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LEZIONE 9 Ingegneria cellulare II CORSO DI LAUREA SPECIALISTICA IN BIOTECNOLOGIE DEL FARMACO AA 2010-11 Adriana Maggi.

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1 LEZIONE 9 Ingegneria cellulare II CORSO DI LAUREA SPECIALISTICA IN BIOTECNOLOGIE DEL FARMACO AA Adriana Maggi

2 Applicazioni dellingegneria cellulare. RICERCA DI BASE Studio della regolazione dellespressione genica. Analisi di mutazioni di elementi cis e trans Analisi struttura funzione delle proteine eucariote Riconoscimento della funzione di una proteina (oncogeni, geni oncosoppressori) APPLICAZIONI INDUSTRIALI Screening di molecole farmacologicamente attive (HTS) Produzione di biofarmaci

3 Biological reporter: molecules acting as surrogate, measurable, indicators of a given molecular event

4 I geni reporter Bassa sensibilità per mancanza di amplificazione (non è una reazione enzimatica) Monomerico, non richiede substrato, assente nei mammiferi, varianti con diversa di fluorescenza. fluorescent proteins (GFP, varianti RFP, BFP) Elevata attività endogena in alcuni tipi cellulari. Proteina di secrezione, saggio colorimetrico molto sensibile. Fosfatasi alcalina (Umana) Richiede laggiunta di cofattore, O 2, ATP. Alta attività specifica, mancanza di attività endogena (basso background) Luciferasi (Lucciola) Presenza di attività endogena in cellule di mammifero, enzima tetramerico (risposta non lineare) Ben caratterizzata, stabile, rilevazione automatizzabile B-Galattosidasi (Batterica) SVANTAGGIVANTAGGIGENE

5 fluorescent proteins La green fluorescent protein è una proteina naturale (prodotta dalla medusa Aequorea victoria) di piccole dimensioni (238 aa 26,9 kd) che se eccitata da una radiazione nel campo dellultravioletto ( 395 nm), ma anche del visibile ( 475 nm, colore blu) emette una radiazione di colore verde (505 nm) Osamu Shimomura Premio Nobel 2008

6 Fluoroforo di GFP è un tripepide Ser-deidroTyr-Gly che è ciclizzato: p-idrossibenzilidene-imidazolidone

7 Nella struttura tridimensionale della GFP alcuni residui basici fanno ponti a idrogeno con atomi di ossigeno (His148 con Tyr66 e Gln94 o Arg96 con l imidazolidone.) stabilizzando il fluoroforo Lemissione di luce avviene tramite un meccanismo sequenziale di un processo autocatalitico in assenza di cofattori. La reazione inizia con una rapida ciclizzazione tra la Ser65 e la Gly67 per formare un intermediato (imidazolin-5-one) seguita da una reazione di ossidazione della Tyr66. La reazione è termosensibile, ma una volta prodotta la GFP è molto stabile.

8 La proteina è stata cristallizzata e la sua struttura determinata. La GFP funziona in forma dimerica la struttura cilindrica è sostenuta da foglietti beta, le dimensioni del cilindro sono 30 Å di larghezza e 40 Å di lunghezza, segmenti ad alfa elica chiudono I cilindri da ambedue le parti e costituiscono lo scheletro per la formazione del fluoroforo che si trova al centro dei cilindri. Questa particolare struttura con fogietti beta esterni e alfa eliche interne forma una nuova classe di proteine denominata beta-can. Si tratta di una struttura molto stabile e difficilmente degradabile.

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10 La conoscenza della struttura ha permesso di generare una serie di mutanti, il primo dei quali è stata una muazione puntiforme (S65T) descritta da Roger Tsien nel 1995 che migliora le caratteristiche dello spettro di emissione (509 nm) con una fluorescenza più sostenuta e più stabile nel tempo e lo spostamento del picco di eccitazione a 488 nm. Negli anni a seguire, il gruppo di Tsien ha sviluppato una vastissima gamma di proteine fluorescenti (YFP, EBFP, EBFP2, citrine, Venus, ecc) Roger Tsien, premio Nobel 2008

11 Imaging dellespressione genica attraverso i sistemi reporter. Le proteine fluorescenti (GFP e BFP). Citosol BFP Golgi GFP

12 Le luciferasi sono una classe di enzimi ossidativi che agendo su un substrato specifico causano la produzione ( luciferasi di lucciola, e suoi derivati ricombinanti, Luc 2, ecc) ' (lucem ferre). Luciferasi luciferina + ATP luciferil adenilato + PP iATPPP i luciferil adenylato + O 2 ossiluciferina + AMP + fotoniO 2AMP

13 Utilizzo di proteine bioluminescenti o fluorescenti per studi di funzione geniche, di correlazioni-struttura-funzione, studi di regolazione di espressione genica

14 Lo studio della regolazione dellespressione genica. I sistemi reporter X Y Gene reporter Promotore Elementi di regolazione cis Z Elementi di regolazione trans Prodotto genico facilmente quantizzabile

15 Effetto di mutazioni specifiche sulla attività trascrizionale del recettore degli estrogeni

16 Un esempio storico. Lanalisi del promotore del gene tk del virus Herpes Simplex GCCCAATGCTATA Generazione di mutanti Trascrizione in oociti di Xenopus laevis Analisi di Northern

