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STRESS OSSIDATIVO Stress chimico indotto dalla presenza, in un organismo vivente, di un eccesso di specie chimiche reattive, generalmente centrate sullossigeno.

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1 STRESS OSSIDATIVO Stress chimico indotto dalla presenza, in un organismo vivente, di un eccesso di specie chimiche reattive, generalmente centrate sullossigeno (reactive oxygen species, ROS), secondario ad unaumentata produzione delle stesse e/o a una ridotta efficienza dei sistemi fisiologici di difesa antiossidanti.

2 PRO-OSSIDANTIANTIOSSIDANTI STRESS OSSIDATIVO Sbilanciamento dellequilibrio tra pro-ossidanti e antiossidanti nellorganismo a favore dei pro-ossidanti

3 Lo stress ossidativo è la conseguenza di uno squilibrio tra processi pro- ossidanti e processi antiossidanti (Sies, 1991) Specie reattive Difese antiossidanti Radiazioni, farmaci, metalli pesanti Fumo di sigaretta, alcool, inquinamento Esercizio fisico inadeguato, sedentarietà Infezioni ed altre malattie Ridotta assunzione e/o diminuita sintesi e/o ridotta capacità di utilizzazione e/o aumentato consumo di antiossidanti Danno cellulare Invecchiamento precoce Malattie cardiovascolari Altre malattie Demenza, M. di Parkinson Infiammazioni, tumori Danno tissutale Danno dorgano Danno sistemico

4 Reazioni del metabolismo dellossigeno Lossigeno è una molecola biatomica solitamente rappresentata come O::O In realtà alla temperatura corporea lossigeno è un biradicale.O : O. con due elettroni spaiati, ciascuno localizzato su un orbitale diverso. A causa quindi della sua configurazione elettronica lossigeno va incontro a riduzione monovalente ( 1 e - )

5 Quando un ossigeno guadagna un elettrone, si trasforma in radicale anione superossido, O 2 -. Laggiunta di un secondo elettrone (insieme con due protoni) trasforma questultimo in perossido di idrogeno, H 2 O 2. Il perossido non è un radicale ma guadagna facilmente un altro elettrone dando spazio ad un radicale idrossilico, OH che è una particella chimica molto attiva che inizia facilmente reazioni a catena incontrollabili.

6 I principali ROS sono: O 2 - (anione superossido), O 2 H (radicale idroperossido); OH (radicale idrossilico); NO (monossido dazoto); ONOO - (anione perossinitrito). Esistono altre molecole, quali H 2 O 2 (perossido didrogeno) e HOCl (acido ipocloroso) che pur non essendo radicali di per sé, producono facilmente il radicale idrossilico, altamente reattivo Nei sistemi biologici, i radicali liberi dellossigeno o ROS (Reactive Oxygen Species) vengono generati ed eliminati continuamente.

7 Le specie chimiche reattive, radicaliche, agiscono come ossidanti Lossidazione, ovvero il trasferimento di uno o più elettroni, è la base chimica dello stress ossidativo ++ Radicale (ossidante) AA Nuova molecola (ridotta, stabile) Molecola bersaglio (doppio legame C-C) CC Nuovo radicale (ossidante) CC Elettrone spaiato OSSIDAZIONE

8 REAZIONI DI RADICALI LIBERI INIZIO: formazione di radicali liberi PROPAGAZIONE: i radicali liberi reagiscono con altre molecole per produrre altri radicali liberi TERMINAZIONE: i radicali liberi reagiscono tra loro per formare molecole

9 REAZIONI DI RADICALI LIBERI CH 4 + Cl 2 CH 3 Cl + HCl

10 INIZIO Cl Cl Richiesta luce UV per questo primo stadio Formazione di radicali liberi PROPAGAZIONE Non è richiesta luce Ogni reazione produce radicali liberi La propagazione è caratterizzata da reazioni in ciascuna delle quali si consuma un radicale libero e se ne forma un altro

11 Molecole H Cl + H C H H Radicali liberi H Cl H + C H H H C + Cl Cl H H C Cl + Cl H

12 TERMINAZIONE La terminazione è caratterizzata dalle reazioni dei radicali liberi per produrre molecole Cl + Cl H H C H C H H H Cl + C H H Cl C H H Cl Cl H H H C C H H H

13 Diverse specie chimiche reattive sono implicate nella patogenesi dello STRESS OSSIDATIVO Non radicale HOClOAcido ipocloroso Radicale-S Tiile Non radicale ROONO(Alchil)perossinitrito Non radicale NO 2 + Catione nitronio Non radicale ONOOHAcido perossinitroso Non radicale ONOO - Perossinitrito Non radicale N2O3N2O3 Triossido nitrico Non radicale N2O4N2O4 Tetrossido nitrico Non radicale HNO 2 Acido nitroso RadicaleNO Ossido nitrico Non radicale O3O3 Ozono RadicaleE-O Fenossile (dalla vitamina E) RadicaleQ Semichinone (dal Coenz. Q) Non radicale ROOH(Alchil)idroperossido RadicaleROO (Alchill-)perossil radicale RadicaleR Radicale alchilico RadicaleHO Radicale ossidrile Non radicale H2O2H2O2 Perossido di idrogeno Radicale (?) 1O2*1O2* Ossigeno singoletto RadicaleO 2 Anione superossido ClasseFormulaSpecie chimicaClasseFormulaSpecie chimica

