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Il Laboratorio del CSOx Moderno ausilio per la diagnosi ed il monitoraggio clinico Andrea Bolner Villa Margherita, 27 settembre 2014.

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1 Il Laboratorio del CSOx Moderno ausilio per la diagnosi ed il monitoraggio clinico Andrea Bolner Villa Margherita, 27 settembre 2014

2 Equilibrio Ossigenato/Ossidato Ossigeno: indispensabile per la vita, condiziona i viventi che devono adattarsi a uno stato pro-ossidante GOOD BAD

3 ROS

4 Gli ossidanti Radicali liberi: instabili, altamente reattivi, ad emivita bassissima ( sec), responsabili del danno ossidativo a carico di macromolecole biologiche (DNA, lipidi, carboidrati, proteine) Radicali liberi: instabili, altamente reattivi, ad emivita bassissima ( sec), responsabili del danno ossidativo a carico di macromolecole biologiche (DNA, lipidi, carboidrati, proteine) ROS = specie reattive dell’ossigeno ROS = specie reattive dell’ossigeno RNS = specie reattive dell’azoto RNS = specie reattive dell’azoto RGS = specie reattive glucosio-derivate RGS = specie reattive glucosio-derivate Pro-ossidanti non radicalici: Pro-ossidanti non radicalici: H 2 O 2 H 2 O 2 IDROPEROSSIDI IDROPEROSSIDI

5 Principali radicali liberi ROSRNS Ossigeno singoletto 1O21O2 Monossido di azoto NO Anione superossido O2-O2- Diossido di azoto NO 2 Radicale idrossile HOPerossinitrito NO 3 - Radicale peridrossile HO 2 Radicale alcossile RO Radicale idroperossile RO 2 Acido ipocloroso HClO Acido ipobromoso HBrO Ozono O3O3

6 Stress ossidativo: ruolo fisiologico Principali sorgenti dei ROS 1.Enzimi di membrana NADPH dipendenti (Nox 1-5 e Duox 1-2) 2.Mitocondri 3.Enzimi intracellulari: xantina ossidasi, cicloossigenasi, lipossigenasi

7 Radicali liberi LA REAZIONE REDOX (1) Reazione di OSSIDAZIONEReazione di RIDUZIONE Per ogni specie che si OSSIDA c’è un’altra specie che si RIDUCE Le specie che si RIDUCONO sono OSSIDANTI Le specie che si ossidano sono RIDUCENTI O ANTIOSSIDANTI

8 Il ruolo cruciale del LAB 1+2 = 3 ossidanti + antiossidanti = effetti ? SPECIE OSSIDANTI BARRIERA ANTIOSSIDANTE 1 2 3

9 AZIONI DEGLI OSSIDANTI Uno stress ossidativo è causa di ALTERAZIONI MOLECOLARI fosfolipidi di membrana fosfolipidi di membrana modificazioni delle membrane modificazioni delle membrane capacità di compartimentazione capacità di compartimentazione capacità di trasporto selettivo capacità di trasporto selettivo distruzione distruzione acidi nucleici acidi nucleici mutazioni mutazioni alterazioni espressione genica alterazioni espressione genica proteine proteine alterazioni di struttura alterazioni di struttura perdita funzioni enzimatiche perdita funzioni enzimatiche perdita funzioni di trasporto perdita funzioni di trasporto perdita funzioni recettoriali perdita funzioni recettoriali

10 Il ruolo cruciale del LAB Radicali ROS, RNS, RGS Non radicali H 2 O 2 AntiossidantiENZIMATICI NON ENZIMATICI endogeni NON ENZIMATICI esogeni Perossidazione LIPIDI Ossidazione PROTEINE Ossidazione DNA 1 2 3

