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MORTE CELLULARE apoptosi necrosi senescenza autofagia catastrofe mitotica.

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Presentazione sul tema: "MORTE CELLULARE apoptosi necrosi senescenza autofagia catastrofe mitotica."— Transcript della presentazione:

1 MORTE CELLULARE apoptosi necrosi senescenza autofagia catastrofe mitotica

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3 NECROSI è una morte passiva, non fisiologica aumento del volume cellulare a causa della perdita di controllo del flusso ionico (richiamo di H 2 O) reazione antiinfiammatoria lesioni a carico degli organelli intracellulari lisi cellulare per dissoluzione della membrana riversamento dei componenti intracellulari nello spazio extracellulare il danno primario è a livello della membrana plasmatica formazione di microvescicole alterazioni a livello cromatinico

4 CELLULA NECROTICA

5 Processo fisiologico di eliminazione delle cellule danneggiate, invecchiate, potenzialmente dannose per l’architettura dell’intero tessuto-organo o cellule non piùutili all’organismo APOPTOSI

6 alterazioni a carico del mitocondrio modificazioni nucleari caratteristiche modificazioni a livello della membrana plasmatica struttura e integrità della membrana vengono mantenute termine adottato negli anni ‘70 gli organelli mantengono la loro funzione frammentazione della cellula in “corpi apoptotici”

7 CELLULA APOPTOTICA

8 QUANDO SI ATTIVA IL PROCESSO APOPTOTICO? quando l’organismo vuole eliminare cellule non desiderate attraverso l’attivazione di una sequenza di eventi coordinati e programmati parte integrante dello sviluppo embrionale e fetale dell’organismo e dell’omeostasi tissutale dell’adulto (evidente nella metamorfosi del girino e nel feto) in cellule infettate da virus può interrompere la replicazione virale usata anche nel sistema immunitario per rimuovere i linfociti che non formano un recettore dell’antigene funzionale viene indotta in cellule soggette a un esteso danno al DNA

9 APOPTOSI distruzione di cellule durante l’embriogenesi controllo del numero di cellule modellamento di strutture involuzione ormono-dipendente nell’adulto morte cellulare durante neoplasie morte delle cellule immunitarie autoreattive morte delle cellule danneggiate da diversi stimoli

10 STIMOLI APOPTOTICI farmaci radiazioni ionizzanti mancanza di stimolazione ormonale death receptors

11 DIFETTO DI APOPTOSI cellule tumorali malattie a base autoimmune infezioni virali ECCESSO DI APOPTOSI sindrome dell’immunodeficienza acquisita malattie neurodegenerative sindromi mielodisplasiche ischemia

12 VIA ESTRINSECA VIA INTRINSECA

13 VIA ESTRINSECA I recettori di morte sono proteine transmembrana in grado di legare citochine pro-apoptotiche, quali FasL, TNF , TRAIL, e trasmettere il segnale di morte cellulare mediante l’attivazione di pathways specifici Si assemblano sotto forma di trimeri per favorire il riconoscimento del ligando

14 CASPASI Il termine deriva dal fatto che tali enzimi hanno una cisteina © nel loro sito attivo e tagliano le proteine dopo residui di acido aspartico. procaspasi caspasi Iniziatrici 8 e 10 estrinseco, 9 intrinseco Effettrici 3, 6 e 7 Sono responsabili del taglio: -della matrice nucleare -delle proteine del citoscheletro Questi tagli producono le classiche alterazioni strutturali, sia del nucleo, sia del citoplasma, che si osservano nelle cellule apoptotiche

15 VALUTAZIONE DELL’APOPTOSI TEST PIU’ UTILIZZATI: valutazione mediante microscopia elettronica

16 VALUTAZIONE DELL’APOPTOSI MEDIANTE MICROSCOPIA ELETTRONICA

17 tunel assay TEST PIU’ UTILIZZATI: valutazione mediante microscopia elettronica VALUTAZIONE DELL’APOPTOSI

18 TUNEL ASSAY La rottura del DNA durante l’apoptosi dà luogo a frammenti di DNA con rotture del doppio filamento a basso o alto PM; questi frammenti possono essere identificati marcando l’estremità 3’-OH libera per mezzo di un enzima, la TdT che catalizza la polimerizzazione di nucleotidi alle estremità 3’; se si utilizzano dei nucleotidi marcati con fluorescenza questi frammenti di DNA possono essere identificati in microscopia e/o citofluorimetria. IN PRATICA: si fissano le cellule in parafolmaldeide si permeabilizzano con una soluzione contenente Triton si marcano i frammenti di DNA con TdT e nucleotidi fluorescenti si analizzano le cellule in microscopia a fluorescenza o in citofluorimetria

19 VALUTAZIONE DELL’APOPTOSI MEDIANTE TUNEL ASSAY

20 tunel assay TEST PIU’ UTILIZZATI: comet assay valutazione mediante microscopia elettronica VALUTAZIONE DELL’APOPTOSI

21 COMET ASSAY le cellule trattate vengono risospese in agarosio, depositate su un vetrino e lisate i vetrini vengono posti in una cella elettroforetica orizzontale e fatti correre per 20’ a 25 V i vetrini vengono poi incubati con bromuro di etidio e osservati

22 tunel assay TEST PIU’ UTILIZZATI: DAPI/ colorazione con ioduro di propidio comet assay valutazione mediante microscopia elettronica VALUTAZIONE DELL’APOPTOSI

23 DAPI IN PRATICA: si fissano le cellule su vetrino con etOH 96% lavaggio in acqua 30 minuti di incubazione in una soluzione di DAPI lavaggio in PBS Microscopia-eccitazione UV

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25 tunel assay colorazione con ioduro di propidio frammentazione del DNA TEST PIU’ UTILIZZATI: DAPI comet assay valutazione mediante microscopia elettronica VALUTAZIONE DELL’APOPTOSI

26 FRAMMENTAZIONE DEL DNA trattamento delle cellule con il composto in esame estrazione del DNA separazione dei frammenti su gel di agarosio visualizzazione dopo colorazione con bromuro di etidio

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28  staccare le cellule  contare le cellule  centrifugare a 1300 rpm per 10’  risospendere le cellule in Hoechst (5  g/ml in PBS) alla concentrazione di 100  l/ 10 6 cells  incubare 15’ a 37°C  centrifugare a 1900 rpm per 10’  risospendere il pellet in PI (50  g/ml in PBS) alla concentrazione di 50  l/ 10 6 cells  deporre su vetrino e osservare al microscopio a fluorescenza OSSERVAZIONE dei NUCLEI APOPTOTICI

29 Il termine deriva dal greco e significa “mangiare sé stessi” E’ un processo di auto-degradazione lisosoma-mediato Esistono tre tipi di autofagia: macro-, micro-autofagia e autofagia chaperone-mediata Nella microautofagia porzioni di citosol vengono sequestrate e degradate direttamente dai lisosomi L’autofagia chaperone-mediata richiede il riconoscimento di proteine lisosomiali da parte di (heat shock protein) Hsp70 e Hsp73 E’ il principale meccanismo di regolazione del turnover di elementi citosolici e Organelli, ma è anche indotta rapidamente da stimoli quali la starvation e la deprivazione di fattori di crescita AUTOFAGIA

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31 Metodi per evidenziare l’autofagia osservazione mediante microscopia elettronica

32 colorazione con Arancio di Acridina e visualizzazione mediante microscopio a fluorescenza e/o citofluorimetro - seminare le cellule - trattare - incubare 15’ con AO (1  g/ml) - visualizzare


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