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1 Facoltà di Farmacia LEZIONI DI BIOLOGIA ANIMALE E MICROBIOLOGIA VIROLOGIA AA 2006 2007.

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1 1 Facoltà di Farmacia LEZIONI DI BIOLOGIA ANIMALE E MICROBIOLOGIA VIROLOGIA AA

2 2 Generalità sui virus I virus sono agenti patogeni entità acellulari formati da una o più molecole di DNA o RNA racchiuse in un involucro proteico in grado di infettare cellule animali e vegetali e batteri. I virus sono agenti patogeni entità acellulari formati da una o più molecole di DNA o RNA racchiuse in un involucro proteico in grado di infettare cellule animali e vegetali e batteri. Le particelle virali complete sono contraddistinte da dimensioni molto modeste (da 10 a 300 nm). Le particelle virali complete sono contraddistinte da dimensioni molto modeste (da 10 a 300 nm). Si possono replicare allinterno di cellule viventi e quindi sono dei parassiti intracellulari obbligati Si possono replicare allinterno di cellule viventi e quindi sono dei parassiti intracellulari obbligati La morfologia dei i virus può essere studiata attraverso luso del microscopio elettronico La morfologia dei i virus può essere studiata attraverso luso del microscopio elettronico La replicazione dei virus avviene nellorganismo di animali suscettibili allinfezione, e sperimentalmente, per inoculazione in animali da laboratorio in uova embrionate di pollo o in colture cellulari La replicazione dei virus avviene nellorganismo di animali suscettibili allinfezione, e sperimentalmente, per inoculazione in animali da laboratorio in uova embrionate di pollo o in colture cellulari I costituenti essenziali sono ac. nucleici e proteine. I costituenti essenziali sono ac. nucleici e proteine.

3 In tutti i virus è presente un nucleocapside costituito da un ac. Nucleico avvolto da un capside proteico con struttura elicoidale, complessa, icosaedrica.

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8 8 Terminologia core : ac. nucleico + molecola di natura proteica che determina la stabilità dellacido. capside : struttura proteica che racchiude lac. nucleico o il core. capsomero: unità proteica che ripetuta forma il capside non sono legati da legami covalenti. nucleocapside: ac. nucleico + capside. envelope: involucro lipoglicoproteico esterno (ortho- e paramyxo- virus) peplomeri: (neuroamminidasi ed emoagglutinina): proiezioni superficiali che protrudono dallenvelope. le emoagglutinine sono strutture a bastoncino con attività emoagglutinante mentre le neuroamminidasi hanno attività enzimatica. virione: particella virale completa come si può osservare fuori dalla cellula.

9 9 I genomi virali sono più differenziati ed eterogenei di quelli procariotici ed eucariotici e possono consistere in uno o due filamenti di DNA o RNA, i filamenti di ac. Nucleico sono lineari, circolari o tali da assumere entrambe le forme. I genomi virali sono più differenziati ed eterogenei di quelli procariotici ed eucariotici e possono consistere in uno o due filamenti di DNA o RNA, i filamenti di ac. Nucleico sono lineari, circolari o tali da assumere entrambe le forme. I virus sono classificati in base alle caratteristiche degli ac. Nucleici alla simmetria del capside, alleventuale presenza di un involucro, al tipo di ospite infettato, alle patologie provocate, in caso di virus animali e vegetali. I virus sono classificati in base alle caratteristiche degli ac. Nucleici alla simmetria del capside, alleventuale presenza di un involucro, al tipo di ospite infettato, alle patologie provocate, in caso di virus animali e vegetali.

10 10 Composizione chimica Acidi nucleici e proteine sono i componenti principali della struttura virale. La tecnica che permette la purificazione dei virus è la ultracentrifugazione in gradiente di densità, questa tecnica permette la separazione di particelle fagiche che sono differenti anche per percentuali dell 1% di DNA.. Le proteine virali possono essere suddivise in tre classi: proteine che permettono all Acido Nucleico di replicarsi, proteine strutturali, che sono costituenti del capside o sono emoagglutinine, proteine che alterano alcune funzioni e strutture della cellula ospite, bloccano ad esempio la trascrizione del DNA cellulare e lasciando così i ribosomi a disposizione dell RNA virale.