11 Misura della Capacità Ossidante Totale d-ROMS d-ROMS (Diacron International, Grosseto) FORT FORT (Callegari, Parma)

12 Capacità ossidante totale Radicals Oxygen Metabolites Test (d-ROMs test) Diacron International – Grosseto, Italy Reazione di Fenton: i metalli di transizione (es. Fe) catalizzano la scissione degli idroperossidi (ROOH) in derivati radicalici secondari (alcossilici RO e perossilici ROO ): questi reagiscono con un derivato amminico che si trasforma in un catione radicalico colorato. Reazione di Fenton: i metalli di transizione (es. Fe) catalizzano la scissione degli idroperossidi (ROOH) in derivati radicalici secondari (alcossilici RO e perossilici ROO ): questi reagiscono con un derivato amminico che si trasforma in un catione radicalico colorato. ROOH + Fe 2+ RO + OH - + Fe 3+ ROOH + Fe 2+ RO + OH - + Fe 3+ ROOH + Fe 3+ ROO + H + + Fe 2+ RO + ROO + A-NH 2 RO - + ROO - + H + + [A-NH 2 + ] Calibrazione con H 2 O 2 : risultato in unità CARR o mg H 2 O 2 /dL equivalenti Calibrazione con H 2 O 2 : risultato in unità CARR o mg H 2 O 2 /dL equivalenti

13 HCY, DANNO VASCOLARE e STRESS OSSIDATIVO Meccanismi di istolesività non del tutto noti Meccanismi di istolesività non del tutto noti Dimostrati: Dimostrati: Antagonismo sintesi e funzione dell’NO endoteliale (riduzione azione vasodilatante) Antagonismo sintesi e funzione dell’NO endoteliale (riduzione azione vasodilatante) Formazione di anione superossido (O 2 - )e conseguentemente di perossinitrito (NO 3 - ) Formazione di anione superossido (O 2 - )e conseguentemente di perossinitrito (NO 3 - ) Proliferazione fibre muscolari lisce, aumento adesione endoteliale e deposizione LDL (correlazione iperHcy e aumento oxLDL) Proliferazione fibre muscolari lisce, aumento adesione endoteliale e deposizione LDL (correlazione iperHcy e aumento oxLDL) Attivazione piastrinica con adesione e aggregazione Attivazione piastrinica con adesione e aggregazione Attivazione fattore V endoteliale Attivazione fattore V endoteliale

14 ANTIOSSIDANTI ENZIMATICI o PRIMARI Detossificano la cellula dai ROS con reazioni in cui le specie radicaliche perdono la loro reattività e vengono trasformate in sostanze innocue ANTIOSSIDANTI NON ENZIMATICI o SECONDARI Implementano le difese antiossidanti (es. ripristinando il pool dei tioli) ed agiscono di per sé come scavengers

15 Gli antiossidanti ENZIMATICI  SODO 2 -  Catalasi, PerossiredoxinaH 2 O 2  GSH perossidasi idroperossidi organici  GSH reduttasi idroperossidi organici  GSH S-transferasi substrati ossidati  Tioredoxina reduttasi, Glutaredoxina e Nucleoredoxina omeostasi redox + trasduzione + modulazione del segnale La nutrizione svolge un ruolo fondamentale nel mantenere l’efficacia delle difese enzimatiche antiossidanti Oligoelementi essenziali (selenio, rame, manganese e zinco) sono coinvolti nella struttura molecolare o nell’attività catalitica

16 Gli antiossidanti NON ENZIMATICI ENDOGENI Glutatione (GSH) Glutatione (GSH) Coenzima Q10 (Ubichinone) Coenzima Q10 (Ubichinone) Acido urico Acido urico Bilirubina Bilirubina Melatonina Melatonina Tioredoxina Tioredoxina

17 Gli antiossidanti NON ENZIMATICI ESOGENI Vitamine liposolubili Vitamine liposolubili Vitamina A (retinolo + 3-deidroretinolo) e carotenoidi (luteina, zeaxantina) Vitamina A (retinolo + 3-deidroretinolo) e carotenoidi (luteina, zeaxantina) Vitamina E (  -tocoferolo) + famiglia dei tocoferoli e tocotrienoli Vitamina E (  -tocoferolo) + famiglia dei tocoferoli e tocotrienoli Vitamina K (fitil-menachinone) Vitamina K (fitil-menachinone) Vitamine idrosolubili Vitamine idrosolubili Vitamina C (acido ascorbico) Vitamina C (acido ascorbico) Acido Lipoico Acido Lipoico Polifenoli e Flavonoidi Polifenoli e Flavonoidi Micronutrienti (selenio, rame, zinco) Micronutrienti (selenio, rame, zinco)