14 I ROS vengono prodotti sia attraverso una serie di reazioni catalizzate da enzimi che attraverso reazioni di natura non enzimatica. I ROS possono essere prodotti anche in seguito ad esposizione a radiazioni ionizzanti, xenobiotici, agenti chemioterapici.

15 reazione di Fenton: H 2 O 2 + Fe 2+ (Cu + ) Fe 3+ (Cu 2+ ) + HO + OH - reazione di Haber-Weiss: H 2 O 2 + O 2 - HO + OH - + O 2 Il perossido di idrogeno in presenza di ioni Fe 2 + o Cu 2+ reagisce con lanione superossido prendendo parte alla:

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17 I mitocondri vengono considerati la fonte principale di ROS cellulari poiché i radicali del superossido vengono generati costantemente durante la fosforilazione ossidativa e possono essere convertiti in H 2 O 2 ed altre specie reattive dellossigeno Durante i processi di fosforilazione ossidativa, il 4-5% dellossigeno non viene completamente ridotto ad H 2 O, ma forma prodotti intermedi dellO 2 altamente reattivi

18 Nella cellula, i ROS oltre che nei mitocondri, vengono generati anche in altri compartimenti e da molti enzimi.

19 Numerose attività metaboliche sono in grado di generare ROS Citocromo P 450 Citocromo b 5 NADH deidrogenasi Citocromo ossidasi NADPH ossidasi Lipoossigenasi Xantina ossidasi Aldeide ossidasi Stress ossidativo da modificazioni reattive della superficie cellulare Stress ossidativo da induzione farmacometabolica Stress ossidativo da variazioni intracellulari della pO 2 Stress ossidativo da ridotta efficienza del- la respirazione cellulare Citocromo P 450 Citocromo b 5 Xantina ossidasi Aldeide ossidasi NADPH ossidasi Lipoossigenasi NADH deidrogenasi Citocromo ossidasi

20 Produzione di ROS dal catabolismo purinico Xantina ossidasi ipoxantina xantinaxantina Acido urico H 2 O + O 2 H2O2H2O2H2O2H2O2 O2O2O2O2 O2.O2.O2.O2. Meccanismo dazione della NADPH ossidasi

21 Biosintesi dellNO Agisce come importante messaggero intra ed inter cellulare regolando molte funzioni: pressione arteriosa, respirazione, coagulazione del sangue ed alcune attività cerebrali. Ha un ruolo determinante nella difesa dalle infezioni batteriche e nella prevenzione dei tumori

22 MECCANISMI DI PRODUZIONE DI ROS Negli organismi viventi i ROS sono generati nel corso della normale attività metabolica cellulare

23 A concentrazioni elevate i ROS sono dannosi per lorganismo in quanto attaccano i maggiori costituenti della cellula (proteine, acidi nucleici, lipidi) partecipando così a processi complessi quali linvecchiamento e le patologie ad esso correlate. A concentrazioni moderate i ROS partecipano attivamente ad una varietà di processi biologici complessi, implicati nella normale crescita cellulare quali la trasduzione del segnale, il controllo dellespressione genica, la senescenza cellulare, lapoptosi

24 Effetto dei ROS sulle macromolecole I ROS causano danni ossidativi, chimici alle biomolecole Il radicale idrossilico OH reagisce con le biomolecole tramite reazioni di sottrazione o addizione di H. Uno dei siti più sensibili al danno causato dai ROS è la membrana plasmatica, in particolare il bersaglio è a livello degli acidi grassi poliinsaturi Il radicale idrossilico OH reagisce con vari amminoacidi per formare derivati idrossilati Il radicale idrossilico OH reagisce con le basi azotate I ROS reagiscono anche con i carboidrati per formare composti dicarbonilici

25 La matrice cellulare rappresenta uno dei principali target delle specie reattive dellossigeno Il danno della matrice extracellulare gioca un ruolo determinante nella patogenesi dello stress ossidativo

26 Gli effetti dello stress ossidativo sulla struttura e sulle funzioni cellulari Cellula normale (senza lesioni) Cellula dopo lattacco dei ROS Perossidazione di lipidi Modificazioni enzimatiche Modificazioni del DNA Denaturazione di proteine Perossidazione ammi- noacidi e proteine (Per)ossidazione di carboidrati Alterazioni della omeostasi ionica