11 11 Replicazione e caratteristiche virali Il capside è formato da subunità proteiche che in alcuni virus si aggregano a formare i capsomeri, con peso molecolare tra 10 e 80 KDA (1 Dalton= 1/6 della massa atomica dellossigeno 1,66x g ). Non sempre tutte le proteine che si trovano nel virus entrano nella formazione del capside a volte esse sono devolute a funzioni di stabilizzazione dellacido nucleico si tratta delle cosiddette proteine interne in stretta relazione con lacido nucleico. I virus posseggono una molecola di DNA il cui peso molecolare è 1,5 a 240 x 10 6 daltons (poxvirus), di solito si tratta di un doppio filamento in genere lineare. Per lRNA virale quasi sempre si tratta di un filamento a catena singola con peso molecolare da 2,4 a x 10 6 daltons. Non sempre è presente in un unica molecola ma viene spesso estratto in frammenti. Nei virioni sono presenti altri costituenti che contengono elevate quantità di lipidi. Questi lipidi sono identici a quelli della cellula dove il virus si è replicato. La quantità di materiale genetico presente è in diretta relazione con il grado di complessità della particella virale. In alcune specie sono presenti rame, biotina, Fad (ruolo funzionale sconosciuto).

12 12 COSTRUZIONE VIRALE vengono codificati solo pochi peptidi o anche uno solo. vengono codificati solo pochi peptidi o anche uno solo. non viene richiesta informazione supplementare per lassemblaggio delle subunità virali. non viene richiesta informazione supplementare per lassemblaggio delle subunità virali. un meccanismo di rigetto è attivo per le subunità non funzionanti. un meccanismo di rigetto è attivo per le subunità non funzionanti. La struttura virale è formata da subunità uguali che vengono ripetute (nei virus a forma icosaedrica) infatti è più efficiente costruire strutture complesse e più grandi a partire da subunità tutte uguali e più piccole.

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14 14 CRONOLOGIA DELLE SCOPERTE IN VIROLOGIA studi sullafta epizootica e sul mosaico del tabacco (Ivanovsky e Beijerink) dimostrano che queste malattie erano causate da subunità microscopiche che non potevano essere osservate e coltivate come batteri e funghi. Risolutivo fu lo studio sul mosaico del tabacco, si dimostrò che esistevano subunità microscopiche che attraversavano i filtri per batteriologia è quindi presenti in una soluzione capce di infettare un0altra pianta di tabacco ROUS SCOPRE IL VIRUS DEL TUMORE DEI POLLI SCOPERTA DEI BATTERIOFAGI E RAPPORTI TRA CELLULA OSPITE E BATTERIOFAGO COLTURE CELLULARI VIVENTI IMPIEGATE NELLO STUDIO DELLE INFEZIONI VIRALI DELLUOMO IMPIEGO DELLA MICROSCOPIA ELETTRONICA AC. NUCLEICI E INFEZIONE VIRALE(HERSHEY E CHASE) DIMOSTRAZIONE DELLESISTENZA DI UN ENZIMA VIRALE CHE IMPIEGA STAMPI DI RNA PER SINTETIZZARE DNA, LA TRASCRITTASI INVERSA. NEGLI ULTIMI 30 ANNI MESSA A PUNTO DI VACCINI ANTIVIRALI E IMPIEGO DEI VIRUS NELLE BIOTECNOLOGIE E NELLA CURA DELLE MALATTIE.

