MORTE CELLULARE apoptosi necrosi senescenza autofagia

Presentazione sul tema: "MORTE CELLULARE apoptosi necrosi senescenza autofagia"— Transcript della presentazione:

1 MORTE CELLULARE apoptosi necrosi senescenza autofagia
catastrofe mitotica

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3 NECROSI è una morte passiva, non fisiologica
il danno primario è a livello della membrana plasmatica aumento del volume cellulare a causa della perdita di controllo del flusso ionico (richiamo di H2O) formazione di microvescicole lesioni a carico degli organelli intracellulari alterazioni a livello cromatinico lisi cellulare per dissoluzione della membrana riversamento dei componenti intracellulari nello spazio extracellulare reazione antiinfiammatoria

4 CELLULA NECROTICA

5 APOPTOSI Processo fisiologico di eliminazione delle cellule danneggiate, invecchiate, potenzialmente dannose per l’architettura dell’intero tessuto-organo o cellule non piùutili all’organismo

6 termine adottato negli anni ‘70
struttura e integrità della membrana vengono mantenute gli organelli mantengono la loro funzione alterazioni a carico del mitocondrio modificazioni nucleari caratteristiche modificazioni a livello della membrana plasmatica frammentazione della cellula in “corpi apoptotici”

7 CELLULA APOPTOTICA

8 QUANDO SI ATTIVA IL PROCESSO APOPTOTICO?
quando l’organismo vuole eliminare cellule non desiderate attraverso l’attivazione di una sequenza di eventi coordinati e programmati parte integrante dello sviluppo embrionale e fetale dell’organismo e dell’omeostasi tissutale dell’adulto (evidente nella metamorfosi del girino e nel feto) in cellule infettate da virus può interrompere la replicazione virale usata anche nel sistema immunitario per rimuovere i linfociti che non formano un recettore dell’antigene funzionale viene indotta in cellule soggette a un esteso danno al DNA

9 APOPTOSI distruzione di cellule durante l’embriogenesi
controllo del numero di cellule modellamento di strutture involuzione ormono-dipendente nell’adulto morte cellulare durante neoplasie morte delle cellule immunitarie autoreattive morte delle cellule danneggiate da diversi stimoli

10 STIMOLI APOPTOTICI farmaci radiazioni ionizzanti
mancanza di stimolazione ormonale death receptors

11 DIFETTO DI APOPTOSI ECCESSO DI APOPTOSI cellule tumorali
malattie a base autoimmune infezioni virali ECCESSO DI APOPTOSI sindrome dell’immunodeficienza acquisita malattie neurodegenerative sindromi mielodisplasiche ischemia

12 VIA ESTRINSECA VIA INTRINSECA

13 VIA ESTRINSECA I recettori di morte sono proteine transmembrana in grado di legare citochine pro-apoptotiche, quali FasL, TNFa, TRAIL, e trasmettere il segnale di morte cellulare mediante l’attivazione di pathways specifici Si assemblano sotto forma di trimeri per favorire il riconoscimento del ligando

14 CASPASI Il termine deriva dal fatto che tali enzimi hanno una cisteina © nel loro sito attivo e tagliano le proteine dopo residui di acido aspartico. procaspasi Iniziatrici 8 e 10 estrinseco, 9 intrinseco caspasi Effettrici 3, 6 e 7 Sono responsabili del taglio: della matrice nucleare delle proteine del citoscheletro Questi tagli producono le classiche alterazioni strutturali, sia del nucleo, sia del citoplasma, che si osservano nelle cellule apoptotiche

15 VALUTAZIONE DELL’APOPTOSI
TEST PIU’ UTILIZZATI: valutazione mediante microscopia elettronica

16 VALUTAZIONE DELL’APOPTOSI MEDIANTE MICROSCOPIA ELETTRONICA

17 VALUTAZIONE DELL’APOPTOSI
TEST PIU’ UTILIZZATI: valutazione mediante microscopia elettronica tunel assay

18 TUNEL ASSAY IN PRATICA:
La rottura del DNA durante l’apoptosi dà luogo a frammenti di DNA con rotture del doppio filamento a basso o alto PM; questi frammenti possono essere identificati marcando l’estremità 3’-OH libera per mezzo di un enzima, la TdT che catalizza la polimerizzazione di nucleotidi alle estremità 3’; se si utilizzano dei nucleotidi marcati con fluorescenza questi frammenti di DNA possono essere identificati in microscopia e/o citofluorimetria. IN PRATICA: si fissano le cellule in parafolmaldeide si permeabilizzano con una soluzione contenente Triton si marcano i frammenti di DNA con TdT e nucleotidi fluorescenti si analizzano le cellule in microscopia a fluorescenza o in citofluorimetria

19 VALUTAZIONE DELL’APOPTOSI MEDIANTE TUNEL ASSAY

20 VALUTAZIONE DELL’APOPTOSI
TEST PIU’ UTILIZZATI: valutazione mediante microscopia elettronica tunel assay comet assay

21 COMET ASSAY le cellule trattate vengono risospese in agarosio, depositate su un vetrino e lisate i vetrini vengono posti in una cella elettroforetica orizzontale e fatti correre per 20’ a 25 V i vetrini vengono poi incubati con bromuro di etidio e osservati

22 VALUTAZIONE DELL’APOPTOSI
TEST PIU’ UTILIZZATI: valutazione mediante microscopia elettronica tunel assay comet assay DAPI/ colorazione con ioduro di propidio

23 DAPI IN PRATICA: si fissano le cellule su vetrino con etOH 96%
lavaggio in acqua 30 minuti di incubazione in una soluzione di DAPI lavaggio in PBS Microscopia-eccitazione UV

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25 VALUTAZIONE DELL’APOPTOSI
TEST PIU’ UTILIZZATI: valutazione mediante microscopia elettronica tunel assay comet assay DAPI colorazione con ioduro di propidio frammentazione del DNA

26 FRAMMENTAZIONE DEL DNA
trattamento delle cellule con il composto in esame estrazione del DNA separazione dei frammenti su gel di agarosio visualizzazione dopo colorazione con bromuro di etidio

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28 OSSERVAZIONE dei NUCLEI APOPTOTICI
staccare le cellule contare le cellule centrifugare a 1300 rpm per 10’ risospendere le cellule in Hoechst (5 mg/ml in PBS) alla concentrazione di 100 ml/ 106 cells incubare 15’ a 37°C centrifugare a 1900 rpm per 10’ risospendere il pellet in PI (50 mg/ml in PBS) alla concentrazione di 50 ml/ 106 cells deporre su vetrino e osservare al microscopio a fluorescenza

29 AUTOFAGIA Il termine deriva dal greco e significa “mangiare sé stessi”
E’ un processo di auto-degradazione lisosoma-mediato Esistono tre tipi di autofagia: macro-, micro-autofagia e autofagia chaperone-mediata Nella microautofagia porzioni di citosol vengono sequestrate e degradate direttamente dai lisosomi L’autofagia chaperone-mediata richiede il riconoscimento di proteine lisosomiali da parte di (heat shock protein) Hsp70 e Hsp73 E’ il principale meccanismo di regolazione del turnover di elementi citosolici e Organelli, ma è anche indotta rapidamente da stimoli quali la starvation e la deprivazione di fattori di crescita

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31 Metodi per evidenziare l’autofagia
osservazione mediante microscopia elettronica

32 colorazione con Arancio di Acridina e visualizzazione mediante
microscopio a fluorescenza e/o citofluorimetro - seminare le cellule - trattare - incubare 15’ con AO (1 mg/ml) - visualizzare