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IMMUNOFENOTIPO Citometria a flusso Identificazione popolazione cellulare ago-aspirato midollare, linfonodale, sangue periferico liquor, versamenti Caratterizzazione.

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Presentazione sul tema: "IMMUNOFENOTIPO Citometria a flusso Identificazione popolazione cellulare ago-aspirato midollare, linfonodale, sangue periferico liquor, versamenti Caratterizzazione."— Transcript della presentazione:

1 IMMUNOFENOTIPO Citometria a flusso Identificazione popolazione cellulare ago-aspirato midollare, linfonodale, sangue periferico liquor, versamenti Caratterizzazione popolazione cellulare linea di appartenenza stadio di differenziazione asincronia maturativa presenza di aberrazioni antigeniche Quantificazione Intensita’ di espressione di un determinato Ag sulla cellula (MIF e ABC) L’esecuzione di una corretta analisi citofluorimetrica su popolazioni neoplastiche NON PUO’ PRESCINDERE DALLA CONOSCENZA DELLE CARATTERISTICHE MORFOLOGICHE della popolazione da esaminare e dal sospetto diagnostico

2 Citometria Vs Citometria a flusso Citometria e’ possibile localizzare un antigene scarsa capacita’ di analizzare piu’ parametri scarsa capacita’ di valutare i diversi sottotipi cellulari valutazione morfologica quantitativa e qualitativa Citometria a flusso e’ possibile analizzare moltissime cellule in un tempo breve capacita’ di analizzare piu’ parametri approccio multiparametrico quantitativo e qualitativo IMMUNOFENOTIPO

3 ELETTRONICA  cellule in sospensione  passano in singola fila attraverso  un volume illuminato dove esse  riflettono/rifrattono la luce ed emettono fluorescenza  che viene raccolta, filtrata e  convertita ad un valore digitale  che viene inviato al compiuter OTTICA FLUIDICA Tecnica multiparametrica che misura le caratteristiche fisiche e/o chimiche di cellule in sospensione all’interno di un fluido di trasporto Citofluorimetria: definizione

4 Camera di flusso (componente fluida)

5 Citofluorimetro: principi

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7 SPETTRI DI FLUOROCROMI

8 Analisi citofluorimetrica

9 Perche’ si guarda FSC Vs SSC Dato che FSC “ dimensione cellulare” e SSC “ struttura interna”, la misurazione combinata dei due parametri permette di distinguere diversi tipi cellulari di una popolazione eterogenea di cellule

10 CD45: ANTIGENE PAN LEUCOCITARIO, ovvero ESPRESSO CON CARATTERISTICA INTENSITA’ SU LEUCOCITI MA ESPRESSO IN MODO ANOMALO SU CELLULE BLASTICHE CITOGRAMMA NORMALE ESEMPIO DI CITOGRAMMA NORMALE: IL CD45

11 CD45: citogramma di un midollo normale 1-LYMPH 2-MONO 3-GRAN 4-BLAST 5-ERY Perche’ si guarda CD45 Vs SSC Dato che SSC “ dimensione cellulare” e CD45” pan leucocitario” la misurazione combinata dei due parametri permette di distinguere diversi tipi cellulari di una popolazione eterogenea di cellule

12 SSC CD45 Maturazione mieloide: SIDE SCATTER NormaleAberrante

13 CD45: ANTIGENE PAN LEUCOCITARIO, ovvero ESPRESSO CON CARATTERISTICA INTENSITA’ SU LEUCOCITI MA ESPRESSO IN MODO ANOMALO SU CELLULE BLASTICHE CITOGRAMMA NORMALE ESEMPIO DI CITOGRAMMA PATOLOGICO (LEUCEMIA ACUTA)

14 CITOGRAMMA NORMALE ESEMPIO DI CITOGRAMMA PATOLOGICO (LEUCEMIA ACUTA) CD45: ANTIGENE PAN LEUCOCITARIO, ovvero ESPRESSO CON CARATTERISTICA INTENSITA’ SU LEUCOCITI MA ESPRESSO IN MODO ANOMALO SU CELLULE BLASTICHE