27 Effetto dei ROS sulle macromolecole Uno dei siti più sensibili al danno causato dai ROS è la membrana plasmatica, in particolare il bersaglio è a livello degli acidi grassi poliinsaturi. Il radicale idrossilico OH sottrae un atomo di idrogeno ad un acido grasso poliinsaturo, iniziando così una catena di reazioni di perossidazione lipidica. I perossidi lipidici formati in questa reazione vengono degradati per formare dei prodotti caratteristici quali la malonildialdeide (MDA) o lidrossinonenale (HNE) Questi composti reagiscono con le proteine formando legami crociati e addotti chimici con esse (prodotti finali di lipoossidazione avanzata)

28 DANNO INDOTTO DALLA LIPOPEROSSIDAZIONE ALLE MEMBRANE BIOLOGICHE

29 RADICALI LIBERI ridotta fluidita di membrana perossidazione dei PUFA (acidi grassi polinsaturi) compromessa attività cellulare NEOPLASIE MALATTIE CARDIOVASCOLARI INVECCHIAMENTO

30 Effetto dei ROS sulle macromolecole Il radicale idrossilico OH reagisce con vari amminoacidi per formare derivati idrossilati H 2 O 2 e HOCl e ONOO - reagiscono con la metionina e la tirosina per formare nitro-e-clorotirosina e metionina solfossido

31 Effetto dei ROS sulle macromolecole Il radicale idrossilico OH reagisce con le basi azotate. I maggiori prodotti dellossidazione sono la 8-ossiguanosina (il principale indicatore di danno al DNA), timinaglicole, 5- idrossimetiluracile

32 RADICALI LIBERI E ACIDI NUCLEICI

33 EFFETTI DEI RADICALI LIBERI NEI SISTEMI BIOLOGICI

34 Difese antiossidanti Per evitare i danni ossidativi, la cellula ha sviluppato un sofisticato sistema di difesa nei confronti dei ROS di natura enzimatica e non (attività scavenger). Tali meccanismi di difesa sono fondamentali per lomeostasi redox cellulare che dipende dal bilancio tra generazione dei ROS e sistemi antiossidanti. Quando lequilibrio si sposta a favore dei primi oppure la cellula si trova in uno stato di carenza di difese antiossidanti si crea la condizione di stress ossidativo. I principali enzimi responsabili dellomeostasi redox cellulare sono: la superossido dismutasi (SOD) la catalasi la glutatione perossidasi la tioredossina la perossiredossina Questi enzimi funzionano come scavengers dei ROS, ma non possono intervenire direttamente sulle macromolecole biologiche a rimuovere un danno già avvenuto.

35 Il sistema antiossidante è regolarmente distribuito nella cellula

36 ANTIOSSIDANTI ENDOGENI Enzimi : SOD, catalasi, glutatione perossidasi Proteine : proteine-SH, leganti metalli (Fe, Cu) Altre molecole : acido urico, bilirubina... Vitaminici : Vitamina C Vitamina E Carotenoidi ( b -carotene) Non vitaminici: Carotenoidi Polifenoli ESOGENI

37 Meccanismo dazione degli antiossidanti Antiossidanti preventivi Bloccano la formazione dei radicali Antiossidanti scavenger Bloccano la reazione di inizio Bloccano la reazione di propagazione Riparano il danno e ricostituiscono le membrane Antiossidanti di riparo e de novo Inquinanti, fumo, radiazioni, metalli pesanti, farmaci, alcool, ischemia-riperfusione, … Specie Chimiche Reattive Attacco di biomolecole (glicidi, lipidi, proteine, ecc) Reazioni radicaliche a catena Danno ossidativo Invecchiamento, malattie

38 ANTIOSSIDANTI PREVENTIVI Prevengono la formazione dei radicali liberi

39 ANTIOSSIDANTI SCAVENGER Riducono la concentrazione di radicali liberi rimuovendoli dal mezzo in cui si trovano Natura idrofila: albumina, acido urico, vitamina C Natura lipofila: carotenoidi, vitamina E, coenzima Q

40 AGENTI DI RIPARO Enzimi che intervengono dopo il danno effettuato dai radicali liberi Idrolasi, transferasi, polimerasi AGENTI DI ADATTAMENTO Sostanze o tecniche attraverso le quali è possibile potenziare il sistema antiossidante fisiologico di un organismo esercizio fisico, regime alimentare corretto ed equilibrato

41 ANTIOSSIDANTISOLUBILITARDA M/FDOVE VitaminaA Vitamina C Vitamina E Licopene Bioflavonoidi GTE (green tea extract) Sali di Mg,Zn Se, Cr Grassi poliinsaturi Acidi grassi (Omega 6) Acidi grassi (Omega 3) liposolubile idrosolubile liposolubile Idrosolubile 1000/800 60/60mg 10/8 mg 1.7/1.3 mg 5 gr 5-6 gr Frutta gialla, arancione o verde scura Frutta, ortaggi a gemma Fegato, uova Pomodoro Cereali, carne, latte Te verde Olio doliva Semi vegetali Pesce