18 Misura della Capacità Antiossidante Totale (TAC) Liquidi biologici Liquidi biologici Plasma Plasma Saliva Saliva Liquido seminale Liquido seminale Alimenti Alimenti Bevande Bevande Oli Oli Frutta e vegetali Frutta e vegetali

19 Antiossidanti non enzimatici endogeni Glutatione (GSH) tripeptide Glu-Cys-Gly tripeptide Glu-Cys-Gly biodisponibilità: dipende da azione di enzimi (GRed, GPx, G6PDH) e disponibilità di cofattori (NADPH, da vit. PP) biodisponibilità: dipende da azione di enzimi (GRed, GPx, G6PDH) e disponibilità di cofattori (NADPH, da vit. PP) deficit congenito di G6PDH o GSH = gravi alterazioni membrana RBC deficit congenito di G6PDH o GSH = gravi alterazioni membrana RBC in molte vie metaboliche in molte vie metaboliche coenzima coenzima substrato substrato trasporto (aminoacidi, gruppi NH2, peptidi) trasporto (aminoacidi, gruppi NH2, peptidi) azioni azioni antiossidante antiossidante detossificante (alcool, additivi, coloranti, derivati toluolo, benzolo, etc.) detossificante (alcool, additivi, coloranti, derivati toluolo, benzolo, etc.) chelante (metalli pesanti) chelante (metalli pesanti) nella frutta e vegetali crudi (avocado, cocomero, asparagi, pompelmo, patate, fragole, pomodori, arance, melone, carote, spinaci, pesche) nella frutta e vegetali crudi (avocado, cocomero, asparagi, pompelmo, patate, fragole, pomodori, arance, melone, carote, spinaci, pesche)

20 Antiossidanti non enzimatici esogeni Vitamina C Vitamina A beta Carotene Licopene

21 Perossidazione lipidica (1) 1) Sottrazione H + da un gruppo metilenico adiacente a un doppio legame di un PUFA 2) Formazione di radicale centrato su un atomo C 3) Riarrangiamento del doppio legame con formazione di un diene coniugato 4) Reazione O 2 con radicale C e formazione di radicale perossile ROO 5) Reazione del radicale perossile con altro PUFA e formazione di un idroperossido (ROOH) + un altro radicale centrato sul C

22 Perossidazione lipidica (2) 6) Gli idroperossidi lipidici possono reagire ulteriormente e formare: perossidi ciclici aldeidi  -  -insature (MDA, acroleina, 4HNE) pentano ed etano dieni 2,3 trans-coniugati isoprostani colesterolo-ossidi Le aldeidi prodotte da LPO sono chimicamente reattive vs proteine ed acidi nucleici: contribuiscono ad amplificare ulteriormente il danno radicalico

23 Misura della Perossidazione lipidica TBARS e MDA fotometria ( TBA test ), HPLC-FL ( TBA test ), ELISA, immuno-istochimica TBARS e MDA fotometria ( TBA test ), HPLC-FL ( TBA test ), ELISA, immuno-istochimica 4-HNE HPLC-FL, immuno-istochimica ELISA 4-HNE HPLC-FL, immuno-istochimica ELISA F2-isoprostani GC-MS, ELISA, RIA F2-isoprostani GC-MS, ELISA, RIA Dieni coniugati spettrofotometria Dieni coniugati spettrofotometria Lipoperossidi GC-MS, spettrofotometria Lipoperossidi GC-MS, spettrofotometria Lp-CHOLOX spettrofotometria Lp-CHOLOX spettrofotometria LDL ox ELISA, immuno-istochimica LDL ox ELISA, immuno-istochimica

