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Considerazione strategiche 2. Scelta del sistema cellulare 3. Scelta della tecnica di transfezione 4. Metodo di selezione delle cellule transfettate 1.

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1 Considerazione strategiche 2. Scelta del sistema cellulare 3. Scelta della tecnica di transfezione 4. Metodo di selezione delle cellule transfettate 1. Scelta del vettore

2 2. Scelta del sistema cellulare 2. Efficienza di transfezione 3. Modificazioni post-traduzionali 4. Espressione di fattori di regolazione dellespressione genica 5. Facilità di analisi immunologica o di purificazione della proteina (espressione di proteine omologhe) 1. Facilità di coltura e stabilità

3 Considerazione strategiche 2. Scelta del sistema cellulare 3. Scelta della tecnica di transfezione 4. Metodo di selezione delle cellule transfettate 1. Scelta del vettore

4 3. Scelta della tecnica di transfezione Microiniezione Adsorbimento mediante DEAE-Destrano Coprecipitazione con calcio fosfato Lipofezione Elettroporazione Infezione con vettori virali

5 Microiniezione Elevata efficienza (iniezione diretta nel nucleo) Impossibile applicazione su larga scala Grande manualità delloperatore Applicazioni particolari (topi transgenici, espressione di mRNA in cellule di Xenopus laevis)

6 Microiniezione

7 Adsorbimento mediante DEAE-Destrano Formazione di aggregati di DNA (-) e DEAE-destrano (+) Deposizione sulla membrana cellulare Internalizzazione per endocitosi Scarsa efficienza Elevata degradazione del DNA, scarsa penetrazione nel nucleo Utilizzato in cellule con elevata attività endocitotica DNA-DEAE Destrano-TBS

8 Coprecipitazione con calcio fosfato La coprecipitazione di aggregati calcio fosfato-DNA sulla superficie cellulare favorisce linternalizzazione dellacido nucleico Buona efficienza (5-40%) Semplice esecuzione Piuttosto riproducibile Tossicità cellulare DNA+CaCl 2 HEPES Coprecipitazione

9 Lipofezione Trasferimento di DNA mediato da liposomi In particolari condizioni è possibile ottenere liposomi contenenti DNA La struttura del doppio strato fosfolipidico facilita la fusione con la membrana cellulare ed il rilascio del DNA nel citosol Buona efficienzaScarsa citotossicitàRiproducibilità DNA

10 Lipofezione con reagenti lipidici neutri I liposomi sono delle sfere di membrane sintetiche che possono essere riempite con DNA. Esse fondono spontaneamente con le membrane cellulari rilasciando il loro contenuto nel citoplasma. Sono disponibile commercialmente dei kit per la semplice preparazione dei liposomi.

11 Lipofezione con reagenti lipidici cationici Reagenti lipidici cationici in soluzione acquosa formano piccoli ( nm) liposomi unilamellari. La superficie carica positivamente attrae il DNA (-). Il DNA non è propriamente incapsulato nel liposoma ma piuttosto legato alle sue superfici. Ogni plasmide si lega a 2-4 liposomi. Linternalizzazione del costrutto è via endosomi e lisosomi. LIPOFECTAMINE TM OLIGOFECTAMINE TM CELLFECTIN TM

12 Lipofezione con reagenti dendrimerici attivati Particolari reagenti commerciali, definiti dendrimerici, possiedono unarchitettura sferica, che si ramifica radialmente da un core centrale e termina con gruppi amminici ionizzati. Tali reagenti complessano il DNA in strutture compatte ottimizzando linternalizzazione del DNA nella cellula. Il complesso DNA-dendrimero possiede una carica netta di segno positivo, che favorisce il legame a recettori con carica negativa (ex. Glicoproteine sialilate). Una volta allinterno della cellula, il reagente tampona il pH del lisosoma riducendo la degradazione del vettore.