42 ANTIOSSIDANTI ENDOGENI ENZIMATICI, CELLULARI SUPEROSSIDO DISMUTASI (SOD) Principale antiossidante cellulare, mantiene bassa la concentrazione di anione superossido (O 2 - ) Converte lanione superossido in perossido didrogeno Agisce in collaborazione con la catalasi e la glutatione perossidasi

43 La superossido dismutasi (SOD)

44 La SOD catalizza la reazione di dismutazione dellanione superossido: 2 O H + H 2 O 2 + O 2 Se ne conoscono varie forme isoenzimatiche. Nei mitocondri lisoenzima utilizza come cofattore il manganese (MnSOD). Altri isoenzimi, di cui alcuni anche a localizzazione nucleare hanno come cofattori rame o zinco (Cu/ZnSOD). Esiste anche un isoenzima Cu/ZnSOD extracellulare secreto (EC-SOD) La catalasi (appartiene alla classe delle ossido-reduttasi), localizzata nei perossisomi, inattiva lH 2 O 2 catalizzando la reazione: 2H 2 O 2 O 2 + 2H 2 O contiene un gruppo eme

45 CATALASI (CAT) 2 H 2 O 2 2 H 2 O + O 2 Eme-proteina presente nei perossisomi e nel citosol degli RBC Agisce con la SOD per la rapida detossificazione dellanione superossido (O 2 - ) ANTIOSSIDANTI ENDOGENI ENZIMATICI, CELLULARI

46 PEROSSIDASI (Px) Diverse forme, diverse localizzazioni, diversi substrati Difesa cellulare primaria contro i perossidi (R-OOH, H 2 O 2 ) Convertono i perossidi in H 2 O in presenza di riducenti R-OOH + AH 2 R-OH + A + H 2 O

47 La glutatione perossidasi

48 GLUTATIONE PEROSSIDASI (GSH-Px) 2 H 2 O 2 2 H 2 O + O 2 2 GSH GSSG ROOHROH + H 2 O GLUTATIONE REDUTTASI NADPH 2 NADP + ANTIOSSIDANTI ENDOGENI ENZIMATICI, CELLULARI Richiede selenio (cofattore) e glutatione (riducente)

49 Tripeptide (Glu-Cys-Gly) endogeno idrofilo a basso PM Cofattore della glutatione-perossidasi (GPx) Consente alla GPx di svolgere il suo ruolo antiossidante GLUTATIONE (GSH)

50 Azione disintossicante Attività immunitaria Attività protettiva nei riguardi del SNC E presente in alimenti quali: cocomero, avocado, asparagi, pompelmo, patate, fragole, pomodori, arance, spinaci.

51 Ciclo del glutatione 2 NADP + 2 NADPH + H + 2 GSH GS – SG2 H 2 O H2O2H2O2 GS – SG TRASLOCASI ESCREZIONE Pr – SHPr – SG + GSH H 2 O + ½ O 2 O 2 GSH–RGPx SOD CAT Agenti esogeni/metabolismo SOD: superossidodismutasi CAT: catalasi GPx: glutatione perossidasi GSH-R: glutatione reduttasi

52 La vitamina C e la vitamina E agiscono in maniera coordinata e sinergica: la vitamina C rigenera l -tocoferolo trasformandosi in radicale ascorbile, e viene riconvertita ad acido ascorbico da una reduttasi NADPH-dipendente. L -tocoferolo protegge le membrane dal danno ossidativo in quanto blocca le reazioni a catena caratteristiche del processo di perossidazione lipidica delle membrane biologiche. Le principali molecole non enzimatiche che contribuiscono allequilibrio redox cellulare sono: la vitamina C (o acido ascorbico), la vitamina E (o -tocoferolo), vitamina A (o -carotene), lurato, il piruvato, e infine il GSH

53 ANTIOSSIDANTI ENDOGENI NON ENZIMATICI PROTEINE -SH: Agiscono come antiossidanti plasmatici. Acquistano un e - generando un radicale sulfidrilico (-S ) più stabile. PROTEINE LEGANTI Cu-Fe: Proteine di trasposto: transferrina (2Fe +++ ) e ceruloplasmina (Cu ++ ) Proteine di deposito: ferritina (FeOOH)

54 ANTIOSSIDANTI ENDOGENI NON ENZIMATICI BILIRUBINA: Prodotto di degradazione delleme Blocca i radicali perossilici a livello plasmatico ACIDO URICO: Prodotto finale del catabolismo delle purine (adenina e guanina) Chela i metalli e riduce lozono (antiossidante del tratto respiratorio)

55 ACIDO URICO Sostanza a basso peso molecolare, idrofila Potente scavenger contro vari ossidanti (HO,O 2 *, O 3, HClO) Chelante nei confronti di metalli di transizione (Fe, Cu) Previene lossidazione Fe-dipendente dellascorbato

