. - Studiare il ruolo del cuprocomplesso TFF1-Cu nelle infezioni da Helicobacter pylori. Obiettivi: - Analizzare il ruolo di TFF1 nei meccanismi di omeostasi del rame.

14 Rame e forma omodimerica di TFF1 Il rame promuove la formazione dell’omodimero condizioni riducenti condizioni non riducenti Western Blot: surnatanti di cellule AGS-AC1 TFF1 dimero TFF1

15 Migrazione Cellulare: Wound Healing AGS-AC1

16 BCS + dox - dox * p-value < 0,05 + dox - dox distance (  m) * Migrazione Cellulare: Wound Healing * p-value < 0,05 (Tosco A, Monti MC, Fontanella B, Montefusco S, D'Andrea L, Ziaco B, Baldantoni D, Rio MC, Marzullo L., Cell Mol Life Sci. 2010) L’induzione di TFF1 determina un aumento della migrazione cellulare La chelazione di Cu modula negativamente l’attività motogenica di TFF1 AGS-AC1 TFF1 distanza (µm) 24 h

17 - Valutare l’espressione di TFF1 in condizioni di depletamento di rame. - Studiare l’influenza del rame nella formazione dell’omodimero di TFF1 e sulla sua attività motogenica. - Studiare il ruolo del cuprocomplesso TFF1-Cu nelle infezioni da Helicobacter pylori. Obiettivi: - Analizzare il ruolo di TFF1 nei meccanismi di omeostasi del rame.

18 Rame e secrezione di TFF1 in AGS-AC1 In cellule incubate in eccesso di rame, si osserva un ritardo nella secrezione della proteina Controllo Cu 10  M Cu 100  M controlloCu 10 μMCu 100 μM r TFF1 72 h

19 KO tff1 Fegato Stomaco Intestino +/+ -/- AGS-AC1 TFF1 e omeostasi del rame

20 AGS-AC1 24 h -S +/- dox Cu 10  M Cellule iper-esprimenti TFF1 accumulano quantità maggiori di rame

21 AGS-AC1 24 h -S Cu 10  M +/- dox BCS 500  M Cellule iper-esprimenti TFF1 trattengono il rame per tempi più lunghi TFF1 e omeostasi del rame

22 Alti livelli di rame Bassi livelli di rame TFF1 Cu 2+ TFF1 e omeostasi del rame

23 - Valutare l’espressione di TFF1 in condizioni di depletamento di rame. - Studiare l’influenza del rame sull’attività biologica della proteina. - Studiare il ruolo del cuprocomplesso TFF1-Cu nelle infezioni da Helicobacter pylori. Obiettivi: - Analizzare il ruolo di TFF1 nei meccanismi di omeostasi del rame.

24 Helicobacter pylori: interazione con TFF1 H. pylori interagisce con TFF1 Ipotesi per l’infezione tessuto- specifica caratteristica del batterio La porzione oligosaccaridica degli LPS di H. pylori legano TFF1 nella forma dimerica Il pH ottimale di questa interazione è tra

25 Helicobacter pylori: introduzione Il medico italiano Giulio Bizzozero descrisse per la prima volta batteri spiraliformi nello stomaco di animali. 1893, Arch Mickrobiol Anat Due ricercatori australiani, Marshall e Warren, descrissero per la prima volta una relazione tra strani bacilli ricurvi, dapprima classificati entro il genere Campylobacter, con forme di gastrite attiva e ulcere duodenali 1984, Lancet; 8390: Classificazione del genere Helicobacter Goodwin et al 1989, int j syst bacteriol, 39: I due ricercatori australiani ricevono il Nobel per la medicina

26 Helicobacter pylori: introduzione Gram Negativo Dimensioni: 0,5-1  m x 2-4  m Microaerofilo: 37°C 3-5 giorni Mobile per la presenza di 4-6 flagelli Genoma: 1,4 - 1,7 Mb Patogeno per l’uomo Ureasi positivo Trasmissione: orale-orale / fecale-orale / gastro-orale Epidemiologia: endemica adultibambini >50 anni2-10 anni paesi industrializzati35-40%5-10% paesi in via di sviluppo80-90%45-50%

27 Helicobacter pylori: fattori di virulenza Cag island: locus ~ 40 kb, 31 geni. Molti di questi geni codificano per il sistema di secrezione di tipo IV. CagA: proteina batterica che transloca nella cellula ospite promuovendo cambiamenti morfologici e alterazioni della membrana plasmatica. VacA: altera la permeabilità della membrana mitocondriale promuovendo l’apoptosi; stimola segnali pro-infiammatori; altera il normale traffico delle vescicole del compartimento endosomiale provocando la formazione di canale e formazioni di vacuoli. BabA2: lega l’antigene Lewis(b) delle cellule epiteliali gastriche. Cag Island Suerbaum S. & Josenhans C., Nature 2007 Cover T.L.. & Blanke S.R.., Nature 2005 Effects of VacA