15 15 Interazione del virus con la cellula ospite Adsorbimento: interazione tra strutture superficiali del virione e le strutture della cellula. Adsorbimento: interazione tra strutture superficiali del virione e le strutture della cellula. Penetrazione (periodo di eclissi) e svestimento. Penetrazione (periodo di eclissi) e svestimento. Replicazione (diversi tipi di replicazione). Replicazione (diversi tipi di replicazione). Maturazione (aggregazione spontanea del materiale genetico con le componenti). Maturazione (aggregazione spontanea del materiale genetico con le componenti). Liberazione (periodo di latenza) Liberazione (periodo di latenza)

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18 18 GEMMAZIONE PROTEINE DELLA MATRICE E PEPLOMERI GEMMAZIONE ATTRAVERSO APPARATO DEL GOLGI E IL RER

19 19 ADSORBIMENTO E PENETRAZIONE Il meccanismo di adsorbimento è interamente devoluto al riconoscimento di siti specifici, da parte delle fibre che si distendono ed ancorano il fago al batterio, in un secondo momento gli aculei portano a contatto la piastra basale con la parete batterica, la guaina si contrae e forza la coda a penetrare, lazione della coda è facilitata dalla presenza di un enzima (lisozima) infine il DNA fagico penetra attraverso il canale.

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21 21 RAPPRESENTAZIONE SCHEMATICA DEI CICLI REPLICATIVI (assenza di integrazione nel DNA della cellula ospite) Rappresentazione schematica del ciclo replicativo di un virus a DNA doppio filamento. Rappresentazione schematica del ciclo replicativo di un virus a RNA singolo filamento. ( Il filamento viene replicato per intervento di un filamento complementare e dà così origine ai genomi della progenie virale e nel contempo funge anche da RNA messaggero per la sintesi del capside virale. Le proteine dellenvelope si localizzano sulla membrana citoplasmatica della cellula infetta nei siti da cui usciranno le particelle virali che utilizzeranno la membrana modificata come envelope).

22 22 Integrazione nel DNA della cellula ospite

23 23 Coltivazione dei virus I virus non possono essere coltivati allesterno di cellule viventi, per molto tempo la loro coltivazione è stata fatta su uova embrionate di pollo o in animale. I virus non possono essere coltivati allesterno di cellule viventi, per molto tempo la loro coltivazione è stata fatta su uova embrionate di pollo o in animale. Attualmente i virus vengono coltivati su monostrati cellulari associati con antibiotici che ne evitano la contaminazione. Attualmente i virus vengono coltivati su monostrati cellulari associati con antibiotici che ne evitano la contaminazione. Nelle colture su monostrato cellulare compaiono aree di lisi definite placche che possono essere anche colorate. Nelle colture su monostrato cellulare compaiono aree di lisi definite placche che possono essere anche colorate. A volte non si ottengono regioni di lisi ma zone dove compaiono effetti citopatici ( a volte non accompagnati da placche). A volte non si ottengono regioni di lisi ma zone dove compaiono effetti citopatici ( a volte non accompagnati da placche). I batteriofagi vengono coltivati impiegando i batteri come coltura. I batteriofagi vengono coltivati impiegando i batteri come coltura. Una coltura batterica torbida a contatto con il fago diventa limpida in conseguenza dellattività litica Una coltura batterica torbida a contatto con il fago diventa limpida in conseguenza dellattività litica

24 24 Purificazione dei virus e metodi di saggio Centrifugazione differenziale e in gradiente di densità (basata sullimpiego di un gradiente di saccarosio con raccolta delle particelle virali) Centrifugazione differenziale e in gradiente di densità (basata sullimpiego di un gradiente di saccarosio con raccolta delle particelle virali) Precipitazione dei virus con solfato dammonio concentrato e raccolta mediante centrifugazione. Precipitazione dei virus con solfato dammonio concentrato e raccolta mediante centrifugazione. Denaturazione dei contaminanti con calore o pH. (tollerato dai virus). Denaturazione dei contaminanti con calore o pH. (tollerato dai virus). Digestione enzimatica delle componenti cellulari che non agiscono nei confronti delle particelle virali. Digestione enzimatica delle componenti cellulari che non agiscono nei confronti delle particelle virali.

