La presentazione è in caricamento. Aspetta per favore

La presentazione è in caricamento. Aspetta per favore

BASI MOLECOLARI DELLAZIONE DEL FARMACO BIOTECNOLOGIE FARMACOLOGICHE LEZIONE 4 CORSO DI LAUREA SPECIALISTICA IN BIOTECNOLOGIE DEL FARMACO Adriana Maggi.

Presentazioni simili


Presentazione sul tema: "BASI MOLECOLARI DELLAZIONE DEL FARMACO BIOTECNOLOGIE FARMACOLOGICHE LEZIONE 4 CORSO DI LAUREA SPECIALISTICA IN BIOTECNOLOGIE DEL FARMACO Adriana Maggi."— Transcript della presentazione:

1 BASI MOLECOLARI DELLAZIONE DEL FARMACO BIOTECNOLOGIE FARMACOLOGICHE LEZIONE 4 CORSO DI LAUREA SPECIALISTICA IN BIOTECNOLOGIE DEL FARMACO Adriana Maggi

2 STUDIO DELLA FUNZIONE GENICA

3 ARRAY MACROARRAY MICROARRAY

4 DNA microarray (o gene/genome chip, DNA chip, o gene array) è una collezione di depositi puntiformi di DNA, ciascun punto rapresentante un singolo gene immobilizzati su un supporto (vetro, plastica o silicone) mediante legami di tipo irreversibile.genegenome Esempio di microarray con oligo immobilizzati su supporto solido e ibridati con cDNA

5 APPLICAZIONI DI ARRAY: SNP detection arrays – per identificare Single nucleotide polymorphism nel genoma di diverse popolazioni SNP detection arraysSingle nucleotide polymorphism comparative genomic hybridization (Array CGH) – per identificare riarragiamenti coinvolgenti un numero significtativo di basi comparative genomic hybridization mRNA or gene expression profiling – per studiare I livelli di espressione di migliaia di geni simultaneamente mRNAexpression profiling Chromatin immunoprecipitation (chIP) studies – per determinare il legame di specifche proteine in porzioni specifiche del DNA (ChIP-on-chip technology) Chromatin immunoprecipitationChIP-on-chip

6 Siti polimorfici per singola sostituzione di base (SNP) di base Nel genoma umano ci sono SNP allinterno di sequenze codificanti, alcuni di questi possono essere marcatori di patologia polimorfismo a singolo nucleotide

7 Gli SNP sono la causa di circa il 90% della variabilità genetica umana ed in genere si trova uno SNP ogni pb. 2/3 SNP vedono sostituita la C con T. Siti polimorfici per singola sostituzione di base (SNP) Individuo 1 Individuo 2 Perchè una variazione possa essere considerata un SNP deve essere presente in almeno l1% della popolazione

8 Metodi di identificazione di SNP

9 IBRIDAZIONE ALLELE-SPECIFICA

10 REAZIONE DI ELONGAZIONE DI PRIMER FISSATO SU SUPPORTO SOLIDO

11 AT CG TAGC TA 5 GC3 TG 5 AC3 DNA is denatured and mixed with oligonudeotides and ligase. The ligase joins pairs of oligonudeotides annealed head to tail if they are correctly base-paired at the junction. Radioactively labeled oligonudeotides (*) are immobilized and detected by autoradiography only if ligated to biotinylated oligonucleotides (B) that can be bound to streptavidin on a solid support. LANDEGREN, et al. Science 1998

12 Michiel J. T. van Eijk *, et al. NAR 2004

13 BANCHE DATI E IDENTIFICAZIONE DI SNP dbSNP sono presenti (annotati) in diverse banche dati quali: PubMed, genome project sequences, GenBank records, the Entrez Gene database, and the dbSTS database of sequence tagged sites.

14 mRNAmRNA or gene expression profilingexpression profiling

15

16

17 Clustered Image Maps Drugs x Cells Genes x Cells Genes x Drugs

18 Database Microarray Experiment Sets Sample Profiles Genomics and bioinformatics group NCI and NIH

19 Studio di proteine che interagiscono con DNA

20 ChIP-on-chip (o ChIP-chip) è una tecnica che combina la immunoprecipitazione di cromatina (chromatin immunoprecipitation "ChIP con la tecnologia del micro array(microarray technology chip").chromatin immunoprecipitationmicroarray technology

21 Chip-on-chip analysis per lo studio delle interazioni DNA proteine

22

23 read-out Normalizzazione dei dati e analisi esplorativa dei dati estrazione delle informazioni Sito DNA arricchimento proteina di interesse

24 Le prime analisi si sono focalizzate sulle differenze tra animali in Proestro e Metestro, per vedere se la differenza dei livelli di Estradiolo circolante avesse degli effetti sullespressione genica. Come atteso, gli animali LID non mostrano nessuna significativa differenza nellespressione genica nelle due fasi del ciclo, come se questultimo fosse appiattito. Gli animali WT, al contrario, mostrano deboli ma rilevabili differenze nelle due fasi; tuttavia, il quadro osservato e totalmente inatteso, in quanto i geni differenzialmente espressi sono tutti geni MAGGIORMENTE espressi nella fase di metestro o, guardando allinverso, downregolati nella fase di Proestro. Considerando cio che abbiamo sempre osservato, vale a dire unattivazione del recettore degli estrogeni in fase di proestro, questo stupisce. WT M vs WT PWT P vs WT M Downregulated in P Upregulated in M SEM Analysis

25 GO Term Analysis Una volta identificati i trascritti differenzialmente espressi nei due gruppi (t test & SAM analysis, tenendo in considerazione solo quelli con Fold Indution >=1,5), si cerca di capire se questi geni sono implicati in determinati Biological Process o hanno particolari Molecular Function o interferiscono in un determinato Pathway. Questa analisi si puo fare a diversi livelli, i risultati riportati si riferiscono ad un livello piuttosto superficiale, ma per questo piu generale e credo indicativo. Riporto: - BP = Biological Process - MF = Molecular Function - Pathway Lanalisi e stata fatta principalmente con DAVID piu molti altri software e websites (le risorse sono infinite)

26 I geni per ogni categoria sono nel file Excel Panther_BP_WTall_vs_LIDAll.xls Biological Process - WTall vs LIDall Considerando tutti i trascritti differentemente espressi, sia upregolati che downregolati.

