La presentazione è in caricamento. Aspetta per favore

La presentazione è in caricamento. Aspetta per favore

Adriana Maggi METODOLOGIE DI IMAGING PER LO STUDIO DI EVENTI MOLECOLARI IN ORGANISMI VIVENTI.

Presentazioni simili


Presentazione sul tema: "Adriana Maggi METODOLOGIE DI IMAGING PER LO STUDIO DI EVENTI MOLECOLARI IN ORGANISMI VIVENTI."— Transcript della presentazione:

1 Adriana Maggi METODOLOGIE DI IMAGING PER LO STUDIO DI EVENTI MOLECOLARI IN ORGANISMI VIVENTI

2 LIMAGING FUNZIONALE PERMETTE DI STUDIARE EVENTI MOLECOLARI IN CELLULE E ORGANISMI MULTICELLULARI CON LAPPLICAZIONE DI SISTEMI REPORTER

3 SISTEMA REPORTER = MOLECOLE FACILMENTE VIASUALIZZABILI E MISURABILI CHE RIPRODUCONO FEDELMENTE LEVENTO MOLECOLARE IN STUDIO Atr i reporter più uilizzati: Tra i reporter più utilizzati: cloramfenicolo acetiltransferasi, fosfatasi alcalina, beta galattosidasi, beta-glucuronidasi, luciferasi, proteina verde fluorescente

4 β-glucuronidasi: un enzima presente in vertebrati e molluschi che agendo su substrati incolori quali: 5-bromo-4-cloro-3-indolil-glucuronide determina la formazione di un composto di colore blu 4-metlbelliferil-beta-D-glucuronide determina la formazione di un composto fluorescente Cloramfenicolo acetiltransferasi: un enzima di origine batterica in grado di transferire un gruppo acetilico da acetil- COA (radioattivo) al cloramfenicolo β-galactosidase un enzima idrolitico che agisce sul substrato X-gal trasformandolo in galattosio e 5-bromo-4-chloro-3-hydroxyindole che, ossidato a 5,5'-dibromo-4,4'-dichloro-indigo produce un prodotto insolubile di colore blu

5 Low sensitivity in the absence of enhancer (this is not an enzymatic reaction) Monomeric, no substrate required, not expressed in mammalian, variants with different of emission Green fluorescent protein (GFP, and variants RFP, BFP) Very high background in selected cell types Secreted protein, enzymatic assay extremely sensitive. Fosfatase (human) Detection needs the cofactor O 2, ATP. Substrate quite expensive High specific activity, very low background) Luciferase (insect) Presence of endogenous activity in mammalian cells, tetrameric enzymes- non linear response Well characterized, stable, low cost substrate, detectable by automtized systems B- Galattosidase (Bacateria) DISADVANTAGESADVANTAGESGENE

6 Reporter bioluminescenti e fluorescenti

7 Tipiche molecole reporter per imaging sono: Molecole fluorescenti (GFP, YFP, others), proteine strutturalmente omologhe contenenti sequenze di tre aa in grado di funzionare da cromoforo Molecole bioluminescenti (fotoproteine e luciferasi) proteine che diventano/emettono particelle luminose in prsenza di specifici cofattori o substrati

8 Green fluorescent protein (GFP) di medusa (Aequrea victoria) Una proteina composta da 238 aa la cui struttura spaziale determina la formazione di una struttura a forma di lattina di birra al cui interno risiede il cromoforo (un tripeptide formato da serine 65, tyrosine 66, glycine 67 ). Lemissione è a = 504 nm)

9 Discosoma red fluorescent protein chromophore The Zoanthus yellow fluorescent protein chromophore Anemonia sulcata "kindling" fluorescent protein Trachyphyllia geoffroyi "Kaede" red fluorescent protein chromophore Natural Fluorescent proteins

10 Synthetic Fluorescent proteins

11 luciferin + ATP luciferyl adenylate + Pp i luciferyl adenylate + O 2 oxyluciferin + AMP + light La reazione catalizzata dalla luciferasi consiste in due passaggi:

12 Nel caso della celentrazina, il Ca++ causa un cambiamento conformazionale che destabilizza la perossi-celentrazina con conseguente ciclizzazione, decarbossillazione ed emissione di Co2 e bioluminescenza

13 I sistemi reporter nello studio della regolazione dellespressione genica Con i sistemi reporter è possibile studiare sia gli elementi cis che trans di regolazione della trascrizione. Inoltre è possibile effettuare lo screening di molecole in grado di interferire con lespressione del gene reporter. Questo principio può essere esteso agli animali transgenici X Y Gene reporter Promotore Elementi di regolazione cis Z Elementi di regolazione trans Proteina facilmente dosabile

14 Identificazione di molecole attive su fattori di trascrizione. ER cDNA ERELUC Potenziali ligandi CTR E2E2 LUC Units LUC ER

15 I sistemi reporter nello studio di rilascio/sintesi di trasduttori del segnale

16 I sistemi reporter nello studio di interazioni tra proteine

17 GENERAZIONE DI SISTEMI REPORTER Ingegneria Cellulare Modificazione del genoma di cellule in coltura mediante mutazioni del genoma stesso o mediante linserimento di DNA esogeno

18 La scelta del sistema cellulare coltura primaria cellula immortalizzata linea tumorale

19 Transfezioni stabili o transienti Transfezioni transienti: il gene esogeno entra nel nucleo e viene trascritto dalla RNA pol II ma non si integra nel genoma della cellula transfettata. Viene perduto dopo pochi cicli replicativi Transfezioni stabili: il gene esogeno viene integrato nel genoma della cellula ed in presenza di una adeguata pressione selettiva viene mantenuto per numerosi passaggi in coltura. La probabilità di integrazione stabile è dellordine di 10 -4, sul totale delle cellule transfettate

20 Scelta della tecnica di transfezione Microiniezione Adsorbimento mediante DEAE-Destrano Coprecipitazione con calcio fosfato Lipofezione Elettroporazione Infezione con vettori virali

21 Imaging dellespressione genica attraverso i sistemi reporter. Le proteine fluorescenti (GFP e BFP). Citosol BFP Golgi GFP


Scaricare ppt "Adriana Maggi METODOLOGIE DI IMAGING PER LO STUDIO DI EVENTI MOLECOLARI IN ORGANISMI VIVENTI."

Presentazioni simili


Annunci Google