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I VETTORI VIRALI. Sistemi di trasferimento genico (trasduzione) Trasformazione (micro-organismi) Trasfezione (eucarioti) Infezione (se il vettore è un.

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1 I VETTORI VIRALI

2 Sistemi di trasferimento genico (trasduzione) Trasformazione (micro-organismi) Trasfezione (eucarioti) Infezione (se il vettore è un virus) Vettori non virali: Tecniche di trasfezione Uso di sostanze permeabilizzanti Elettroporazione Sistemi liposomici Bombardamento con microparticelle Microiniezione

3 Vantaggi dei vettori non virali Impossibile la generazione di nuovi virus patogeni Riduzione del rischio di reazione immunitaria Possono trasferire molti tipi diversi di molecole, e permettono di trasdurre molecole di DNA anche molto grandi Possibilità di produzione in grandi quantità a basso costo Svantaggi dei vettori non virali Scarsa efficienza sia di trasduzione che di integrazione (effetti non duraturi) Se integrati possono a loro volta dare mutagenesi inserzionale

4 Vettori virali Si ottengono inserendo il gene di interesse nel genoma di diversi tipi di virus, sotto il controllo di un promotore forte. Il virus viene reso incapace di riprodursi autonomamente, per evitare la diffusione di virus ricombinanti (virus difettivo) Il genoma viene ingegnerizzato con le tecniche del DNA ricombinante, e trasfettato in particolari linee cellulari capaci di produrre le particelle virali ricombinanti (linee di packaging). Queste complementano i difetti introdotti nel genoma. Il principale vantaggio consiste nellelevata efficienza di trasduzione (fino al 100% delle cellule).

5 Vantaggi dei vettori virali Alta efficienza di trasduzione Svantaggi dei vettori virali Possibilità di generare nuovi virus patogeni per ricombinazione con eventuali virus presenti nellospite Mutagenesi inserzionale (per quelli che si integrano in maniera casuale nel genoma) Molecole di DNA di dimensioni limitate Reazioni immunitarie Costi elevati

6 Vettori virali Virus difettivi: possono essere prodotti solo in particolari linee cellulari capaci di complementare i difetti del virus. La loro preparazione deve seguire queste fasi obbligate: 1. Costruzione del genoma ricombinante 2. Trasfezione del DNA nella linea cellulare capace di produrre le particelle virali 3. Raccolta e analisi del virus

7 Vettori virali: caratteristiche principali Retrovirus : possono infettare solo cellule in divisione e si integrano stabilmente in maniera casuale. Lentivirus : derivati del virus dell'HIV, possono infettare cellule quiescenti e si integrano stabilmente in maniera casuale. Adenovirus: esprimono ad alti livelli, non si integrano stabilmente e danno grosse reazioni immunitarie. Virus adeno-associati (AAV): integrazione sito specifica ed espressione stabile nel tempo, difficile produrli ad alto titolo. Herpes simplex: infezione molto selettiva dei neuroni, ma importanti effetti citotossici.

8 RETROVIRUS Retrovirus murini (Moloney murine leukemia virus) Non sono noti membri capaci di provocare malattie nelluomo Sono inattivati dal complemento umano Possiedono un envelope lipidico e non resistono al disseccamento Lentivirus (HIV) Sono patogeni umani del torrente ematico

9 RETROVIRUS virus con envelope genoma di 10 Kb costituito da una molecola di RNAss dopo linfezione il genoma è retrotrascritto a DNAds integra nel genoma dellospite (possibile mutagenesi) infetta solo celule in divisione LTR gagpolenv gag: codifica per le proteine del core pol: codifica per la trascrittasi inversa env: codifica per le proteine dellenvelope LTR: long terminal repeat, comprendono promotore/enhancers e sequenze necessarie per lintegrazione : sequenze per il packaging

10 vettori retrovirali REPLICAZIONE COMPETENTI Sono virus integri nei geni che ne consentono la replicazione, ma vengono privati di sequenze indesiderabili (es src del RSV). Virus derivati da RSV possono infettare in maniera efficiente cellule di origine aviaria e in modo meno efficiente cellule di mammifero. Virus derivati dal virus della leucemia murina di Moloney (MoMLV) sono invece più efficienti per le infezioni di cellule di mammifero.