25 25 Diagnostica virologica Saggio di emoagglutinazione. Basato sulla possibilità che i virus siano in grado di agglutinare i globuli rossi, fornendo un reticolo visibile in relazione alla loro diluizione, la diluizione virale più alta rappresenta il titolo virale. Conta delle placche, ogni placcasi origina dalla moltiplicazione virale. Conta delle particelle virali direttamente al microscopio elettronico Tecniche istopatologiche, sono le più antiche tra quelle usate nel laboratorio di virologia, si usa per questo un microscopio ottico (rabbia, corpi del Negri). Ricerca di antigeni virali: si utilizzano sieri policlonali o anticorpi monoclonali. Specifici per proteine costitutive o non costitutive del virus. Il limite sta nel fatto che non sempre si può disporre dellanticorpo voluto e che non sempre si ha chiaro il quadro eziologico della malattia. Microscopia elettronica: è una tecnica per individuare virus non noti o per ritrovare le particelle virali in colture di tessuto. Rimane comunque un metodo poco specifico e in parte anche poco sensibile. Metodi quantitativi e qualitativi per la ricerca di Ac. Nucleici virali : PCR, ibridizzazione,

26 26 Luso delle uova embrionate di pollo ha rappresentato un metodo adottato grandemente in passato per lo studio dei virus attualmente il mezzo fondamentale per lisolamento e la propagazione e lidentificazione dei virus animali, è il monostrato cellulare.

27 27 Le colture cellulari rappresentano attualmente il mezzo fondamentale per lisolamento e la propagazione e lidentificazione dei virus animali, con luso di metodi appropriati hanno consentito di condurre indagini sul ciclo replicativo e sulle caratteristiche genetiche dei diversi virus. Nelle colture cellulari infette i segni della moltiplicazione virale possono essere svelati con le procedure più diverse. Per molti agenti virali, si procede allesame microscopico diretto delle colture infette. La replicazione virale può indurre dei cambiamenti morfologici evidenti delle colture cellulari. Si parla di effetti citopatici, il tipo e la rapidità dello sviluppo sono di grande aiuto per identificare i virus. Leffetto citopatico più imponente è senza dubbio al lisi cellulare: un esempio è dato dagli enterovirus che producono dopo poche ore dallinfezione i cambiamenti morfologici della coltura. Dopo ore le colture cellulari vengono distrutte completamente.

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29 29 Epatiti virali Sono flogosi di natura infettiva che colpiscono il fegato. Sintomatologia soggettiva e oggettiva sfumata con forme fulminanti acute e croniche che possono esitare in cirrosi e carcinoma epatocellulare. I virus che possono determinare le epatiti virali si distinguono in minori e maggiori. I virus maggiori sono diversi tra loro non correlati geneticamente, e responsabili dellepatite infettiva e alimentare.

30 30 VIRUS EPATITE VIRALE Virus A a RNA (HAV) Virus A a RNA (HAV) Virus B a DNA (HBV) Virus B a DNA (HBV) Virus C a RNA (HCV) Virus C a RNA (HCV) Virus δ a RNA (HDV) Virus δ a RNA (HDV) Virus E a RNA (HEV) Virus E a RNA (HEV) utilizza il capside del HBV per la sua replicazione

31 31 Epatite virale Lepatite A si trasmette per via oro fecale può contaminare acque e alimenti. Il virus dellepatite B è un hepadnavirus contiene tre antigeni di superficie, si trasmette per via parenterale, i 10% degli ammalati diventa portatore cronico, la diagnosi dimostra la presenza di precisi marcatori serici. I virus dellepatite delta, dell epatite c, sono virus a trasmissione parenterale. Il virus dellepatite in genere è un RNA virus che si trasmette in prevalenza con lingestione di acque infette, presente principalmente in Asia e Africa. E una malattia autolimitante.