24 Ossidazione proteica (1) Ossidazione di residui aminoacidici Alifatici → Gruppi carbonilici → Idroperossidi e perossidi di Val, Leu, Lys Aromatici → Tyr-derivati → Trp-derivati (chinurenina) Tiolici → Met-sulfossido e Met-sulfone → Cys disolfuri Le modificazioni ossidative causano: frammentazione alterazione strutturale aggregazione perdita di funzionalità

25 Misure di ossidazione proteica Carbonili spettrofotometria, immunoistochimica, ELISA, Western Blot Carbonili spettrofotometria, immunoistochimica, ELISA, Western Blot Prodotti di ossidazione della Tyr Prodotti di ossidazione della Tyr NO 2 -Tyr GC-MS, HPLC-UV NO 2 -Tyr GC-MS, HPLC-UV Cl-Tyr ELISA Cl-Tyr ELISA Br-Tyr Western Blot, immunoistochimica Br-Tyr Western Blot, immunoistochimica Tyr-Tyr LC-MS/MS Tyr-Tyr LC-MS/MS Prodotti di glicazione ELISA Prodotti di glicazione ELISA Neo-epitopi Western Blot, immunoistochimica Neo-epitopi Western Blot, immunoistochimica Prodotti ossidazione singoli aminoacidi Prodotti ossidazione singoli aminoacidi

26 Ossidazione del DNA ROS (soprattutto OH) causano mutazioni di basi e rotture doppia elica 8-idrossi-deossi-guanosina (8-OHdG): marcatore di danno a carico dei soli residui di guanina catene nucleotidiche da estratti tissutali: 8OHdG/2dG ratio plasma: free e protein-bound urine: free metodi ELISA e HPLC

27 Il CSOx LAB un laboratorio di 2° livello

28 Il ruolo cruciale del CSOx LAB d-ROMs test Omocisteina BAP test SOD GSH/GSSG Vitamina C Vitamina E Vitamina A  -Carotene Licopene CHOLOx test 4-HNE 3-NT 8-OHdG CoQ10 Quadro generale metabolico 35 parametri + IL

29 Il referto del CSOx

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32 Commento al referto

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35 Stress ossidativo: ruolo fisiologico Target intracellulari dei ROS I ROS regolano l’attività di tirosina-fosfatasi per ossidazione del gruppo –SH di alcune Cys reattive: Sulfonazione (RSO 3 H) Sulfonazione (RSO 3 H) Nitrosilazione (RSNO) Nitrosilazione (RSNO) Glutationilazione (RSSG) Glutationilazione (RSSG) Disolfuri intra- o inter- molecolari (RSSR) Disolfuri intra- o inter- molecolari (RSSR)

36 Stress ossidativo e tumori “… ROS both accelerate and delay cancer initiation and progression…” Azione ossidante-mutagena = citotossica, tumorigenica Azione ossidante-mutagena = citotossica, tumorigenica Azione di trasduzione del segnale = attivazione di vie metaboliche di proliferazione, differenziamento e adattamento metabolico Azione di trasduzione del segnale = attivazione di vie metaboliche di proliferazione, differenziamento e adattamento metabolico Meccanismo ROS bifasico: Meccanismo ROS bifasico: PRIMA citotossico, tumorigenico PRIMA citotossico, tumorigenico POI di stimolazione e potenziamento della barriera antiossidante cellulare (pool GSH e tioredoxina ridotti) POI di stimolazione e potenziamento della barriera antiossidante cellulare (pool GSH e tioredoxina ridotti)

37 1.Lo stress ossidativo è un’ alterazione dell’equilibrio omeostatico tra specie ossidanti e barriera antiossidante; 2.Lo stress causa dannose alterazioni strutturali e funzionali di proteine, lipidi e DNA; 3.Il laboratorio studia e quantifica i 3 elementi in gioco: ROS, barriera antiossidante, danni ossidativi; 4.Valutare i livelli di stress per contrastarne l’insorgenza può migliorare lo stato di salute e prevenire o rallentare le patologie cronico-degenerative

38 GRAZIE PER L’ATTENZIONE “…Il guerriero della luce presta attenzione alle piccole cose …” Paulo Coelho


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