11 vettori retrovirali REPLICAZIONE DEFICIENTI La maggior parte delle applicazioni dei vettori retrovirali richiedono che non vi sia replicazione del virus dopo l'infezione iniziale. A questo fine si possono sostituire parte o tutte le sequenze codificanti del retrovirus con quelle che si desidera trasferire: in questo modo il vettore stesso è incapace di produrre le proteine necessarie alla propria replicazione. Le funzioni richieste per l'infezione iniziale del vettore sono generalmente fornite da una linea cellulare detta "packaging", che consente la produzione di virus infettante ma incapace di replicarsi. revertanti replicazione competenti (RCR) Cruciale nel giudicare lefficacia del sistema vettore/linea di packaging è la valutazione della frequenza con la quale si verifica la comparsa di revertanti replicazione competenti (RCR) nella popolazione di virus prodotto.

12 LTR gagpolenv LTR LTR neopromotercDNA cDNA Viene mantenuta la regione essenziale che comprende i due LTR e la sequenza di packaging (elementi-cis). Promotore: virale o eucariotico Marker di selezione (es. neomicina o -galattosidasi). Dimensione max del transgene: 7.5 Kb. I geni virali gag, pol ed env sono sostituiti con il cDNA del gene di interesse. Il vettore che si ottiene non è in grado di produrre le proteine virali necessarie per un altro ciclo di infezione (vettore difettivo nella replicazione). vettori retrovirali REPLICAZIONE DEFICIENTI

13 Le proteine virali necessarie per linfezione iniziale vengono fornite in trans da : 1)CELLULE DI PACKAGING

14 Cellule di packaging La prima linea fu ottenuta trasfettando permanentemente cellule NIH 3T3 con un retrovirus MLV privato di. La linea cellulare ottenuta complementa costrutti privi di gag, pol e env, ma i titoli ottenuti sono bassi e la frequenza di ricombinazione con produzione di revertanti replicazione competenti (RCR) è troppo elevata. Per ridurre ulteriormente le possibilità di ricombinazione le proteine gag e pol sono state espresse su un plasmide diverso da quello esprimente env (split genome), e non più sotto il controllo di LTR.

15 Le proteine virali necessarie per linfezione iniziale vengono fornite in trans da : 2) VIRUS HELPER

16 PSEUDOTYPING Ogni retrovirus è in grado di infettare un particolare tipo cellulare grazie allespressione di specifiche proteine codificate dai geni env. Si sfrutta la capacità di un retrovirus di incorporare le proteine env di un altro retrovirus: modificando i geni env è possibile modificare il tropismo virale e/o aumentare il titolo del vettore. Le proteine env endogene o eterologhe vengono fornite in trans ad un retrovirus difettivo per la replicazione.

17 Vantaggi Non provocano malattie umane Inducono scarsa risposta immunitaria nellospite I transgeni possono essere espressi per tutta la vita dellospite Capacità di infettare efficientemente una vasta gamma di tipi cellulari Integrazione del materiale genetico recato dal vettore nel genoma delle cellule bersaglio alta efficienza di trasduzione Svantaggi Potenziale oncogeno perché si integrano nel genoma dellospite in molteplici siti Possono subire inattivazione trascrizionale in vivo Infettano solo cellule in attiva divisione Sono difficili da coltivare basso titolo ( ) RETROVIRUS MURINI

18 LENTIVIRUS Vantaggi Possono essere somministrati in vivo Non sono inattivati dal complemento Infettano sia cellule in divisione che quiescenti I transgeni possono essere espressi per tutta la vita dellospite Integrazione del materiale genetico recato dal vettore nel genoma delle cellule bersaglio Svantaggi Potenziale oncogeno perché si integrano nel genoma dellospite in molteplici siti Possono provocare malattia nelluomo Sono difficili da coltivare

19 ADENOVIRUS virus senza envelope, struttura icosaedrica regolare genoma di 36 Kb costituito da una molecola di DNAds il genoma è fiancheggiato da sequenze ITR (inverted terminal repeats) che servono come origine di replicazione dopo linfezione il virus entra nel nucleo della cellula ospite e viene replicato non si integra nel genoma dellospite (resta episomale) infetta sia celule in divisione che non dotato di ampio trofismo