28 Helicobacter pylori: LPS -Bassa immunogenicità degli LPS di H. pylori -Particolari variazioni nella componente “Lipide A” -Infezioni a lungo termine -Infiammazione cronica promuove un danno gastrico

29 Helicobacter pylori: LPS Lisati Cellulari Frazioni Subcellulari LPS

30 Helicobacter pylori: Influenza di TFF1 nella colonizzazione Effetti dei trattamenti sulla vitalità di H. pylori Cu 10 µM BCS 500 µM Dox

31 Helicobacter pylori: Infezione di H. pylori in AGS-AC1 Controllo + Dox AGS-AC1 rosso - H. pylori verde - TFF1 blu - nuclei 130 kDa CagA

32 Infezioni con ceppo H. pylori P12 wild-type Helicobacter pylori: Influenza di TFF1 nella colonizzazione T-test : p-value **< 0,01 * <0,05 TFF1 svolge un ruolo significativo nelle infezioni di H. pylori Il rame modula positivamente l’infezione di H. pylori mediata da TFF1 Cu Dox BCS Dox Hp Cu 10  M BCS 500  M

33 Helicobacter pylori: Influenza di TFF1 nella colonizzazione P12HP  479 (Dolan B. et al., dati confidenziali, in stampa) P12HP  1191 Wt P12 HP479 codifica una D-glycero-D-manno-heptosyltrasferase HP1191 codifica una LD heptosyltransferase Il ceppo mutato P12HP∆1191 non interagisce con TFF1

34 Infezioni con ceppo mutato HP  479 Helicobacter pylori: Influenza di TFF1 nella colonizzazione T-test : p-value **< 0,01 * <0,05 Cu Dox BCS Dox Cu 10  M BCS 500  M

35 Infezioni con ceppo mutato HP  1191 Helicobacter pylori: Influenza di TFF1 nella colonizzazione control Dox Dox Cu Cu Dox - + +

36 Helicobacter pylori: interazione con TFF1 HT29 MTX E12 (E12): Subclone di cellule HT29, colon carcinoma umano, caratteristiche per la formazione di uno strato mucoso. (Alemka A., et al., Infect Immun. 2010) TFF1 e H. pylori colocalizzano nello strato mucoso (Dolan et al., dati confidenziali, in stampa)

37 Helicobacter pylori: interazione con TFF1 Infezioni in HT-29 E12 con ceppo H. pylori P12 wild-type T-test : p-value * <0,05 Cu 10  M BCS 500  M

38 Rame e strato mucoso (Alemka A., et al., Infect Immun. 2010) HT29 MTX E12 (E12): Subclone di cellule HT29, colon carcinoma umano, caratteristiche per la formazione di uno strato mucoso.

39 Rame e strato mucoso A B C DEF controllo

40 controllo Cu Rame e strato mucoso

41 Risultati Il rame influenza l’espressione della proteina. Nel promotore di tff1 sono presenti elementi sensibili alle variazioni di concentrazione del metallo. Il rame favorisce l’omodimerizzazione di TFF1 e la sua attività motogenica. TFF1, nel modello cellulare AGS-AC1, è coinvolto nei processi di assorbimento/secrezione del metallo. TFF1 favorisce l’infezione di H. pylori. Il rame modula positivamente l’infezione di H. pylori mediata da TFF1.

42 Prospettive future Verificare l’effettivo legame di Sp1 sul promotore di TFF1. Approfondire il coinvolgimento di TFF1 nei meccanismi di omeostasi del rame. Individuare la regione di TFF1 coinvolta nel legame con i LPS di H. pylori.

43 Università di Salerno Dipartimento Scienze Farmaceutiche e Biomediche University College Dublin School of Medicine & Medical Science Ringraziamenti Prof. Liberato Marzullo Prof. Alessandra Tosco Dr. Bianca Fontanella Dr. Roberta Esposito Dr. Marguerite Clyne Considero valore sapere in una stanza dov’è il nord, qual è il nome del vento che sta asciugando il bucato. E. de Luca Dr. M.-C. Rio Institute of Genetics and Molecular and Cellular Biology - CNRS. Strasbourg, France Dr. D. Baldantoni Dipartimento di Chimica - Università di Salerno Coordinatrice del Dottorato Prof. Antonella Leone


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