13 Elettroporazione Un campo elettrico altera la permeabilità di membrana e permette lingresso al DNA. Non cè endocitosi Minore esposizione alle nucleasi Buona efficienza Elevata citotossicità Adatto a cellule con membrane particolarmente resistenti Adatta a cellule in sospensione

14 Elettroporazione Le cellule vengono concentrate, miscelate con il DNA da transfettare e collocate in una cella collegata a degli elettrodi. Un breve impulso elettrico apre in maniera reversibile dei buchi nelle membrane cellulari. Il DNA entra nelle cellule che vengono piastrate in terreno fresco.

15 Infezione con vettori virali I virus si sono evoluti per trasferire il loro DNA nelle cellule in maniera efficiente e specifica Infezione Iniezione del DNA Replicazione Sintesi del capside Assemblaggio Lisi

16 Il genoma virale deve essere modificato Inserimento del gene di interesse Eliminazione dei late genes, codificanti per il capside, in modo da evitare la lisi della cellula infettata Per la produzione del vettore virale si rendono necessarie coinfezioni con i virus helper oppurepackaging cell lines.

17 Packaging cell lines Linee cellulari transfettate stabilmente con geni virali codificanti per proteine strutturali del capside (late genes), necessarie per lassemblaggio dei virioni. La loro transfezione transiente con il DNA-vettore determina limpacchettamento del costrutto nel virione. Si ottiene in questo modo un vettore virale di transfezione completo.

18 Vettori virali SV40. Il primo. Genoma piccolo ed instabile, solo per cellule di scimmia Retrovirus. Genoma ad RNA. Integrazione del vettore. Alta efficienza e capacità. Terapia genica Baculovirus. Virus degli insetti. Porta allespressione ed accumulo di grandi quantità di proteine. Mutanti virali. Ex. Virus vaccinico iperesprimente la RNA pol T7.

19 Considerazione strategiche 2. Scelta del sistema cellulare 3. Scelta della tecnica di transfezione 4. Metodo di selezione delle cellule transfettate 1. Scelta del vettore

20 Transfezioni stabili o transienti Transfezioni transienti: il gene esogeno entra nel nucleo e viene trascritto dalla RNA pol II ma non si integra nel genoma della cellula transfettata. Viene perduto dopo pochi cicli replicativi Transfezioni stabili: il gene esogeno viene integrato nel genoma della cellula ed in presenza di una adeguata pressione selettiva viene mantenuto per numerosi passaggi in coltura. La probabilità di integrazione stabile è dellordine di 10 -4, sul totale delle cellule transfettate

21 Transfezione stabile Durante le prime 48 ore dopo la transfezione, fino al 50% delle cellule contengono il DNA esogeno. In seguito, a causa della degradazione e della diluizione, le cellule che non hanno integrato tale DNA nel loro genoma lo perdono. Per isolare le cellule transfettate stabilmente occorre applicare una pressione selettiva, utilizzando un apposito marker di selezione.

22 Marcatori di selezione per cellule di mammifero Tk fosforila la timidinaAminopterina (Inibisce sintesi timidina-P) Timidina chinasi (Tk) XGPRT sintetizza GMPAcido micofenolico (Inibisce sintesi GMP) Xantina-guanina fosforibosil transferasi (XGPRT) Inattiva Xyl-A9- -D-furanosil (Xyl- A) (danneggia DNA) Adenosina deaminasi (ADA) HPH inattiva igromicinaIgromicina B (Inibitore sintesi proteica) Igromicina fosfotransferasi (HPH) Variante resistente DHFRMetotrexate (Inibisce DHFR) Diidrofolato reduttasi (DHFR) APH inattiva G418G418 (Inibitore sintesi proteica) Aminoglicoside fosfotransferasi (APH) MECCANISMO FARMACOENZIMA

23 Mutanti tk - non sopravvivono in terreno HAT (Aminopterina) se la via di salvataggio non è praticabile Timidino chinasi Nucleotidi: Biosintesi ex novo o salvataggio Lenzima tk è necessario alla via di salvataggio 5-fosforibosil-1- pirofosfato Uridina monofostato Inosina monofostato Timidina monofostato AMINOPTERINA Guanina monofostato Adenina monofostato Ipoxantina Timidina

