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TISSUE ENGINEERING COLTURA DI CHERATINOCITI E FIBROBLASTI SU SUPPORTO DI PLASMA UNIVERSITA DEGLI STUDI DI PARMA Facoltà di Scienze MM. FF. NN. Corso di.

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1 TISSUE ENGINEERING COLTURA DI CHERATINOCITI E FIBROBLASTI SU SUPPORTO DI PLASMA UNIVERSITA DEGLI STUDI DI PARMA Facoltà di Scienze MM. FF. NN. Corso di Laurea Specialistica in Biologia ed Applicazioni Biomediche Relatori Chiar. ma Prof. ssa Renata Franchi Gazzola Correlatori Chiar. mo Dott. Stefano Negri Laureanda Elena Alessi Anno Accademico 2007/2008

2 TISSUE ENGINEERING Area multidisciplinare di ricerca che ha come scopo la rigenerazione di tessuti ed organi danneggiati del nostro organismo PRINCIPI Prelevare le cellule staminali del Paziente Far crescere e differenziare le cellule su un supporto biologico Sottoporre il Paziente al trapianto

3 devono possedere le seguenti caratteristiche: tollerabilità: devono essere immunologicamente inerti (biocompatibili) impalcatura provvisoria: dopo integrazione il biomateriale deve essere sostituito dal tessuto originario (biodegradabili) contenuto informativo: devono comunicare e scambiare segnali con le cellule ospite BIOMATERIALI

4 LE MATRICI PIU IDONEE.. Per la crescita e differenziazione di cheratinociti e fibroblasti autologhi, le matrici più idonee, sono di tipo naturale e si suddividono in: - collagene - agarosio - acido ialuronico - colla di fibrina - cellulosa Grande interesse è rivolto verso lutilizzo del plasma umano come supporto di crescita per cheratinociti e fibroblasti

5 Isolare cheratinociti e fibroblasti umani, utilizzando il plasma autologo per formare lembi di cute con caratteristiche morfo-funzionali e immunoistochimiche simili allepidermide normale SCOPO TESI

6 CASO CLINICO V. P. di anni 65, affetta da ulcera vascolare venosa circonferenziale alla gamba sinistra.

7 MATERIALI E METODI Estrazione e amplificazione di cheratinociti e fibroblasti umani autologhi, prelevati da ununica biopsia Preparazione del supporto di plasma Aggiunta di fibroblasti e cheratinociti a diverse densità

8 PREPARAZIONE SUPPORTO DI PLASMA ACIDO TRANEXAMICO PLASMA SOLUZIONE FISIOLOGICA CLORURO DI CALCIO FIBROBLASTI + + CHERATINOCITI 30, 37°C, 5% CO 2

9

10 CONSISTENZA DEL SUPPORTO PLASMAAC. TRANEXAMICONaClCaCl 2 QUANTITÀ DI SOLUZIONE PER POZZETTO 5 ml5 mg6,5 ml1 ml, 1%1 ml2 ml 5 ml5 mg6,5 ml1 ml, 1,5%1 ml2 ml 5 ml6 mg6,5 ml1 ml, 1%1 ml2 ml 6 ml5 mg5,5 ml1 ml, 1%1 ml2 ml 5 ml6 mg6,5 ml1 ml, 1,5%1 ml2 ml

11 5X10 4 /cm 2 FU 5X10 4 /cm 2 KE 5X10 4 /cm 2 FU 10X10 4 /cm 2 KE 5X10 4 /cm 2 FU 15X10 4 /cm 2 KE 10X10 4 /cm 2 FU 5X10 4 /cm 2 KE 10X10 4 /cm 2 FU 10X10 4 /cm 2 KE 10X10 4 /cm 2 FU 15X10 4 /cm 2 KE 15X10 4 /cm 2 FU 5X10 4 /cm 2 KE 15X10 4 /cm 2 FU 10X10 4 /cm 2 KE 15X10 4 /cm 2 FU 15X10 4 /cm 2 KE FIBROBLASTI5X10 4 /cm 2 10X10 4 /cm 2 15X10 4 /cm 2 CHERATINOCITI5X10 4 /cm 2 10X10 4 /cm 2 15X10 4 /cm 2 DENSITA DI SEMINA

12 t0FIBROBLASTICHERATINOCITI t1 (dopo 1 giorno) - CHERATINOCITI t2 (dopo 4 giorni) - CHERATINOCITI t3 (dopo 8 giorni) - CHERATINOCITI MODALITA DI SEMINA

13 PRELIEVO i frammenti di cute artificiale sono stati prelevati per: Valutazione della consistenza ottimale Valutazione della densità cellulare ottimale Colorazioni istochimiche ed immunoistochimiche 4 giorni8 giorni13 giorni

14 COLTURA PRIMARIA microscopio a contrasto di fase dopo 8 giorni (400X) cheratinociti fibroblasti 3T3

15 COLTURA SECONDARIA microscopio a contrasto di fase dopo 12 giorni (400X) cheratinociti fibroblasti

16 FIBROBLASTI microscopio a contrasto di fase (400X) Derma Fibroblasti

17 FIBROBLASTI microscopio a contrasto di fase (400X)

18 microscopio a contrasto di fase dopo 3 giorni (200X) FIBROBLASTI ALLINTERNO DEL SUPPORTO DI PLASMA

19 cheratinocit i fibroblasti microscopio a contrasto di fase dopo 4 giorni (200X)

20 Ematossilina-Eosina (400X) FRAMMENTO DI CUTE ARTIFICIALE

21 Ematossilina-Eosina (400X) FIBROBLASTI

22 CHERATINOCITI

23 immunoistochimica: vimentina (400X) FIBROBLASTI

24 CHERATINOCITI immunoistochimica: citocheratina AE1 (400X)

25 MEMBRANA BASALE immunoistochimica: collageno IV

26 immunoistochimica: Mib1

27 APPLICAZIONE DELLA METODICA SULLA PAZIENTE

28 INNESTO DEL LEMBO DI CUTE ARTIFICIALE prima...

29 INNESTO DEL LEMBO DI CUTE ARTIFICIALE..dopo

30 SVANTAGGIVANTAGGI Supporto fragile e poco maneggevole Permette di ottenere innesti del tutto autologhi Facile da preparare Basso costo CONCLUSIONI


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