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BIOCATALISIBIOCATALISI A. 2008 -2009 Dr. Davide Tessaro Lezione 4: Enzimi redox: ossidasi ed ossigenasi.

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1 BIOCATALISIBIOCATALISI A Dr. Davide Tessaro Lezione 4: Enzimi redox: ossidasi ed ossigenasi

2 Enzimi redox

3 Le flavine Sono un gruppo prostetico che conferisce allenzima un colore giallo. Le flavine sono solitamente strettamente legate (anche covalentemente) allenzima. Possono effettuare redox monoelettroniche (il radicale semichinonico è stabile). Questo permette loro di reagire con lossigeno (che è un diradicale). Hanno bisogno di essere rigenerate dopo la reazione.

4 Rigenerazione con O 2 Per esempio: D-ammino acido ossidasi (D-AAO)

5 D-AAO Enzima per detossificazione D-AA sia endogeni che esogeni Utile per deracemizzazione AAs:

6 Ancora 7-ACA Enzima: D-AAO da Trigonopsis variabilis, pH 7.3, 25°C 200 t/anno Tempo di residenza: 1.5 h Il prodotto, in presenza del perossido di idrogeno prodotto, decarbossila spontaneamente dando glutaril-7-ACA

7 Ancora 7-ACA Ad altra fase del processo

8 Ancora 7-ACA Glutaril amidasi (o acilasi) da E. coli, pH 8.3, 30°C, immobilizzato su carrier sferico 200 t annue Tempo di residenza 1.5 ore Downstream: cristallizzazione

9 Ancora 7-ACA Vantaggi biocatalisi: no metalli pesanti (Zn) no solv. clorurati no composti infiammabili condizioni blande emissione gas 7.5 kg 1.0 kg smaltimento acque madri: 29 t 0.3 t Costo ambientale ridotto del 90%

10 Le monoossigenasi Catalizzano reazioni del tipo: Sub + DonH 2 + O 2 SubO + Don + H 2 O È come se stabilizzassero e facessero reagire lossigeno monoatomico

11 MO: ossidazione eteroatomi Prendiamo, ad esempio, i solfossidi chirali modafinil

12 MO tipo Baeyer-Villiger Catalizzano reazioni tipo Baeyer-Villiger su composti carbonilici, ne esistono di più tipi. Tipo 1: cofattore NADPH e gruppo prostetico FADH 2 Intermedio tipo Criegee

13 BV-MOs: il processo Due enzimi consecutivi con riciclo cofattori:

14 BV-MOs: prodotti Lattoni normali Lattoni anormali

15 BV-MOs: un esempio 25% e.e. 74% 30% e.e. 95%

16 MO per idrossilazione fenoli Esempio: processo Fluka Whole cells in ambiente acquoso Substrato e prodotto sono molto tossici per le cellule: vanno mantenute basse conc. (processo fed-batch). Inoltre, il prodotto polimerizza spontaneamente. Si utilizza una resina adsorbente (XAD-4, polistirenica) in un letto flluidizzato. Il prodotto viene liberato dalla resina tramite lavaggio con etanolo acidificato per venire poi cristallizzato da n-esano. Altri prodotti:

17 MO per idrossilazione fenoli Conv. 97%, resa 83%, selettività 85%, purezza 77% (98% dopo XX) Capacità: 300 L Tempo di residenza: 10 h Loop: 10 (V reatt /h) STY: 8 g/(L*d) Catecoli 3-sostituiti: intermedi per farmaceutici e chimica supramolecolare

18 MO CytP 450 dipendenti Catalizzano C-H C-O-H

19 CytP 450 -MO: esempi

20 MO per epossidazione alcheni Di solito non si usano enzimi isolati: sono delicati e richiedono NAD(P)H come cofattore (necessità riciclo) I prodotti sono altamente reattivi, e quindi tossici per la cellula La cellula, facilmente, esprime anche attività di epossido idrolasi È necessaria, quindi, molta accortezza nel design del sistema: si utilizza unaltra fase (solvente apolare) per mantenere basse le conc. delle sostanze e per controllare il decorso della reazione

21 MO per epox: esempi Processo Nippon mining Catalizzatore: whole cells di Nocardia corallina B276, T = 30°C Range substrati:

22 MO per epox: esempi Conv: fino al 98% Resa: fino al 92% Selettività: fino al 94% e.e.: 80-97% STY: > 0.2 mol / (L*d) Processo Nippon mining

23 MO per epox: esempi Uso dei prodotti:

24 MO per epox: esempi Processo Shell-Brocades Whole cells di Pseudomonas oleovorans T = 37°C Conc = 7 g/L e.e. P > 99.9% Precursori di beta bloccanti

25 Diossigenasi È come se stabilizzassero e facessero reagire la molecola di O 2 in stato di singoletto

26 Diossigenasi su aromatici Pathway di degradazione aromatici nei procarioti. Gli eucarioti hanno monossigenasi seguita da epossido idrolasi (già visto). Per sfruttare il potenziale sintetico bisogna bloccare la deidrogenazione del diolo.

27 Diossigenasi: esempio Esempio: produzione indaco Isatis tinctoriaMurex trunculus Indigofera tinctoria

28 Diossigenasi: esempio Indaco: sintesi chimica

29 Diossigenasi: esempio Indaco: sintesi biocatalitica (Genencor) Enzima da P. putida Alternativa: enzima da P. mendocina


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