24 Applicazioni dellingegneria cellulare. RICERCA DI BASE APPLICAZIONI INDUSTRIALI Screening di molecole farmacologicamente attive (HTS) Produzione di biofarmaci Studio della regolazione dellespressione genica. Analisi di mutazioni di elementi cis e trans Analisi struttura funzione delle proteine eucariote Riconoscimento della funzione di una proteina (oncogeni, geni oncosoppressori)

25 Greene et al. EMBO reports 8, 6, 563–568 (2007)

26 Structure of TFMPV-E2/ER ligand- binding domain. (A) The structure of one monomer of ER is shown as a ribbon diagram, with the bound GRIP1 coactivator peptide coloured red. The compound is shown in a stick representation, with carbon atoms coloured green, oxygen atoms coloured red and fluorine atoms coloured pink. (B) A stereo view of part of the ligand-binding pocket bound to oestradiol (top panels; Protein Data Bank code 1ERE), or TFMPV-E2 (bottom panels). The ligands are coloured green and are shown in a stick representation. (C) TFMPV-E2 is shown in a 2F o –F c electron density map, contoured to 1.5. ER, oestrogen receptor ; GRIP, glutamate receptor interacting protein; TFMPV-E2, trifluoromethyl-substituted phenylvinyl oestradiol compound Greene et al. EMBO reports 8, 6, 563–568 (2007)

27 Applicazioni dellingegneria cellulare. RICERCA DI BASE APPLICAZIONI INDUSTRIALI Screening di molecole farmacologicamente attive (HTS) Produzione di biofarmaci Studio della regolazione dellespressione genica. Analisi di mutazioni di elementi cis e trans Analisi struttura funzione delle proteine eucariote Riconoscimento della funzione di una proteina (oncogeni, geni oncosoppressori)

28 Lesempio della identificazione di Nip-2 e protimosina

29 cnip 0.5nip 1.5nip 2.5 Cell death (dead cells/dish)x h24h48h nip2 mRNA Hours after Locke bnip-2 expression associates to cell death Nip-2 pro-apoptotic activity is blocked by overexpression of Bcl-2 mutants of nip-2 in the Bcl-2 binding domani fail to cause apoptosis Meda et al. 2001

30 CTRL BNIP2 CTRL BNIP2CTRL CTRL BNIP2 %survival % proliferation 0 0 TRANSFECTION OF bnip2 cDNA IN MCF-7 CELLS Meda et al. 2001

31 Applicazioni dellingegneria cellulare. RICERCA DI BASE APPLICAZIONI INDUSTRIALI Screening di molecole farmacologicamente attive (HTS) Produzione di biofarmaci Studio della regolazione dellespressione genica. Analisi di mutazioni di elementi cis e trans Analisi struttura funzione delle proteine eucariote Riconoscimento della funzione di una proteina (oncogeni, geni oncosoppressori)

32 Un esempio storico. Lanalisi del promotore del gene tk del virus Herpes Simplex GCCCAATGCTATA Generazione di mutanti Trascrizione in oociti di Xenopus laevis Analisi di Northern

33 Applicazioni dellingegneria cellulare. RICERCA DI BASE APPLICAZIONI INDUSTRIALI Screening di molecole farmacologicamente attive (HTS) Produzione di biofarmaci Studio della regolazione dellespressione genica. Analisi di mutazioni di elementi cis e trans Analisi struttura funzione delle proteine eucariote Riconoscimento della funzione di una proteina (oncogeni, geni oncosoppressori)

34 Lo studio della regolazione dellespressione genica. I sistemi reporter Con i sistemi reporter è possibile studiare sia gli elementi cis che trans di regolazione della trascrizione. Inoltre è possibile effettuare lo screening di molecole in grado di interferire con lespressione del gene reporter. Questo principio può essere esteso agli animali transgenici X Y Gene reporter Promotore Elementi di regolazione cis Z Elementi di regolazione trans Proteina facilmente dosabile

