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Neuroni piramidali del SNC che stanno crescendo su una matrice di glia/fibroblasti Attività elettrica dei neuroni.

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Presentazione sul tema: "Neuroni piramidali del SNC che stanno crescendo su una matrice di glia/fibroblasti Attività elettrica dei neuroni."— Transcript della presentazione:

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2 Neuroni piramidali del SNC che stanno crescendo su una matrice di glia/fibroblasti Attività elettrica dei neuroni

3 Voltage clamp Col metodo del voltage clamp la membrana viene portata ad un potenziale fisso prestabilito e si registrano le correnti necessarie a mantenerla bloccata (clampata) a quel potenziale. Un amplificatore differenziale (A) inietta nella cellula una corrente Im, proporzionale alla differenza tra un potenziale di comando (applicato allingresso +) ed il potenziale di membrana Vm (applicato allingresso -). Due risultati utili: a)Vm viene quasi portato a coincidere col potenziale di comando; b)la variazione di Vm è praticamente istantanea, cosicché la corrente capacitiva (Ic=C dV/dt), anche se molto intensa, dura per un tempo brevissimo. Da quel momento in poi verrà registrata (ad un potenziale prestabilito, che viene mantenuto costante) solo la corrente ionica

4 Neurone piramidale con un elettrodo di vetro attaccato per la derivazione delle correnti ioniche transmembranarie mediante la tecnica del (patch-) voltage-clamp amplificatore La derivazione delle correnti ioniche transmembranarie

5 (mV) Tempo (ms) Corrente ionica (nA) Tempo (ms) La tecnica del voltage-clamp consiste nel bloccare il potenziale di membrana ad un valore costante nel tempo e nel registrare le correnti ioniche transmembranarie generate a tale potenziale di membrana Potenziale di riposo (V r ) Potenziale di membrana finale (V m ) costante Corrente transmembranaria generata dal passaggio di V m da –70 mV a +20 mV Vantaggi del voltage-clamp: In genere, g m = f(V,t) ma, 1.V m è bloccato ad un valore costante g m = f(t) soltanto e può essere dedotto dallandamento della corrente ionica I i 2.E possibile separare I i da I c. Infatti c m è caricata istantaneamente

6 Voltaggio (mV) Tempo (ms) Corrente ionica (nA) Tempo (ms) I Na +I K + TTX (I K )+ TEA (I Na ) Separazione farmacologica delle correnti I K e I Na

7 Il modello della gate di H&H assume una reazione cinetica del 1 o ordine tra gli stati aperto e chiuso della particella di gating C O Quindi, la probabilità della particella di trovarsi nello stato aperto può essere descritta da: (1-P o ) PoPo Trattandosi di una cinetica del 1 o ordine, sarà: Allo stato stazionario (equilibrio) sarà: quindi, Considerazioni teoriche Studio del gating allo stato stazionario

8 Corrente K + (nA) Tempo (ms) Voltaggio (mV) Tempo (ms) I(K + ) max (nA) Voltaggio (mV) Conduttanza (μS) Voltaggio (mV) I K =g K (V-E K ) g K = I K /(V-E K ) E K =-80 mV Voltaggio-dipendenza dei canali K v

9 Voltaggio (mV) Tempo (ms) I(Na) (nA) Tempo (ms) I(Na) (nA) Tempo (ms) I(Na) picco (nA) Voltaggio (mV) Voltaggio (mV) Conduttanza (μS) I Na =g Na (V-E Na ) g Na = I Na /(V- E Na ) E Na =+50 mV Voltaggio-dipendenza dei canali Na

10 Separazione della fase di attivazione della corrente di Na dallinattivazione La pronasi rimuove linattivazione C o r r e n t e ( n A ) tempo (ms) V o l t a g g i o ( m V ) tempo (ms)

11 Come risalire dai valori di conduttanza allo stato stazionario alla probabilità di trovare una singola gate del canale aperta Grafico della conduttanza g(V) allo stato stazionario Nel caso di un canale inattivante, esso è stato ottenuto rimuovendo linattivazione C o n d u t t a n z a ( S ) Voltaggio (mV) P r o b. c a n a l e a p e r t o Ipotesi: lattivazione del canale è regolata da x gates n uguali e indipendenti. Allora, se n è la probabilità di avere la singola gate n aperta allo stato stazionario, la probabilità P o di trovare il canale aperto allo stato stazionario (in assenza di inattivazione) sarà: Probabilità composta: n·n·n…. (x volte) Quindi, dai valori di P o si può risalire ai valori di n : G max