32 32 CARATTERISTICHEEPATITE AEPATITE B Virione 27 nm; involucro assente;RNA; rassomiglia agli enterovirus 42 nm; involucro presente; DNA;unico Trasmissione Fecale - oraleIniezione parenterale ed altre Periodi di incubazione giorni giorni Periodo Autunno e invernoTutto lanno Epidemie SiNo Età di incidenza Più frequente nei bambini e nei giovani adultiTutte letà Caratteristiche della malattia Insorgenza acuta; comune la febbre > 38°; ittero, etc. Insorgenza insidiosa; la febbre > 38° è poco comune; ittero; immunocomplessi, etc.; più grave della forma A. Epatite fulminante Sino Epatite cronica attiva e cirrosi NoSi Virus nelle feci Dal periodo di incubazione fino a 1-2 settimane dopo la guarigione Assente Virus nel sangue Dal periodo di incubazione fino a 1-2 settimane dopo la guarigione Dal periodo di incubazione fino a mesi o anni dopo la guarigione HBsAg Assente Nel sangue giorni dopo linfezione; persiste da 60 giorni ad anni Validità della profilassi con γ globuline Buona Inefficace a meno che non siano presenti alti titoli di HbS Possibile causa di cancro al fegato nosi

33 33 EPATITE A PERIODO DI INCUBAZIONE GIORNI 4 6 SETTIMANE ITTERO, URINE SCURE, ETC. (O ASINTOMATICA)

34 34 EPATITE B PERIODO DI INCUBAZIONE GIORNI MESI O ANNI 4 6 SETTIMANE Antigeni di superficie: HBsAg HBcAg (core) HBeAg

35 35 Quadro sinottico degli aspetti clinici, epidemiologici e di decorso delle diverse epatiti virali ABCDE Incubazione in giorni Inizio DI SOLITO ACUTO DI SOLITO INSIDIOSO DI SOLITO ACUTO SINTOMATOLOGIA NON SPECIFICA E ITTERO DI SOLITO ACUTO Ittero 10% DA 15% A 20% VARIABILE25%IGNOTO Via di trasmissione orofecale CONSUETAASSENTE Via di trasmissione parenterale RARACONSUETA Altre vie di trasmissione ACQUA E CIBO (contaminazione fecale) ALTRI SECRETI(MUCOSITA) TRASMISSIONE PERINATALE RAPPORTI SESSUALI TRASMISSIONE MENO EFFICIENTE DI HBV IL RISCHIO AUMENTA CON LAUMENTO DEI RAPPORTI ACQUA E CIBO Portatore cronico ASSENTE5-10% DEI CASIPRESENTE CIRCA IL 50% DEI CASI IGNOTO Epatite cronica NESSUN CASO NOTO NESSUN CASO NOTO Mortalità 0,1 – 2% 0,5 – 2% ANCHE MAGGIORE PIU DEL 30% NELLE FORME CRONICHE DA 1 A 2% ANCHE MAGGIORE 20% NELLE GRAVIDE, DA 1 A 2% NELLA POPOLAZIONE GENERALE

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37 37 Complicanze da epatiti croniche Cirrosi epatica (lett. dal greco : kirr = giallastro + -osi = condizione). Malattia cronica del fegato, a varia etiologia (microrganismi, farmaci, alcol) con flogosi e necrosi del tessuto interstiziale, fibrosi e neoformazione di noduli di rigenerazione parenchimale; i noduli, esercitando compressione ostacolano il flusso venoso epatico ai lobuli con ipertensione portale come complicazione. Seguono nel tempo altre complicanze (ascite, splenomegalia). Epatocarcinoma (lett. dal greco : epar = fegato; karkin= granchio + oma). Tumore maligno del fegato originato dal tessuto epatico, può invadere ed ostruire la vena portale e vene sovraepatiche, causa nche metastasi al polmone ed ai linfonodi regionali. > frequenza in adulti con cirrosi epatica e epatite cronica b e c.