35 I geni reporter Bassa sensibilità per mancanza di amplificazione (non è una reazione enzimatica) Monomerico, non richiede substrato, assente nei mammiferi, varianti con diversa di fluorescenza. Green fluorescent protein (GFP, varianti RFP, BFP) Elevata attività endogena in alcuni tipi cellulari. Proteina di secrezione, saggio colorimetrico molto sensibile. Fosfatasi alcalina (Umana) Richiede laggiunta di cofattore, O 2, ATP. Alta attività specifica, mancanza di attività endogena (basso background) Luciferasi (Lucciola) Presenza di attività endogena in cellule di mammifero, enzima tetramerico (risposta non lineare) Ben caratterizzata, stabile, rilevazione automatizzabile B-Galattosidasi (Batterica) SVANTAGGIVANTAGGIGENE

36 Screening di molecole farmacologicamente attive. ER cDNA ERELUC Potenziali ligandi CTR E2E2 LUC Units LUC ER

37 Imaging dellespressione genica attraverso i sistemi reporter. Le proteine fluorescenti (GFP e BFP). Citosol BFP Golgi GFP

38 Imaging dellespressione genica attraverso i sistemi reporter. -Galattosidasi e Luciferasi

39 High-throughput Screening (1) La possibilità di automatizzare la detezione del reporter consente uno screening ad alto flusso. Library di molecole Saggio biologico automatizzabile Piattaforma Robotizzata Elaborazione digitale dei dati

40 High-throughput Screening (2) ricercatori1.5 milioni di molecole/anno Oggi. 4 ricercatori2.5 milioni di molecole/anno I più moderni saggi di screening consentono la determinazione della POTENZA e della SPECIFICITA della sostanza testata.

41 Applicazioni dellingegneria cellulare. RICERCA DI BASE APPLICAZIONI INDUSTRIALI Screening di molecole farmacologicamente attive (HTS) Produzione di biofarmaci Studio della regolazione dellespressione genica. Analisi di mutazioni di elementi cis e trans Analisi struttura funzione delle proteine eucariote Riconoscimento della funzione di una proteina (oncogeni, geni oncosoppressori)

42 Produzione di biofarmaci La produzione delle proteine terapeutiche in microorganismi non è sempre possibile soprattutto per le modificazioni post-traduzionali Lutilizzo di cellule animali consente di ottenere prodotti proteici strutturalmente più simili al fisiologico, ma pone serie difficoltà tecniche e costi più elevati.

43 Difficoltà nella produzione di biofarmaci Istituzione di Master cell banks caratterizzate in dettaglio per stabilità genetica, tempi di crescita, contaminazioni, numero di copie del vettore, livello di espressione del transgene. Preparazione di Manufacturers cell banks sottoposte ad ulteriore caratterizzazione prima e dopo il caricamente nellimpianto pilota Controllo su larga scala della stabilità nelle condizioni di fermentazione, con la preparazione di Extended cell banks. Controllo delle condizioni di produzione Recupero e produzione Caratterizzazione del prodotto CONTROLLO QUALITA

44 Controllo di qualità di proteine terapeutiche Spettrometria di massa Presenza di DNA cellulare Presenza pirogeni Presenza di proteine cellulari Presenza di proteine seriche HPLC SDS PAGE/Western Determinazione dello stato di purezza Composizione in acido sialico Composizione in carboidrati Sequenziamento N-terminale Mappa peptidica HPLC Isoelectrofocusing SDS PAGE Western Saggio immunologico Saggio biologico Caratterizzazione della proteina

45 TPA ricombinante Il primo farmaco ricombinante prodotto in cellule di mammifero Cellule CHO (Chinese Hamster Ovary) Pregressa conoscenza nella produzione di vaccini Assenza di attività tossica per luomo Stabile integrazione di geni eterologhi Crescita in sospensione o monostrato Modificazioni post-traduzionali corrette

46 Alcuni esempi di proteine terapeutiche in commercio BHK (Baby Hamster Kidney cells) Fattore VII CHOGlucocerebrosidasi CHOEritropoietina CHOInterferone beta CHOFSH E.ColiG-CSF E.ColiIL-2 E.ColihGH E.ColiInterferone alfa E.ColiInsulina E.Coli, CHOTPA


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