20 E1A: coinvolto nellattivazione della trascrizione e nella promozione dellentrata della cellula ospite in fase S (lega Rb inducendo il rilascio del fattore di trascrizione E2F) E1B: blocca azione di p53, evitando entrata della cellula in apoptosi E2: codifica per 3 proteine coinvolte nella replicazione del DNA e nella modulazione della trascrizione (DNA-pol; proteina terminale e DNA-binding protein E3: modula la risposta immunitaria E4: regola la trascrizione, la transizione dellespressione da early a late gene, la replicazione virale e lassemblamento dei virioni L1-5: coinvolti nella produzione e nellassemblaggio delle proteine del capside E1a E1b L1 L2 L3 L4 E3 L5 E2b E2a E4 3535

21 VETTORI ADENOVIRALI: HELPER-DIPENDENTI Generati sostituendo i geni E1a e E1b con il transgene di interesse, posto sotto il controllo di un elemento enhancer e di un promotore. Il vettore così ottenuto è replicazione-difettivo e le funzioni replicative vengono fornite in trans da un virus helper (privato della sequenza e di E1). Il vettore è cresciuto in E1-expressing cell-lines (es. cellule 293A che presentano una copia del gene E1 integrata stabilmente).

22 VETTORI ADENOVIRALI: GUTLESS Vettori adenovirali helper-dipendenti di nuova generazione: sono vettori ad alta capacità. Sfruttano il fatto che tutte le proteine adenovirali possono essere complementate in trans, quindi quasi tutta la sequenza codificante può essere sostituita dal transgene che può avere dimensioni comprese tra 100b e i 36 Kb. Le uniche sequenze essenziali in cis sono le ITRs e la sequenza.

23 1.Vettore virale: contiene solo sequenze ITRs e + la cassetta di espressione del trangene 2.Cellule di packaging (293): esprimono gene E1 3.Virus Helper: E1-deleto, privo di sequenza. Fornisce elementi strutturali PRODUZIONE DI VETTORI GUTLESS

24 Vantaggi Sicuri (non integrano nel genoma) Facilmente manipolabili Stabili Si ottengono alti titoli Ampio trofismo Infettano anche cellule quiescenti Possono veicolare inserti di grosse dimensioni (36Kb) Svantaggi Espressione transiente Alta risposta immunitaria VETTORI ADENOVIRALI

25 VIRUS ADENO-ASSOCIATI (AAVs) virus a DNAss, con polarità + o – capside icosaedrico no envelope genoma fiancheggiato da sequenze ITRs, che contengono la sequenza di packaging solo due tipi di geni: cap (proteine del capside) rep (proteine necessarie per la replicazione e lintegrazione) per replicare necessita della presenza di un adenovirus o di un herpes simplex virus (virus helper) in assenza di AV o HSV, i virus AAV integrano stabilmente nel genoma della cellula ospite con unalta frequenza, in una regione precisa del cromosoma 19 (19q 13,3q-ter) una successiva superinfezione con AV o HSV attiva la replicazione del virus integrato

26 VETTORI VIRALI ADENOASSOCIATI Il vettore: è costruito sostituendo il transgene a cap e rep, in quanto le sequenze ITRs contengono tutte le informazioni necessarie per lintegrazione e per il packaging. Le cellule di packaging: linea cellulare 293 trasfettata con un plasmide contenente i geni cap e rep e successivamente infettata con un adenovirus helper difettivo per E1 e privo della sequenza. Recentemente è stato sviluppato un nuovo sistema di produzione: il virus helper è sostituito con un plasmide mini-Ad (contiene parte del genoma di adenovirus)

27 Vantaggi Non sono patogeni per luomo Sono stabili Vengono ottenuti con alti titoli Alta efficienza di trasferimento genico Ampio trofismo Infettano sia cellule in divisione che non Integrazione del transgene Svantaggi Dimensioni ridotte del transgene (4.7 Kb). Recentemente la capacità di questi vettori è stata aumentata sfruttando concatamerizzazione del genoma dei AAV dopo il traferimento. Si usano due vettori, ciascuno codificante metà della proteina di interesse. Vettore ricombinante non ha integrazione sito specifica e talvolta resta episomale

28 HERPES SIMPLEX VIRUS (HSV-1) virus a DNAds capside icosaedrico envelope lipidico genoma costituito da almeno 80 geni, la metà dei quali non essenziali Inizialmente effettua uninfezione produttiva nelle cellule epiteliali (ciclo litico), risale poi attraverso le terminazioni dei nervi sensoriali fino ai gangli dorsali. Qui stabilisce uninfezione latente (non necessita di espressione genica). Il ciclo litico viene riattivato periodicamente: le nuove particelle virali vengono trasportate con trasporto anterogrado e provocano lesioni a livello epiteliale