27 Molecular Function - WTall vs LIDall I geni per ogni categoria sono nel file Excel Panther_MF_WTAll_vs_LIDAll.xls

28 Gene Ontology Un progetto atto a costruire un vocabolario per descrivere geni e prodotti genici attribuibili a ogni organismo Ogni gene/proteina si contraddistingue per un numero identificativo unico (GO:nnnnnnn) e un nome (es: cellula, fibroblasto, fattore di crescita, trasduttore del segnale). Ogni termine viene assegnato a una delle tre suddivisioni della banca (ontology): 1.Funzioni molecolari 2.Componenti cellulari 3.Componenti I processi biologici Questo vocabolario serve per dare un unico nome a un specifico prodotto in modo che questi così compaia nelle diverse banche dati e possa venire rapidamente ritrovato

29 The three organizing principles of GO are cellular component, biological process and molecular function. A gene product might be associated with or located in one or more cellular components; it is active in one or more biological processes, during which it performs one or more molecular functions. For example, the gene product cytochrome c can be described by the molecular function term oxidoreductase activity, the biological process terms oxidative phosphorylation and induction of cell death, and the cellular component terms mitochondrial matrix and mitochondrial inner membrane.

30 Topology The ontologies are structured as directed acyclic graphs, which are similar to hierarchies but differ in that a more specialized term (child) can be related to more than one less specialized term (parent). For example, the biological process term hexose biosynthetic process has two parents, hexose metabolic process and monosaccharide biosynthetic process. This is because biosynthetic process is a type of metabolic process and a hexose is a type of monosaccharide. When any gene involved in hexose biosynthetic process is annotated to this term, it is automatically annotated to both hexose metabolic process and monosaccharide biosynthetic process.

31 I LIMITI DELLA ANALISI GENOMICA: RIPRODUCIBILITA ANALISI NON QUANTITATIVA I mRNA NON RIFLETTONO ESATTAMENTE LE PROTEINE PRESENTI NELLA CELLULA

32 proteomica Il fine della proteomica consiste nella completa identificazione delle proteine e della loro espressione in determinati cellule o tessuti La metodologia su cui si basa la proteomica comprende: gel elettroforesi bidimensionale; HPLC e spettrometria di massa

33 (20,000 to 25,000 genes vs. > 500,000 proteins). E stato calcolato che il corpo umano puo esprimere fino a 2 milioni di proteine, ciascuna con differenti funzioni

34 I metodi della proteomica dagli anni 70: gel elettroforesi bidimensionale Limiti di definizione e riproducibilità Anni 90 spettrometria di massa con metodi di ionizzazione alternativi (electrospray o MALDI Matrix Assisted Laser Desorption Ionization ) Non si amplificano le proteine: dimensione campioni Identificazione dei peptidi da miscele complesse Rapidità Analisi quantitativa Limiti nelle conoscenze di genomi da diversi organismi Disponibilità di strumentazione

35 electrospray ionization liquid chromatography mass spectrometry

36 John Bennett FennJohn Bennett Fenn ha ricevuto il premio Nobel per la chimica nel 2002 per lo sviluppo della tecnica di elettrospray per lanalisi di macromolecole biologiche

37 Stable isotope labeling with amino acids in cell culture (SILAC) per analisi proteomica quantitativa

38

39 Mann Nature Reviews Molecular Cell Biology 7, 952–958 (December 2006) | doi: /nrm2067 Functional and quantitative proteomics using SILAC SILAC (Stable isotope labelling with amino acids in cell culture)

40 Proteomica e trascrittomica a confronto Uno studio in cui si sono comparati i dati di analisi di cellule MCF-7 Su un totale di 7278 geni identificati in modo univoco come messaggi o proteine 55% provengono da analisi proteomica 77% provengono da microarray

41 LE PROSPETTIVE DELLA PROTEOMICA: continuo progresso della tecnologia per misure sempre più su larga scala e rapide costruzione di banche dati protomica interviene in cellule dove mRNA non è informativo (es cellule ematiche) La misura proteomica fornisce lend point, il microarray va verificato con qPCR e da western La proteomica permette di studiare la presenza di modificazioni post-traduzionali, di interazioni proteina-proteina

42

43

44 INTERATTOMICA analisi del trascrittoma, del proteoma e dellinterattoma comparati per arrivare a definire le funzioni fisiologiche di ciascun gene

45 LINTERATTOMA O BIOLOGIA DEI SISTEMI (system biology)

46 Per grafico intendiamo un insieme di punti, nodi o vertici che sono tra loro collegati non in modo unidirezionale. Nel digrafico la direzionalità o bidirezionalità dellevento è segnata Linterattoma rappresenta interazioni molecolari con un sistema digrafico

47

48 OMICS APPLICAZIONI MEDICHE Test genetici Terapia genica Farmacogenomica Informazioni sulla malattia


Scaricare ppt "BASI MOLECOLARI DELLAZIONE DEL FARMACO BIOTECNOLOGIE FARMACOLOGICHE LEZIONE 4 CORSO DI LAUREA SPECIALISTICA IN BIOTECNOLOGIE DEL FARMACO Adriana Maggi."

Presentazioni simili


Annunci Google