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16 STEM CELL CD117 HLA-DR CD90 CD38 CD34+ Lymphoid progenitor CD19 CD10 CD22 cCD79a TdT CD38 sCD22 CD24 B-progenitor B lymphocite CD19 CD20 CD22 sCD79b FMC-7 CD38 sIgM Ig kappa Ig lambda Cortical thymocyte cCD3 CD1a CD2 CD5 CD7 CD4 CD8 CD38 T lymphocite sCD3 CD7 CD2 CD5 CD4 CD8 TCR a/b TCR g/d CD34+ CD34+/- CD34- CD117 HLA-DR CD90 TdT CD38 CD117 HLA-DR CDw123 AC133 CD33 CD38 Myeloid progenitor CFU-GM CD33 CD13 Myeloblast CD13 CD33 CD15 BFU-E/CFU-E CD36 CD71 Gli-A CFU-MK CD61 CD41 CD42a CD34+ CD34- CD14 CD11b cCD79a MPO

17 MATURAZIONE LINFOIDE B

18 MATURAZIONE LINFOIDE T

19 Schema di differenziazione delle cellule B normali

20 Sangue midollare da donatore sano Vs LAL B Schema di differenziazione delle cellule B normali

21 SUPERFICIE SCHEMA SEMPLIFICATO DELLA DIFFERENZIAZIONE LINFOIDE B Marcatori B-lineage

22 CD4 CD2 CD5 CD2 CD4 CD8 CD3 CD8 CD3 Schema di differenziazione delle cellule T normali Il concetto “EMPTY SPACES

23 SCHEMA SEMPLIFICATO DELLA DIFFERENZIAZIONE LINFOIDE T Marcatori T-lineage SUPERFICIE

24 IMMUNOFENOTIPO Utilizzo di 6-8 colori per la identificazione di antigeni di superficie, citoplasmatici e nucleari; possibilita’ di studiare qualsiasi sospensione cellulare Identificazione dei “leukemia-associated” Phenotypes (LAIP) Firma fenotipica paziente-specifica Utilizzo delle aberrazioni specifiche sia per la diagnosi che per lo studio della Malattia Minima Residua

25 IMMUNOFENOTIPO Permette di IDENTIFICARE,QUANTIFICARE E CARATTERIZZARE gli elementi acquisiti (linea di appartenza, stadio di differenziazione, presenza di aberrazioni, intensita’ di espressione antigenica MIF e ABC) In caso di antigeni specifici l’immunofenotipo può rispondere a domande su diagnosi, prognosi e malattia residua minima Marcatori cellulari: la nomenclatura CD Si considera membro di un Cluster Differentiation un marcatore di superficie che: identifica un particolare tipo cellulare o un certo stadio differenziativo ha una struttura biochimica definita è riconosciuto da un gruppo di MoAb diversi

26 FL2-H Area di calcolo MIF (Mean Fluorescence Intensity) MIF (Mean Fluorescence Intensity) ABC (Antibody Binding Capacity) ABC (Antibody Binding Capacity) MIF La Mean Intensity Fluorescence è un valore fornito dal citofluorimetro e rappresenta il rapporto tra la fluorescenza del campione e quella dell’isotipo; e’ proporzionale ai siti di legame MIF= intensita’ media M2/intensita’ media M1 ABC Antibodies Bound per Cell è un valore che si ottiene confrontando l’espressione di un antigene con una curva di riferimento costruita con rapporti noti tra molecole di antigene/valore di fluorescenza ESPRESSIONE DI UN ANTIGENE

27 Ag aberranti: es. blasti di LAL della linea B con Ag T o mieloidi; blasti di LMA con Ag T o B Espressione Ag asincrona: es. CD19/CD34/TdT/cyt.  in LAL B, CD34/CD56 o CD15 in LAM Espressione Ag “ectopica”: es. blasti di LAL-T a livello midollare, blasti TdT + a livello extra-midollare Diversa entità di espressione Ag: es CD10, CD19, TdT in LAL B Assetti immunofenotipici leucemia-associati Studio citofluorimetrico della MMR COSA si va a cercare?