56 ANTIOSSIDANTI ESOGENI VITAMINICI ACIDO ASCORBICO (Vitamina C) Principale antiossidante extracellulare idrosolubile Può bloccare O 2 -, HO, H 2 O 2, 1 O 2 Riducendo il radicale tocoferile rigenera la vitamina E Il radicale ascorbile è rigenerato dalla NADPH deidroascorbato reduttasi, mentre il deidroascorbico dallascorbico reduttasi-GSH. Vitamina C

57 VITAMINA E ANTIOSSIDANTI ESOGENI VITAMINICI

58 Attività antiossidante vitamina E

59 VITAMINA E Sostanza liposolubile. Principale radical-scavenger delle membrane e delle lipoproteine. Agisce bloccando i radicali perossilici formatisi durante la perossidazione lipidica. Può essere rigenerata dallacido ascorbico e dal GSH. ANTIOSSIDANTI ESOGENI VITAMINICI

60 ATTIVITA ANTIOSSIDANTE Molecola liposolubile associata alle membrane biologiche e alle lipoproteine protegge i grassi poliinsaturi dalla perossidazione ATTIVITA NON ANTIOSSIDANTE A carico di RRR- tocoferil succinato potente agente antitumorale VITAMINA E

61 INIBISCE LA PROLIFERAZIONE DI CELLULE MALIGNE CAUSA APOPTOSI È ANTI-ANGIOGENICA INIBISCE VEGF (fattore di crescita vascolare) Vit. E VITAMINA E e neoplasie

62 CAROTENOIDI Gruppo di pigmenti rossi, arancio e giallo presenti soprattutto nella frutta e vegetali. Sostanze liposolubili. Alcuni hanno attività vitaminica ( -carotene). Presenti nelle membrane cellulari e veicolati dalle lipoproteine. Interrompono le reazioni a catena dei radicali perossili (R-OO) Bloccano i radicali tra cui anche l 1 O 2 (ossigeno singoletto) tramite due meccanismi: trasferimento del e - addizione del radicale alla molecola ANTIOSSIDANTI ESOGENI VITAMINICI

63 Antiossidante naturale della famiglia dei carotenoidi, presente in elevate concentrazioni nel pomodoro maturo e in misura minore nel cocomero, albicocca, uva e papaia Chimicamente costituito da carbonio e idrogeno ed in natura è rinvenibile nella struttura trans Tempo di emivita 2-3 giorni, maggior metabolita 5,6- diidrossi-5,6diidrolicopene LICOPENE

64 Sembra avere un ruolo importante nella prevenzione di alcune malattie degenerative quali il cancro e le malattie vascolari, che sembrano in parte dipendere da fenomeni ossidativi Il meccanismo di azione alla base dellattività antitumorale del licopene è ancora sconosciuto

65 LICOPENE In pazienti con tumore della prostata la supplementazione con licopene per sole 3 settimane ha determinato una riduzione dei valori sierici di PSA (un marker usato comunemente per monitorare landamento della malattia), suggerendo un effetto antiproliferativo specifico sulle cellule neoplastiche prostatiche

66 POLIFENOLI Ampia classe di composti derivati dal metabolismo secondario delle piante Chimicamente sono derivati ciclici del benzene sostituiti con gruppi idrossilici Comprendono molecole sia semplici come gli acidi fenolici oppure altamente polimerizzate come i tannini Scavenger nei confronti dei radicali HO e O2 ANTIOSSIDANTI ESOGENI NON VITAMINICI

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68 bloccare i radicali liberi legare i metalli di transizione inibire lossidazione delle LDL rigenerare il radicale tocoferile Struttura dei flavonoidi Struttura degli acidi fenolici

69 Sostanza a basso peso molecolare, relativamente idrofila Scavenger di vari ossidanti (HO, O 2 *, HClO) Chelante nei confronti dei metalli di transizione (Fe, Cu) Consente la rigenerazione delle vitamine C ed E Prodotto nellorganismo, è coinvolto nel complesso della piruvato deidrogenasi, funzionando da accettore di elettroni, grazie al suo ponte disolfuro, reattivo Forma ridotta (attiva)Forma ossidata ACIDO LIPOICO

70 Ac. LIPOICO (25-100µM) induce ATTIVITA antiossidanti: Catalasi (+55%) Superossido dismutasi Glutatione reduttasi Glutatione perossidasi Glutatione transferasi Effetto dose dipendente Ac. LIPOICO (25-100µM) riduce ACCUMULO ROS (-55%)

71 DIMOSTRAZIONE IN VITRO DELL EFFETTO PROTETTIVO DELLAC.LIPOICO IN Saccaromycetes cerevisiae Perossido di Idrogeno (H 2 O 2 ) 4-5mM Ossidante (H 2 O 2 ) + Acido Lipoico mM Riduce le possibilità di sopravvivenza della cellula (Saccaromycetes cerevisiae) Riduce il n delle generazioni successive Aumenta il n delle generazioni successive Aumenta la possibilità di sopravvivenza della cellula