17 Studio di funzione genica: lesempio della identificazione della funzione di Nip-2 e protimosina

18 cnip 0.5nip 1.5nip 2.5 Cell death (dead cells/dish)x h24h48h nip2 mRNA Hours after Locke bnip-2 expression associates to cell death Nip-2 pro-apoptotic activity is blocked by overexpression of Bcl-2 mutants of nip-2 in the Bcl-2 binding domani fail to cause apoptosis Meda et al. 2001

19 CTRL BNIP2 CTRL BNIP2CTRL CTRL BNIP2 %survival % proliferation 0 0 TRANSFEZIONE DI bnip2/PROT-A cDNA IN MCF-7 CELLS apoptosi proliferazione

20 STUDI DI STRUTTURA- FUNZIONE

21 Greene et al. EMBO reports 8, 6, 563–568 (2007)

22 Structure of TFMPV-E2/ER ligand- binding domain. (A) The structure of one monomer of ER is shown as a ribbon diagram, with the bound GRIP1 coactivator peptide coloured red. The compound is shown in a stick representation, with carbon atoms coloured green, oxygen atoms coloured red and fluorine atoms coloured pink. (B) A stereo view of part of the ligand-binding pocket bound to oestradiol (top panels; Protein Data Bank code 1ERE), or TFMPV-E2 (bottom panels). The ligands are coloured green and are shown in a stick representation. (C) TFMPV-E2 is shown in a 2F o –F c electron density map, contoured to 1.5. ER, oestrogen receptor ; GRIP, glutamate receptor interacting protein; TFMPV-E2, trifluoromethyl-substituted phenylvinyl oestradiol compound Greene et al. EMBO reports 8, 6, 563–568 (2007)

23 Applicazioni dellingegneria cellulare. RICERCA DI BASE APPLICAZIONI INDUSTRIALI Screening di molecole farmacologicamente attive (HTS) Produzione di biofarmaci Studio della regolazione dellespressione genica. Analisi di mutazioni di elementi cis e trans Analisi struttura funzione delle proteine eucariote Riconoscimento della funzione di una proteina (oncogeni, geni oncosoppressori)

24 Screening di molecole farmacologicamente attive. ER cDNA ERELUC Potenziali ligandi CTR E2E2 LUC Units LUC ER

25 High-throughput Screening (1) La possibilità di automatizzare la detezione del reporter consente uno screening ad alto flusso. Library di molecole Saggio biologico automatizzabile Piattaforma Robotizzata Elaborazione digitale dei dati

26 High-throughput Screening (2) ricercatori1.5 milioni di molecole/anno Oggi. 4 ricercatori2.5 milioni di molecole/anno I più moderni saggi di screening consentono la determinazione della POTENZA e della SPECIFICITA della sostanza testata.

27 Applicazioni dellingegneria cellulare. RICERCA DI BASE APPLICAZIONI INDUSTRIALI Screening di molecole farmacologicamente attive (HTS) Produzione di biofarmaci Studio della regolazione dellespressione genica. Analisi di mutazioni di elementi cis e trans Analisi struttura funzione delle proteine eucariote Riconoscimento della funzione di una proteina (oncogeni, geni oncosoppressori)

28 Produzione di biofarmaci La produzione delle proteine terapeutiche in microorganismi non è sempre possibile soprattutto per le modificazioni post-traduzionali Lutilizzo di cellule animali consente di ottenere prodotti proteici strutturalmente più simili al fisiologico, ma pone serie difficoltà tecniche e costi più elevati.

29 IMPIANTO DI FERMENTAZIONE PER LA PRODUZIONE DI PROTEINE TERAPEUTICHE

30 Difficoltà nella produzione di biofarmaci Istituzione di Master cell banks caratterizzate in dettaglio per stabilità genetica, tempi di crescita, contaminazioni, numero di copie del vettore, livello di espressione del transgene. Preparazione di Manufacturers cell banks sottoposte ad ulteriore caratterizzazione prima e dopo il caricamente nellimpianto pilota Controllo su larga scala della stabilità nelle condizioni di fermentazione, con la preparazione di Extended cell banks. Controllo delle condizioni di produzione Recupero e produzione Caratterizzazione del prodotto CONTROLLO QUALITA

31 Controllo di qualità di proteine terapeutiche Spettrometria di massa Presenza di DNA cellulare Presenza pirogeni Presenza di proteine cellulari Presenza di proteine seriche HPLC SDS PAGE/Western Determinazione dello stato di purezza Composizione in acido sialico Composizione in carboidrati Sequenziamento N-terminale Mappa peptidica HPLC Isoelectrofocusing SDS PAGE Western Saggio immunologico Saggio biologico Caratterizzazione della proteina

32 TPA ricombinante Il primo farmaco ricombinante prodotto in cellule di mammifero Cellule CHO (Chinese Hamster Ovary) Pregressa conoscenza nella produzione di vaccini Assenza di attività tossica per luomo Stabile integrazione di geni eterologhi Crescita in sospensione o monostrato Modificazioni post-traduzionali corrette

33 Alcuni esempi di proteine terapeutiche in commercio BHK (Baby Hamster Kidney cells) Fattore VII CHOGlucocerebrosidasi CHOEritropoietina CHOInterferone beta CHOFSH E.ColiG-CSF E.ColiIL-2 E.ColihGH E.ColiInterferone alfa E.ColiInsulina E.Coli, CHOTPA


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