29 VETTORI HSV-1 Grazie alla loro naturale capacità di stabilire infezioni latenti nei neuroni, vengono utilizzati per il trasporto di geni nel CNS. Lespressione a lungo termine del transgene viene ottenuta utilizzando dei promotori neurone-specifici, attivati durante il periodo di latenza. Possono trasportare geni di grosse dimensioni (152Kb) Esistono due tipi di vettori HSV-1: 1.Disabled HSV vectors 2.Amplicon HSV vectors

30 1.DISABLED HSV VECTORS Virus ricombinanti ottenuti eliminando uno o più geni precoci immediati. Vengono prodotti in cellule di packaging che complementano i geni mancanti. Vettori di ultima generazione: prodotti eliminando il gene che codifica per la glicoproteina-H di HSV-1 e cresciuti in una linea cellulare che complementa questa proteina. I virus ottenuti sono infettivi, ma possono effettuare un solo ciclo di infezione.

31 2.AMPLICON HSV VECTORS Si usa un amplicone, un plasmide contenente: unorigine di replicazione batterica (generalmente da Escherichia coli), unorigine di replicazione di HSV-1 (OriS) la sequenza di packaging di HSV-1 il transgene Il tutto viene inserito in una linea cellulare infettata da un virus helper contenente i geni regolatori e strutturali mancanti.

32 PRODUZIONE DI VETTORI VIRALI Tre fattori determinano lefficienza di produzione di un vettore virale: 1.Lla natura del vettore 2.lla linea cellulare di packaging: modificazioni del ciclo cellulare al fine di favorire le fasi di replicazione virale e inibizione dellapoptosi (es. alcuni virus, quali SV40 e Epstein-Barr hanno evoluto sistemi anti- apoptotici) 3.lle condizioni di coltura: temperatura di crescita, concentrazione del siero, tempo di infezione, confluenza cellulare al tempo dellinfezione… Es. retrovirus: emivita aumentata di 4 volte e titolo virale aumentato di 5-10 volte portando la temperatura di crescita da 37° C a 32° C.

33 PURIFICAZIONE DI VETTORI VIRALI La resa di produzione di un vettore virale è fortemente influenzata dallalto grado di purezza richiesto. Per facilitare il processo di purificazione si crescono i vettori virali in terreni privi di siero (bilancio tra diminuita produzione e maggiore recupero) Tecniche di purificazione: centrifugazione in gradiente di CsCl (usato nei laboratori) cromatografia daffinità (produzione su larga scala)

34 Es. PRODUZIONE DI VETTORI ADENOVIRALI 1)Vettore adenovirale: vettore commerciale deleto in E1 e E3 gene di interesse posto sotto il controllo di un promotore forte (es. CMV) sequenze necessarie per il packaging (ITRs, sequenza, late gene) 2)Cellule di packaging: linea cellulare 293A (cellule embrionali renali umane), che contiene una copia dei geni E1 integrata stabilmente (complementazione in trans)

35 1.INSERZIONE DEL TRANSGENE NEL VETTORE Clonaggio del DNA di interesse mediante taglio enzimatico del vettore, dellinserto (estremità coesive) e successiva ligazione

36 2.TRASFEZIONE DELLA LINEA 293A CON IL VETTORE 1. The day before transfection, trypsinize and count the 293A cells, plating them at 5 x 105 cells per well in a 6-well plate. Plate cells in 2 ml of normal growth medium containing serum. 2. On the day of transfection, remove the culture medium from the 293A cells and replace with 1.5 ml of normal growth medium containing serum. Do not include antibiotics. 3. Prepare DNA-Lipofectamine complexes for each transfection sample. 4. Add the DNA-Lipofectamine complexes dropwise to each well. Mix gently by rocking the plate back and forth. Incubate the cells overnight at 37°C in a CO2 incubator. 5. The next day, remove the medium containing the DNA-Lipofectamine complexes and replace with complete culture medium (i.e. D-MEM containing 10% FBS, 2 mM L-glutamine, and 1% penicillin/streptomycin).