12 V m ( m V ) Tempo (ms) Studio dellinattivazione allo stato stazionario I N a ( n A ) Tempo (ms) P r o b a b i l i t à g a t e h a p e r t a C o r r e n t e d i N a ( n A ) Potenziale di condiz. (mV) mV Se si ipotizza che il processo di inattivazione sia regolato da ununica gate (h), i valori in grafico sono proporzionali alla probabilità di trovare tale gate aperta allo stato stazionario

13 Il modello della gate di H&H assume una reazione cinetica del 1 o ordine tra gli stati aperto e chiuso della particella di gating C O Quindi, la probabilità della particella di trovarsi nello stato aperto può essere descritta da: (1-P o ) PoPo Trattandosi di una cinetica del 1 o ordine, sarà: Tempo-dipendenza del gating

14 Allo stato stazionario (equilibrio) sarà: quindi, Se p particelle di gating indipendenti sono coinvolte nel gating del canale, allora il canale seguirà il seguente andamento temporale: P o (t) Prob. Di Attivaz. Tempo [P o (t)] p 1 /( )= rappresenta la costante di tempo dellattivazione ed è un indice della velocità di attivazione della particella di gating. Risolvendo lequazione differenziale del 1 o ordine e applicando la condizione al contorno, si ottiene:

15 chiuso -70mV aperto +60mV Ipotesi: una sola gate P o =n(t)=n -(n -n 0 )exp(-t/τ) Voltaggio (mV) Tempo (ms) I(K) Tempo (ms) Prob. di apertura (P o ) Tempo (ms) I=g(V-E) ; g P o I(t) n(t)(V-E) I=g(V-E) ; g P o =n 4 I(t) n 4 (t)(V-E) chiusoaperto Ipotesi: quattro gates identiche P o = nnnn = n 4 n 4 (t)=[n -(n -n 0 )exp(-t/τ)] 4 Cinetica delle correnti di K + del canale K v 1 gate 4 gates

16 Cinetica delle correnti di Na + voltaggio-dipendenti Volt. (mV) Tempo (ms) I(Na) Tempo (ms) Chiuso -70mV Aperto +20mV Ipotesi: tre gates identiche P o =m 3 (t)=[m -(m -m 0 )exp(-t/τ)] 3 Chiuso -70mV Aperto +20mV Inattivato +20mV Ipotesi: tre gates identiche di attivazione + una gate di inattivazione P o =m 3 (t)h(t) Prob. di apertura (P o ) Tempo (ms) m(t) m 3 (t) h(t) m 3 *h

17 Il gating dei canali voltaggio-dipendenti Come fa il voltaggio ad aprire i canali? Il controllo dellattività dei canali per mezzo del voltaggio è la chiave che sta alla base delleccitabilità neuronale e del signalling ovvero

18 Canali ionici voltaggio-dipendenti Famiglia di canali a 6 domini transmembrana (TM) Il poro è delineato da 4 subunità o pseudosubunità Ciascuna contiene 6 segmenti TM (S1-S6) e una regione H5 (loop P) Vi appartengono: Canali voltaggio-dipendenti del Na +, Ca 2+ e K + Canali del K + Ca 2+ -attivati Canali cationici attivati dalliperpolarizzazione, ecc. Questa è una delle 4 (pseudo)subunità H5 I canali ionici voltaggio-dipendenti contengono sensori del voltaggio intrinseci Il segmento S4 corrisponde al sensore del voltaggio

19 X 4

20 Nel canale del K + Shaker, ciascun segmento S4 contiene 7 residui basici regolarmente distribuiti ogni 3 aa. Canale chiuso: la 2 a Arg di S4 è seppellita nel bilayer Canale aperto: la 2 a Arg fuoriesce dal lato extracell., mentre il 4 o e 5 o residui basici si muovono dal citosol allinterno del bilayer Attiva la spirale

21 Mutazioni in S4 Riducono il Movimento di Carica ILRVIRLVRVFRIFKLSRHSKGL q/n (e - charges) R K R neutral AA R=arginina K=lisina

22 ILRVIRLVRVFRIFKLSRHSKGL q/n (e - charges) R K R neutral AA Mutazioni in S4 Riducono il Movimento di Carica

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24 MacKinnon_Nature01473.pdf MacKinnon_Nature01580.pdf MacKinnon_Nature01581.pdf

25 Conduttanza g V m (mV) Confronto della voltaggio-dipendenza di g K e g Na


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