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MICROSCOPIO ELETTRONICO A TRASMISSIONE (TEM). Coltura batterica al TEM.

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Presentazione sul tema: "MICROSCOPIO ELETTRONICO A TRASMISSIONE (TEM). Coltura batterica al TEM."— Transcript della presentazione:

1 MICROSCOPIO ELETTRONICO A TRASMISSIONE (TEM)

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3 Coltura batterica al TEM

4 Schermo fluorescente Binoculare Lente proiettore Campione Apertura Lente obiettivo condensatore Fonte di elettroni

5 Fascio di elettroni primari Elettroni secondari SEMSEM TEMTEM Scattering anelastico Scattering elastico Elettroni trasmessi

6 TEMTEM e - con scattering anelastico e - con scattering elastico

7 TEM convenzionale Scattering elastico Scattering anelastico

8 Elettroni incidenti

9 Preparazione dei campioni per TEM FISSAZIONE a)FISSAZIONE CHIMICA con impiego di fissativi come GLUTARALDEIDE e PARAFORMALDEIDE (per stabilizzare le proteine) e post-fissativi come OSMIO (1%) per la fissazione di lipidi. I fissativi sono usati a concentrazioni 3-5% e sciolti in tamponi b) CRIOFISSAZIONE, congelamento rapido per immersione del campione in azoto liquido (-190°C), in genere si usano anche composti crioprotettivi per evitare danni del campione N.B: osmio e glutaraldeide vanno maneggiati con dispositivi di sicurezza secondo il D.L. 626

10 DISIDRATAZIONE Procedimento che porta alla totale rimozione dell’acqua nel campione e alla sostituzione con un solvente (etanolo) Passaggi in etanolo 25%, 50%, 75%, 90%, 95%, 100%

11 INCLUSIONE IN RESINA Le resine sono sostanze che polimerizzano in opportune condizioni e una volta che sono entrate nel campione induriscono il campione e lo rendono sezionabile. Le resine usate per la microscopia convenzionale sono EPOSSIDICHE (costituite da miscele di aldeidi) e polimerizzano a 60° Il campione viene immerso in un solvente intermedio che si miscela sia con L’etanolo sia con la resina (OSSIDO DI PROPILENE) Passaggi: ossido di propilene-etanolo, ossido di propilene assoluto, Ossido di propilene:resine (3:1) per 1h, 1:1per 1h, 1:3 per 2h Resina assoluta per 2h Polimerizzazione in stufa a 60° per 3 giorni

12 SEZIONAMENTO I campioni induriti vengono tagliati mediante ULTRAMICROTOMO in sezioni ultrasottili (40-80 nm) e depositati su retini (anelli con griglie di Oro, nichel, rame retino

13 CONTRASTAMENTO Con metalli pesanti come uranio e piombo si aumenta lo scattering elastico di membrane e inclusi nelle cellule I retini su cui sono state deposte le sezioni vengono immerse prima in acetato di uranile, lavati e successivamente in citrato di piombo

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15 COLORAZIONE NEGATIVA


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