37 2.TRASFEZIONE DELLA LINEA 293A CON IL VETTORE hours post-transfection, trypsinize cells and transfer the contents of each well to a sterile 10 cm tissue culture plate containing 10 ml of complete culture medium. Caution: Remember that you are working with infectious virus at this stage and in all subsequent procedures. 7. Replace culture medium with fresh, complete culture medium every 2-3 days until visible regions of cytopathic effect (CPE) are observed (typically 7-10 days post-transfection). 8. Replenish culture medium and allow infections to proceed until approximately 80% CPE is observed (typically days post-transfection). 9. Harvest adenovirus-containing cells by squirting cells off the plate with a 10 ml tissue culture pipette. Transfer cells and media to a sterile, 15 ml, capped tube. Proceed to Preparing a Crude Viral Lysate.

38 Day 4-6 post-transfection At this early stage, cells producing adenovirus first appear as patches of rounding, dying cells. Day 6-8 post-transfection As the infection proceeds, cells containing viral particles lyse and infect neighboring cells. A plaque begins to form. Day 8-10 post-transfection At this late stage, infected neighboring cells lyse, forming a plaque that is clearly visible. Valutazione delleffetto citopatico

39 3.PREPARAZIONE DEL LISATO VIRALE After you have harvested adenovirus-containing cells and media, you will use several freeze/thaw cycles followed by centrifugation to prepare a crude viral lysate. The freeze/thaw cycles cause the cells to lyse and allow release of intracellular viral particles. 1. Place the tube containing harvested cells and media from Transfection Procedure, Step 9, page 11 at -80°C for 30 minutes. Remove tube and place in a 37°C water bath for 15 minutes to thaw. Repeat the freezing and thawing steps twice. Note: Do not incubate samples at 37°C for longer than 15 minutes. 2. Centrifuge the cell lysate in a table-top centrifuge at 3000 rpm for 15 minutes at room temperature to pellet the cell debris. 3. Transfer the supernatant containing viral particles to cryovials in 1 ml aliquots. Store the viral stocks at -80°C.

40 3.PREPARAZIONE DEL LISATO VIRALE Once you have prepared a crude viral stock, you may: Amplify the viral stock by infecting 293A cells (see the next section for details). This procedure is recommended to obtain the highest viral titers and optimal results in your transduction studies. Determine the titer. Use this viral stock to transduce your mammalian cells of interest to verify the functionality of your adenoviral construct in preliminary expression experiments.

41 4.AMPLIFICAZIONE DELLO STOCK DI VETTORI ADENOVIRALI Once you have created a crude viral stock, you can use this stock to infect 293A cells to generate a higher titer viral stock (i.e. amplify the virus). The titer of the initial viral stock obtained from transfecting 293A cells generally ranges from 1 x 10 7 to 1 x 108 plaque-forming units (pfu)/ml. Amplification allows production of a viral stock with a titer ranging from 1 x 10 8 to 1 x 109 pfu/ml and is generally recommended. Remember that you will be working with infectious virus. Follow the recommended Federal guidelines for working with BL-2 organisms. Perform all manipulations within a certified biosafety cabinet. Treat media containing virus with bleach. Treat used pipets, pipette tips, and other tissue culture supplies with bleach or dispose of as biohazardous waste. Wear gloves, a laboratory coat, and safety glasses or goggles when handling viral stocks and media containing virus.

42 4.AMPLIFICAZIONE DELLO STOCK DI VETTORI ADENOVIRALI The day before infection, trypsinize and count the 293A cells, plating them at 3 x 10 6 cells per 10 cm plate. Plate cells in 10 ml of normal growth medium containing serum. 2. On the day of infection, verify that the cells are at 80-90% confluency before proceeding. Add the desire amount of crude adenoviral stock to the cells. 3. Incubate the cells at 37°C in a CO2 incubator and allow infection to proceed until 80-90% of the cells have rounded up and are floating or lightly attached to the tissue culture dish (typically 2-3 days post-infection). This indicates that cells are loaded with adenoviral particles. 4. Harvest adenovirus-containing cells by squirting cells off the plate with a 10 ml tissue culture pipette. Transfer cells and media to a sterile, 15 ml, capped tube. 5. Place the tube containing harvested cells and at -80°C for 30 minutes. Remove tube and place in a 37°C water bath for 15 minutes to thaw. Repeat the freezing and thawing steps twice. 6. Centrifuge the cell lysate in a table-top centrifuge at 3000 rpm for 15 minutes at room temperature to pellet the cell debris. 7. Transfer the supernatant containing viral particles to cryovials in 1 ml aliquots. Store the viral stocks at -80°C. Proceed to Titering Your Adenoviral Stock,.