38 38 Ittero: condizione patologica caratterizzata da colorazione giallastra di cute, mucose e sclere che si verifica con bilirubinemia sup. a 2,5 mg/dl (v.n. fino a 1). Littero epatocellulare origina per lesione tossica o infettiva degli epatociti con insufficiente captazione e coniugazione di bilirubina che si accumula nel sangue, si ritrova nelle urine (mobilina) che si presentano color marsala. Epidemia : manifestazione a carattere episodico di una malattia, che si diffonde con frequenza più elevata rispetto ai casi attesi (indice di incidenza); in un certo tempo e area valutata per una data popolazione (es. epidemia influenzale). Limportanza dell epatite B non risiede tanto nella sua fase acuta quanto nei suoi effetti a lungo termine. Si può instaurare una viremia persistente con uno stato di portatore cronico che può durare anni.. In alcuni individui ciò può portare ad epatite cronica ed infine a cirrosi: cè anche un collegamento tra virus dell epatite B ed il carcinoma del fegato. Epidemiologia : disciplina che studia la distribuzione degli eventi legati alle malattie in gruppi di persone. Fornisce un utile contributo per la comprensione della etologia delle malattie e quindi per la loro prevenzione. Endemia : indica la presenza costante di una malattia o di un microrganismo in una particolare area o regione.

39 39 Epatite virale B

40 40 Malattia acuta tipica dellinfanzia ad andamento quasi sempre benigno, incubazione media di 18 giorni con esantema e linfoadenomegalia e con decorso subclinico Virus che si trasmette per via aerea viene eliminato durante gli ultimi giorni della incubazione e i primi giorni della malattia, dopo la replicazione nel tratto respiratorio il virus passa nel sangue e quindi agli organi bersaglio. Il rischio nella donna gravida è che il virus sia trasmesso al feto con danni di varia incidenza a carico degli organi ed anche aborto, rischio grave durante le prime 12 settimane di gravidanza, in questo caso la trasmissione al feto è molto frequente e nel 20% si ha aborto spontaneo. Presenza di IgG a causa di un infezione pregressa mentre nel caso di IgM linfezione è acuta e recente, linfezione fornisce un immunità permanente. Vaccinazione per tutti i bambini dopo i 15 mesi e per le donne in età fertile che non abbiano IgG specifiche contro la rosolia. Il vaccino essendo costituito da un virus attenuato non va somministrato a donne gravide in quanto potrebbe attaccare il feto. Rosolia

41 41 ROSOLIA CICLO DI REPLICAZIONE In questo caso non vi è trascrizione inversa l RNA virale serve per la sintesi di un RNAm direttamente che viene impiegato per la sintesi di nuove proteine.

42 42 HIV (human immunodeficiency virus) Malattia del sistema immunocompetente causata da due distinti retrovirus umani HIV 1 e La fase asintomatica è notevolmente lunga in cui non si hanno manifestazioni patologiche ma in cui si realizza un forte calo del numero di CD La sintomatologia inizia quando il n° di CD4 scende sotto le 300 unità per mm Antigeni: si tratta di proteine strutturali denominate p24, gp41, gpl, gpl60, queste glicoproteine sono strutturali e in grado di legarsi ai recettori CD4 delle cellule linfocitarie t4 (helper suppressor). Il loro legame determina lingresso del virus allinterno del linfocita Gravi infezioni opportunistiche ed anche micosi esofagee e/o manifestazioni neoplastiche (sarcoma di Kaposi o linfoma del sistema nervoso centrale) Nei soggetti non trattati con antvirali levoluzione è in media di 10 anni dal momento dellinfezione Periodo di incubazione tra 4 e 8 anni, si manifesta con poliadenopatia e linfoadenopatia cronica, il paziente può rimanere asintomatico per un lungo periodo La terapia è basata su sostanze farmaceutiche in grado di inibire la trascrittasi inversa, o le proteine di legame presenti sulla superficie del virus, o sostanze in grado di inibire i cofattori recettoriali.

43 43 HIV (human immunodeficiency virus) CICLO DI REPLICAZIONE

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45 45 Ingresso dell HIV nella cellula, il legame tra gp120 e CD4 è seguito dalla modificazione della conformazione di gp120 che formano legami, l agp41 completa lopera favorendo la fusione dellenvelope


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