72 Coenzima Q 10 Sostanza lipofila a basso peso molecolare Scavenger nei confronti dei radicali perossilici (ROO ) Consente la rigenerazione dei tocoferoli

73 Ruolo del Coenzima Q e della vitamina E nellinibizione della perossidazione lipidica

74 ZINCO Componente essenziale di numerosi enzimi, in cui svolge un ruolo strutturale, di regolazione e catalitico: lamminoacil- RNA-sintetasi, la DNA e lRNA polimerasi, la fosfatasi alcalina, la lattico deidrogenasi, la superossido dismutasi e le carbossipeptidasi A e B Attività antiossidante, prevenendo la perossidazione lipidica e riducendo la formazione dei radicali liberi

75 MANGANESE E un cofattore dellattività di numerosi enzimi (arginasi, piruvato carbossilasi, superossido dismutasi) SELENIO Componente dellenzima glutatione perossidasi, che impedisce lossidazione dellemoglobina e quindi lemolisi degli eritrociti. Agisce in sinergismo con la vitamina E Azione antiforfora e antimicotica

76 In laboratorio, per valutare lo stato redox, è possibile dosare: Alcuni enzimi antiossidanti (SOD, GPx, glutatione reduttasi, catalasi) Vitamine Potere antiossidante totale del siero Prodotti di lipoperossidazione (malonildialideide MDA, sostanze reattive allacido tiobarbiturico TBARS) Metaboliti reattivi dellossigeno (ROMs)

77 Valutazione dello stress ossidativo ed idroperossidi Gli idroperossidi sono marker ed amplificatori delle lesioni da STRESS OSSIDATIVO Aumentata produzione di ROS (O 2., HO., H 2 O 2,…) Compromissione della barriera antiossidante (vit. C, vit. E,…) Perossidazione di biomolecole con produzione di idroperossidi R-OOH (una classe di ROM) IDROPEROSSIDI (MARKER ED AMPLIFICATORI DEL DANNO) NEI LIQUIDI EXTRACELLULARI INVECCHIAMENTO E PATOLOGIE CORRELATE CON LO STRESS OSSIDATIVO (ictus, infarto, diabete, demenza, m. di Parkinson, cancro, …)

78 STRESS OSSIDATIVO : valutare per riequilibrare VALUTAZIONE GLOBALE DELLO STRESS OSSIDATIVO Valutare lattacco Status pro-ossidante Valutare la difesa Status antiossidante PREVENZIONE E MONITORAGGIO DELLE MALATTIE CORRELATE CON LO STRESS OSSIDATIVO d-ROMs test, MDA OXY-Adsorbent test, BAP test, -SHp test… Valutazione dello stress ossidativo

79 TEST DI LABORATORIO PER LA VALUTAZIONE DELLO STATUS PRO-OSSIDANTE d-ROMs test - Test spettrofotometrico che consente di determinare, in un campione biologico, la concentrazione degli idroperossidi (ROOH) su diversi substrati biochimici - Gli analiti misurati nel test sono metaboliti reattivi dellossigeno (reactive oxygen metabolites, ROM)

80 Gli idroperossidi presenti in un campione biologico, dopo aver reagito con un apposito cromogeno sviluppano un derivato colorato (dal rosa al rosso) rilevabile e quantificabile per via spettrofotometrica. La concentrazione degli idroperossidi, direttamente proporzionale allintensità del colore rilevato, viene espressa in unità di U CARR (Carratelli) 1 U CARR equivale a 0.08 mg H 2 O 2 /dL

81 Reazione di Fenton : un metallo di transizione in forma ionica (Fe o Cu) catalizza la scissione di un idroperossido (ROOH), generando nuove specie radicaliche (idroperossili (ROO*) o alcossili (RO*), a seconda che lo ione catalizzante si ossidi (Fe 2+ Fe 3+ o Cu + Cu 2+ ) o si riduca. Nel test gli idroperossidi, nelle condizioni previste dalla reazione di Fenton, generano in vitro radicali idroperossilici ed alcossilici. 1a) R-OOH + Fe 2+ R-O* + Fe 3+ + OH - 1b) R-O* + A-NH 2 R-O - + [A-NH 2 *] + 2a) R-OOH + Fe 3+ R-OO* + Fe 2+ (Cu + ) + H + 2b) R-OO* + A-NH 2 R-OO - + [A-NH 2 *] + Principio del d-ROMs test

82 Procedura sperimentale: Unaliquota di siero viene diluita in una soluzione tampone (acetato) pH 4.8; il ferro ionico legato alle sieroproteine, si rende disponibile in forma libera catalizzando la scissione degli idroperossidi in radicali idroperossilici ed alcossilici. Alla soluzione viene aggiunto un cromogeno (N,N-dietil- parafenilendiammina) che ha la proprietà di cambiare colore (dal rosa al rosso) quando viene ossidato.