43 5.TITOLAZIONE DELLO STOCK DI VETTORI ADENOVIRALI Before proceeding to transduce the mammalian cell line of interest and express your recombinant protein, we highly recommend determining the titer of your adenoviral stock. While this procedure is not required for some applications, it is necessary if: You wish to control the number of adenoviral particles introduced to each cell You wish to generate reproducible expression results To determine the titer of an adenoviral stock, you will: 1. Plate 293A cells in 6-well tissue culture plates. 2. Prepare 10-fold serial dilutions of your adenoviral stock. 3. Infect 293A cells overnight with serial dilutions of adenoviral stock. 4. Perform a plaque assay by overlaying the infected 293A cells with an agarose/plaquing media solution. Allow 8-12 days for plaques to form. 5. Stain and count the number of plaques in each dilution

44 A plaque assay. Serial dilutions of virus have been plated on confluent monolayer cultures of cells. The cells are stained after a period of time in which a single virus infects a cell, produces new virus particles and infects surrounding cells. The white areas show areas of the culture in which the cells have been killed. Each "plaque" is the result of the presence of one original infectious virus particle. 5.TITOLAZIONE DELLO STOCK DI VETTORI ADENOVIRALI dilution: confluent; undeterminable dilution: dilution: 4.5 Thus, the titer of this viral stock is 5,2 x 10 6 PFU/ml (i.e. average of 59 x 10 5 and 4.5 x 10 6 ).

45 6.DETERMINAZIONE DEI REPLICATION-COMPETENT ADENOVIRUS (RCA) RCA frequency: It is possible for homologous recombination to occur between the E1 genomic region in 293 cells and the viral DNA, causing the gene of interest to be replaced with the E1 region, and resulting in generation of a wild-type, replication-competent adenovirus (RCA) To determine the number of RCA per ml, 60-mm-diameter dishes of A549 cells (not packaging cells) were inoculated with 0.2-ml dilutions of the viral stocks for a period of 2 h with intermittent shaking. After adsorption, a standard plaque assay was performed, and plaques were enumerated at day 13). number of RCA/ml titer

46 VETTORI VIRALI PER TERAPIA GENICA: es.FIBROSI CISTICA La fibrosi cistica è causata da una mutazione nel gene regolatore della conduttanza trasmembrana (CFTR), che codifica per una proteina canale del cloro localizzata a livello apicale della membrana delle cellule epiteliali. Vettori adenovirali umani E1-replicazione-deficienti che esprimono il gene CFTR. Ottimi risultati ottenuti in animali (espressione per almeno 6 settimane), scarsi risultati nelluomo (espressione per 2-4 settimane). Possibili spiegazioni: -muco presente nel tratto respiratorio ostacola linfezione virale; -il recettore riconosciuto dalladenovirus si trova sulla membrana basolaterale delle cellule epiteliali; -alta probabilità di riscontrare anticorpi diretti contro il vettore. Attualmente, la terapia con vettori virali prevede una somministrazione del vettore 1 o 2 volte al mese.

47 VIRUS ONCOLITICI: TRATTAMENTO DEL CANCRO Si sfrutta lazione litica dei virus per eliminare selettivamente le cellule tumorali. STRATEGIE PER GENERARE VIRUS TUMORE-SELETTIVI: 1)TUMORE-SELETTIVITA INTRINSECA: Si utilizzano dei virus che intrinsecamente lisano cellule tumorali Es. - Newcastle-disease virus (NDV) - Virus della stomatite vescicolare (VSV) Virus a RNA sensibili allinterferone non si riproducono nelle cellule normali.