28 Metodi di analisi della Malattia Minima residua nelle Leucemie Acute Con le tecniche convenzionali di citomorfologia è possibile identificare l'1-5% di cellule leucemiche in una popolazione di cellule normali La sensibilità aumenta in modo significativo (fino a 10-4) quando vengono applicate tecniche immunologiche utilizzando anticorpi diretti contro antigeni di differenziazione delle serie linfoide ed enzimi selettivamente espressi negli stadi più precoci dell'ontogenesi Grazie alla combinazione di tre metodologie (biologia molecolare, cariotipo, FCM) tutti i pazienti possono essere stratificati in più gruppi di rischio appropriato per la ripartizione terapia basata sul rischio

29 Misura della fluorescenza: utilità  Le cellule possono essere identificate grazie alle loro molecole di superficie e relativo specifico marker (CD, “cluster di differenziazione”)  Anticorpi monoclonali per specifici antigeni CD possono essere utilizzati per identificare il tipo di cellula  L’anticorpo monoclonale può essere coniugato con un Fluorocromo (FITC, PE, Tandem ECD, PC5………) e si può eseguire un test di immunofluorescenza diretta

30 STEM CELL CD117 HLA-DR CD90 CD38 CD34+ Lymphoid progenitor CD34+ CD117 HLA-DR CD90 TdT CD38 CD117 HLA-DR CDw123 AC133 CD33 CD38 Myeloid progenitor CFU-GM CD33 CD13 Myeloblast CD13 CD33 CD15 BFU-E/CFU-E CD36 CD71 Gli-A CFU-MK CD61 CD41 CD42a CD34+ CD34- CD14 CD11b MPO

31 Neutrofili MetamielocitiMielocitiPromielocitiMieloblasti CD34 HLA-DR CD117 CD13 CD33 CD11b CD64 CD65 CD54 CD10 CD35 CD13 Modificazioni fenotipiche durante la normale differenziazione neutrofila MPO CD15 CD1 6

32 SCHEMA SEMPLIFICATO DELLA DIFFERENZIAZIONE MIELOIDE la granulopoiesi

33 SCHEMA SEMPLIFICATO DELLA DIFFERENZIAZIONE MIELOIDE la monocitopiesi

34 I II IIIIV Myelo/monoblast CD34 CD117 HLA-DR CD13++ CD33++ Promyelocyte CD117 CD13++ CD33++ CD15 Myelocyte CD13 dim CD15 CD11b* Metamyelocyte Band cell CD13 CD33 dim CD15 CD11b CD16* CD34/CD117/CD45/CD13.33 CD15/CD11b/CD45/CD33 V Neutrophil CD13++ CD33 CD15 CD11b++ CD16++ CD45** CD16/CD13/CD45/CD11b Maturazione mieloide

35 CD16 C D 11 b CD16/CD11b/CD45/CD34 Adherence to Fibrinogen, Chemotaxis… Neutrofilo Maturazione mieloide

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37 STEM CELL CD117 HLA-DR CD90 CD38 CD34+ Lymphoid progenitor CD19 CD10 CD22 cCD79a TdT CD38 sCD22 CD24 B-progenitor B lymphocite CD19 CD20 CD22 sCD79b FMC-7 CD38 sIgM Ig kappa Ig lambda Cortical thymocyte cCD3 CD1a CD2 CD5 CD7 CD4 CD8 CD38 T lymphocite sCD3 CD7 CD2 CD5 CD4 CD8 TCR a/b TCR g/d CD34+ CD34+/- CD34- CD117 HLA-DR CD90 TdT CD38 CD117 HLA-DR CDw123 AC133 CD33 CD38 Myeloid progenitor CFU-GM CD33 CD13 Myeloblast CD13 CD33 CD15 BFU-E/CFU-E CD36 CD71 Gli-A CFU-MK CD61 CD41 CD42a CD34+ CD34- CD14 CD11b cCD79a MPO

38 CD34 CD34 pos/CD45 pos =0.58% Gate Totale CD34 pos/CD45 pos =0.7% Midollo donatore sano Aferesi donatore sano

39 Gate Totale CD34 pos/CD45 pos =0.3% Sangue cordone ombelicale


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