83 E necessario preparare lo standard (o calibratore), fornito all'interno di un kit commerciale sottoforma di siero liofilo a titolo noto (U CARR). Procedura cinetica standard: si preparano 3 soluzioni (bianco, campione (preferibilmente siero fresco) e calibratore) incubazione delle soluzioni per 1 min a 37°C; lettura fotometrica (abs a 505 o 546 nm) a 0, 1, 2 e 3 min. Ai valori di assorbanza ottenuti per il campione e per il calibratore si sottrae, quindi, il valore di assorbanza del bianco.

84 Procedura endpoint: si preparano 3 soluzioni (bianco, campione (siero o plasma eparinato) e calibratore). incubazione delle soluzioni a 37°C per 75 min; lettura fotometrica (abs a 505 o 546 nm). Ai valori di assorbanza ottenuti per il campione e per il calibratore si sottrae, quindi, il valore di assorbanza del bianco.

85 Valori di riferimento nelluomo: U CARR cioè mg/dL di H 2 O 2 Un aumento delle U CARR indica una gravità crescente di stress ossidativo

86 Unico test disponibile per la valutazione complessiva della componente lesiva, pro-ossidante, dello stress ossidativo che unisce a questa specificità una standardizzazione utile nella pratica clinica routinaria e la possibilità di integrarsi con altri test sullo stress ossidativo. · preciso e affidabile; · richiede una strumentazione relativamente semplice (un fotometro termostatato ed una centrifuga); · possiede tutti i vantaggi di un mono test (rilevazione fotometrica diretta di ununica miscela di reazione, contenente il campione e il reattivo cromogeno); · richiede una minima manualità, con notevole riduzione delle possibilità di errore.

87 nella perossidazione lipidica si formano prodotti di degradazione; essi sono utilizzati per misurare il grado di perossidazione; si misura la formazione della malonildialdeide (dialdeide malonica, MDA)

88 MDA (malonilaldeide o malonildialdeide, CHO-CH 2 - CHO): prodotto finale delle reazioni a catena innescate nelle membrane cellulari dallattacco ossidativo, da parte di alcuni ROS (radicale idrossile), degli acidi grassi poliinsaturi (acido arachidonico, costituente dei fosfolipidi di membrana). MDA test MDA: indicatore piuttosto tardivo di stress ossidativo. Svantaggi: non è sempre in grado di poter svelare precocemente uno stato ossidativo alterato.

89 La MDA è scarsamente specifica; è un prodotto di decomposizione ossidativa di amminoacidi, di carboidrati e di prostaglandine; E un prodotto di ossidazione dellacido ascorbico, risulta inutilizzabile il suo dosaggio ai fini di un eventuale monitoraggio terapeutico in corso di trattamenti antiossidanti.

90 TOTAL ANTIOXIDANT STATUS Valutazione dellefficacia della barriera ossidante, che si oppone allazione lesiva dei radicali PRINCIPIO DEL METODO Rilevazione della capacità del siero in esame di opporsi ed inibire la cascata di reazioni che portano alla formazione dei radicali liberi

91 Nel plasma è identificabile una barriera antiossidante, alla cui costituzione contribuiscono sostanze esogene ed endogene. Questi componenti, donando elettroni, bloccano la potenziale lesività dei radicali liberi. Qualsiasi insulto a carico di tale barriera consente ai radicali liberi di attaccare e danneggiare le strutture cellulari. Rappresentazione schematica della barriera antiossidante plasmatica

92 Lefficienza della barriera antiossidante plasmatica può essere valutata saggiandone la capacità di ridurre un determinato substrato, ossia di donare elettroni ad un agente ossidante (avido di elettroni), che funge da sensore. Il potere antiossidante è, in termini rigorosamente chimici, unattività riducente, cioè elettron-donatrice.

93 BAP-TEST BAP test (biological antioxidant potential, determinazione del potenziale biologico antiossidante): test fotometrico. Si basa sulla capacità che ha una soluzione di ioni ferrici (Fe 3+ ) complessati ad un cromogeno di colorarsi, quando gli ioni Fe 3+ sono ridotti a ioni ferrosi (Fe 2+ ), come accade se si aggiunge ad essa un adeguato sistema riducente, ossia antiossidante, quale il plasma.

94 Il campione di plasma (ottenuto dal sangue intero mediante centrifugazione) viene aggiunto ad una soluzione colorata (FeCl 3, cloruro ferrico + cromogeno, un tiocianato). Dopo unincubazione (5 min) la soluzione si decolorerà e la decolorazione sarà tanto più marcata quanto più i componenti del plasma ridurranno gli ioni ferrici presenti, responsabili della formazione del complesso cromatico. Valutando per via fotometrica lentità della decolorazione, sarà possibile risalire alla quantità di ioni ferrici ridotti e alla capacità riducente, ossia al potere antiossidante del plasma testato.