48 2)ATTENUAZIONE DEI VIRUS WT Vengono deleti alcuni geni virali essenziali per la replicazione, che sono poi complementati in trans solo nelle cellule tumorali la replicazione è ristretta alle cellule tumorali Es. - HSV privo di gene che codifica per timidino chinasi e/o ribonucleotide riduttasi. Questi enzimi non vengono espressi nelle cellule quiescenti, ma vengono up-regolati in fase G1 e S (generano i dNTPs necessari per la sintesi del DNA) virus replica solo nelle cellule in elevata proliferazione. VIRUS ONCOLITICI: TRATTAMENTO DEL CANCRO

49 2)ATTENUAZIONE DEI VIRUS WT Es. - AV privo del gene che codifica per E1B-55K: Onyx-015 (primo AV replicazione-selettivo entrato in trials clinici) Trials clinici in fase I e II per il trattamento del carcinoma delle cellule squamose della testa e del collo (SCCHN). Onyx-015 iniettato intratumoralmente: Effetti collaterali: sintomi influenzali. 20% dei pazienti positivi alla replicazione virale, 14% mostrano benefici Onyx-015 iniettato intratumoralmente + chemioterapia: 27% dei pazienti mostrano completa eliminazione della massa tumorale; 36% dei pazienti mostra riduzione del 50% del volume della massa tumorale. In nessuno dei pazienti che aveva mostrato risposta è ricomparso il tumore dopo 6 mesi, mentre in tutti i pazienti sottoposti alla sola chemioterapia si è osservata ricomparsa della massa tumorale VIRUS ONCOLITICI: TRATTAMENTO DEL CANCRO

50 VIRUS ONCOLITICI: TRATTAMENTO DEL CANCRO 3)TRASCRIPTIONAL TARGETING I geni virali essenziali per la replicazione vengono posti sotto il controllo di promotori e/o enhancers cellulo-specifici Es. -AV replicazione-competenti in cui E1A e E1B sono posti sotto il controllo di promotori prostata-specifici (es. promotore per il PSA, antigene prostata-specifico, e/o per la probasina) sono usati per il trattamento del carcinoma prostatico. -HSV con early genes posti sotto il controllo del promotore dellalbumina usati per il trattamento del carcinoma del fegato.

51 VIRUS ONCOLITICI: TRATTAMENTO DEL CANCRO 4)CELLULAR TARGETING Modificazione del trofismo virale mediante ingegnerizzazione delle proteine del coat. Es. -HSV-1 modificati: eliminazione delle glicoproteine B e C di superficie e inserimento dell interleuchina 13 virus che infettano selettivamente cellule che esprimono il recettore 2 dellinterleuchina 13 (IL-13), come le cellule tumorali cerebrali.

52 VIRUS ONCOLITICI: TRATTAMENTO DEL CANCRO

53 VIRUS-DIRECTED ENZYME PRODRUG THERAPY (VDEPT) o TERAPIA DEL GENE SUICIDA: TRATTAMENTO DEL CANCRO Si basa sulla somministrazione di un agente chemioterapico in forma di profarmaco (non tossico), combinata con lespressione cellula-tumorale specifica dellenzima capace di convertirlo nella forma tossica. Lenzima viene veicolato mediante un vettore virale. N.B.la forma attiva dellagente chemioterapico deve avere una tossicità elevata, per ottenere un EFFETTO BYSTANDER, e unemivita breve, per minimizzare la tossicità sistemica. N.B. la forma attiva dellagente chemioterapico deve avere una tossicità elevata, per ottenere un EFFETTO BYSTANDER, e unemivita breve, per minimizzare la tossicità sistemica.

54 VIRUS-DIRECTED ENZYME PRODRUG THERAPY (VDEPT) o TERAPIA DEL GENE SUICIDA: TRATTAMENTO DEL CANCRO Es. 1) SITEMA TIMIDINO CHINASI-GANCICLOVIR: vettore retrovirale che esprime lenzima timidino chinasi di HSV soministrato in situ in tumori cerebrali. 2) SISTEMA CITOSINA DEAMINASI-5-FLUOROCITOSINA sperimentazione in corso per il trattamento del tumore al seno.

55 3) SISTEMA NITROTIROSINA-CB1954 (5-(aziridin-1-yl)-2,4-dinitrobenzamide) CB1954 viene convertito da una forma alchilica monofunzionale debolmente tossica ad una forma alchilica bifunzionale molto tossica, per azione dellenzima NITROREDUTTASI codificata dal gene nfsB di Escherichia coli B. Vettore adenovirale umano (sierotipo 5) replicazione deficiente (deleto in E1 e E3) che contiene il gene nfsB sotto il controllo di un promotore specifico. Vantaggi: -la forma attiva di CB1954 diffonde attraverso la membrana sanza bisogno di gap junction maggiore effetto bystander; -indipendenza dal ciclo cellulare; -CB1954 può essere attivato solo allinterno della cellula (necessita di un cofattore) rischio ridotto di tossicità.


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