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LLC Bologna - 2009 DNA Fingerprinting. Prerequisiti Per affrontare questa attività bisogna conoscere: La struttura del DNA I plasmidi Gli enzimi di restrizione.

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1 LLC Bologna DNA Fingerprinting

2 Prerequisiti Per affrontare questa attività bisogna conoscere: La struttura del DNA I plasmidi Gli enzimi di restrizione

3 Obiettivo Confrontare le dimensioni dei frammenti del DNA generati dalla digestione enzimatica, sfruttando le caratteristiche di unicità proprie del genoma degli organismi.

4 Introduzione Per stimolare l’interesse viene riprodotta un’indagine poliziesca, dove il materiale biologico rinvenuto sul luogo del delitto viene analizzato e comparato con quello appartenente ad alcuni individui sospetti, fra i quali lo studente dovrà individuare il profilo genetico corrispondente al colpevole. In questa esperienza, condotta a scopo didattico, si utilizza DNA plasmidico, quale fonte di materiale da analizzare in quantità tale da consentire una visualizzazione diretta, mentre nella realtà è necessaria una preventiva amplificazione del DNA per ottenere risultati osservabili e significativi (PCR)

5 La prova è eseguita su piccola scala per motivi tecnici, ma i principi richiamati come pure i passaggi (digestione con enzimi di restrizione, elettroforesi e colorazione delle bande di DNA) sono gli stessi richiesti dalla conduzione dell’esperimento a livello professionale. La produzione dei frammenti di DNA avviene durante il trattamento con gli enzimi di restrizione, che sono in grado di tagliare l’acido nucleico in prossimità di sequenze nucleotidiche specifiche.

6 La tecnica elettroforetica è poi fondamentale per separare i frammenti neoformati. Nelle celle elettroforetiche si genera un campo elettrico nel quale il DNA, carico negativamente, migra verso il polo positivo. La matrice (nel nostro caso agarosio), nella quale si muove il DNA, è quella che materialmente consente la separazione dei frammenti generati dalla digestione: infatti la concentrazione dell’agarosio(0,8%) conferisce al gel una porosità idonea ad ottenere la risoluzione desiderata (adeguata separazione delle bande). Il gel dopo l’elettroforesi viene colorato per osservare i frammenti evidenziati in forma di bande.

7 DNA utilizzato in questo esperimento

8 Tecnica del DNA fingerprinting Digestione Elettroforesi Colorazione

9 Digestione

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12

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14 Preparazione Gel di agarosio.

15 Elettroforesi LLC Bologna

16 Elettroforesi

17 Caricamento

18 Corsa elettroforetica

19 Colorazione

20

21 C Colorazione

22 C Chi è il colpevole ?

23 C

24 Chi è il colpevole? C 1 2 3

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26 MARCATOREProfilo D8S D21S D7S CSF1PO12-13 D3S TH D13S D16S vWA17-17 TPOX7-8 D18S D5S FGA PentaE7-13 PentaD10-12 SexF Esempio di Profilo Genetico

27 Fonti di materiale biologico Sangue Liquido Seminale Saliva Urina Capelli Denti Ossa Tessuti Sudore Solo una piccola quantità di sangue è necessaria per ottenere un profilo genetico.

28 DNA: presente in ogni materiale cellulare che contiene un nucleo

29 Analisi forense del DNA Raccolta del campione (scena del crimine/campioni di confronto) Valutazione del tipo di traccia diagnosi generica Estrazione e purificazione del DNA Quantificazione del DNA Amplificazione e corsa su elettroforesi capillare Interpretazione del profilo genetico

30 Polimorfismi STR

31 Laser + Elettroforesi capillare

32 Laser + Elettroforesi capillare

33 Laser + Elettroforesi capillare

34 Laser + Elettroforesi capillare

35 Le bande, la cui dimensione dipende dal numero di ripetizioni, vengono trasformate in picchi. Elettroforesi capillare

36 Regioni non codificanti del DNA sono poco presenti nel DNA dei procarioti.Tra gli eucarioti, con l’incremento della complessità dell’individuo aumenta anche la quantità di DNA non codificante. Regioni polimorfiche del DNA non codificanti

37 Il confronto tra DNA diversi avviene studiando alcune zone ad alta variabilità e quindi caratteristiche, nel loro insieme, di un singolo individuo. REGIONI POLIMORFICHE del DNA costituiscono l’impronta digitale molecolare di ogni persona (Fingerprint). Le regioni polimorfiche del DNA

38 Tipi di Polimorfismo per fingerprinting Minisatellite Variable Number of Tandem Repeat VNTR Microsatellite Short Tandem Repeat STR Subtelomeriche Ripetizione: 8-80 bp Lunghezza totale Kb Disperse in tutto il genoma Ripetizione: 2-7 bp = AATG

39 AATG 4 ripetizioni Tipizzazione individui

40 Gli amplificati hanno le stesse dimensioni 4

41 AATG 4 ripetizioni 3 ripetizioni Tipizzazione individui

42 Gli amplificati hanno dimensioni diverse 3 4

43 Locus TPOX Locus CSF1PO Locus TH01 (4 ; 5) (4 ; 5) (8 ; 3) (8 ; 3) (4 ; 4) L’individuo in esame avrà il seguente profilo genotipico: Locus TPOX (4 ; 5) Locus TPOX (4 ; 5) Locus CSF1PO (8 ; 3) Locus TH01 (4 ; 4) Locus TH01 (4 ; 4) R.I.S.

44 Marcatori STR utilizzati in ambito forense

45 MARCATOREProfilo D8S D21S D7S CSF1PO12-13 D3S TH D13S D16S vWA17-17 TPOX7-8 D18S D5S FGA PentaE7-13 PentaD10-12 SexF Esempio di Profilo Genetico

46 Casi criminali: indagato/vittima-traccia Test di paternità:paternità controversa Immigrazione: relazioni familiari Mass disaster Soggetti scomparsi Identificazione Identificazioni storiche Utilizzi DNA fingerprinting

47 Il DNA incastra due volte il romeno accusato dello stupro di San Valentino Nuovi esami confermano: Gavrila fu l'autore di un'analoga violenza al Pigneto nel luglio 2008 Corriere della sera 6 aprile 2009 Casi criminali: indagato/vittima-traccia Usa, salvo grazie al test del Dna Repubblica — 25 agosto 2001 pagina 17 sezione: POLITICA ESTERA WASHINGTON - La prova del Dna ha salvato dalla condanna a morte un americano in carcere da diciassette anni. Nel 1982 Charles Fain venne condannato alla sedia elettrica per aver stuprato e ucciso una bambina di nove anni. Al processo, il medico legale, sostenne che i peli ritrovati sul corpo della bambina erano di Fain. Oggi la prova del Dna ha dimostrato che si sbagliava. «Ringrazio Dio per il Dna» ha detto l' ex condannato appena liberato. «Sapevo», ha aggiunto, «che prima o poi tutta questa storia sarebbe finita bene».

48 Accertamenti di paternità

49 PRESUNTO PADRE FIGLIO MADRE Esempio di test di paternità

50 Utilizzi Dna fingerprinting Captured December 13, 2003 Questo uomo è realmente Sadaam Hussein? Uday and Qusay Hussein Killed July 22, 2003 Butler, J.M. (2005) Forensic DNA Typing, 2 nd Edition, Box 23.1, p. 534

51 Il mistero di Anastasia Romanov e di Anna Anderson Identificazioni storiche


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