95 I risultati del BAP test sono espressi in moli di ferro ridotto per L di plasma esaminato. Test affidabile, preciso, ripetibile, con un coefficiente di variazione (CV) inter-serie ed intra-serie assolutamente accettabile, anche con metodica manuale (<5%). Interferenza segnalata è legata alla concentrazione lipidica: un plasma iperlipemico può indurre una sottostima dei valori. Il test va obbligatoriamente eseguito a digiuno o dopo un congruo intervallo di tempo rispetto ad un pasto copioso o allassunzione massiva di antiossidanti per os.

96 Il BAP Test viene eseguito su siero o plasma eparinato fresco, con lettura fotometrica a 505 nm a 37°C. Data lesigua quantità di campione necessaria (10 µl per lanalisi manuale) il prelievo può essere venoso o capillare.

97 INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI Il range stimato del BAP test negli individui normali è moli/L. Una riduzione dei valori del test al di sotto dellintervallo indicato è direttamente correlato con una ridotta efficienza della barriera antiossidante plasmatica.

98 Test fotometrico che valuta la capacità del plasma di opporsi allazione ossidante di una soluzione di acido ipocloroso, HClO (ossidante). Il campione di plasma viene sottoposto allazione di HClO a titolo noto, in evidente eccesso rispetto alle capacità di essere adsorbito dalla barriera antiossidante da valutare. Dopo un intervallo di tempo stabilito, lHClO residuo reagisce con la N,N-dietilparafenilendiammina che, ossidandosi a spese dellacido, si trasforma in un derivato colorato in rosa. OXY-Adsorbent test

99 La concentrazione del complesso colorato sarà direttamente proporzionale alla concentrazione di HClO rimasta in eccesso ed inversamente proporzionale alla capacità antiossidante del plasma analizzato; più bassa è la concentrazione residua dellacido e più elevata è la capacità antiossidante del campione di plasma esaminato, e viceversa.

100 Il valore di riferimento del test è al di sopra di 350 moli/mL di HClO. In condizioni normali, 1 mL di plasma umano è in grado di adsorbire e, quindi, neutralizzare, almeno 350 moli di HClO. Valori inferiori a questa soglia indicano una riduzione dello spessore della barriera antiossidante e correlano direttamente con la gravità del danno da questa subito.

101 Il test viene eseguito su siero o plasma eparinato fresco con lettura fotometrica a 505 o 546 nm a TA. Il prelievo può essere venoso o capillare. Test affidabile, preciso, ripetibile, con un coefficiente di variazione (CV) inter-serie ed intra-serie assolutamente accettabile, anche con metodica manuale (<5%). Il test va eseguito a digiuno o dopo un congruo intervallo di tempo rispetto ad un pasto copioso o allassunzione massiva di antiossidanti per os.

102 I tioli rappresentano una componente qualitativamente significativa della barriera antiossidante plasmatica Si basa sulla capacità dei gruppi -SH di sviluppare un complesso colorato determinabile fotometricamente (405 nm) quando reagiscono con lacido 5,5ditiobis-2-nitrobenzoico (DTNB). Il titolo di tioli è direttamente proporzionale allintensità del colore rilevato. Grado accettabile di imprecisione analitica. Infatti, il CV intra-serie su 20 aliquote di siero fresco è stato pari a 1.7%, quello inter-serie su 20 aliquote di siero congelato 3.3%. SHp test

103 Il range negli individui normali è moli/L. Una riduzione dei valori del test al di sotto di questo intervallo si correla direttamente con una ridotta efficienza della barriera antiossidante tiolica.

104 Sistema analitico integrato che consente di eseguire qualsiasi tipo di analisi chimica basata sul principio della fotometria Sistema FREE (Diacron) Predisposto per lesecuzione di test per la valutazione globale dello stress ossidativo (d-ROMs test, lOXY-adsorbent test, il BAP test e l-SHp test).

105 Sistema analitico integrato costituito da un fotometro con centrifuga incorporata progettato per consentire lesecuzione del d-ROMs test su sangue intero, ottenuto mediante prelievo di sangue capillare. Viene fornito insieme al kit del d-ROMS test che ne costituisce parte integrante. SISTEMA FRAS (Diacron)

106 Una goccia di sangue, prelevata per digitopuntura, è raccolta in un piccolo capillare e, insieme a questo tubicino, immersa in una provetta contenente una soluzione tampone lievemente acida. Il campione, dopo una delicata agitazione, è trasferito in cuvetta, ove viene aggiunta una goccia di reattivo cromogeno. La soluzione è sottoposta a centrifugazione e alla lettura fotometrica. Il fotometro trasformerà lintensità del colore (proporzionale alla quantità di radicali e, quindi, di idroperossidi presenti nel campione) in unità di concentrazione (U CARR), a cui possono corrispondere determinati livelli di stress ossidativo.

107 dROM test: errori da evitare

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