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Corso di interpretazione clinica degli esami ematochimici di base Studio delle proteine plasmatiche e protidogramma Dott.ssa C.Conticello Catania, 11/06/2013.

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1 Corso di interpretazione clinica degli esami ematochimici di base Studio delle proteine plasmatiche e protidogramma Dott.ssa C.Conticello Catania, 11/06/2013

2 PROTEINE PLASMATICHE Le proteine del plasma costituiscono un gruppo eterogeneo di proteine, con funzione specifica o diverse funzioni e la cui concentrazione (da pochi microgrammi ad alcuni grammi per litro) è soggetta a specifiche variazioni di concentrazione in svariate condizioni fisiologiche e patologiche. Gli intervalli di riferimento normali per le proteine del siero sono tra 63 e 84g/L. Tali valori non sono costanti ma differiscono per età, sesso, momento della giornata, stato di veglia o di sonno, esercizio fisico, stagioni calde e stagioni fredde. I livelli plasmatici fisiologici dipendono dalla sintesi, dal catabolismo, dalla diminuzione delle proteine nei vari compartimenti corporei e da perdite esterne. Le plasmaproteine vengono sintetizzate principalmente dal fegato, in particolare lalbumina, il fibrinogeno e le globuline, ad eccezione delle immunoglobuline che vengono prodotte dal sistema immunitario (plasmacellule). Contribuiscono alla sintesi anche lintestino per le lipoproteine ed il sistema monocito/macrofagico per alcuni fattori del complemento. Il metabolismo delle proteine è rapido ed intenso: viene giornalmente rinnovato, in condizioni fisiologiche, il 9% di tutte le proteine sintetizzate dal fegato ed il 10-25% di quelle circolanti. Anche nel catabolismo gioca un ruolo fondamentale il fegato. In condizioni fisiologiche le perdite (esterne) avvengono attraverso lapparato gastroenterico (tutte le proteine), il rene (selettivo), le ghiandole esocrine, lapparato respiratorio e gli organi genitali. OConnel et al, aafp 2005

3 Vengono classificate: in base alla funzione: - trasporto di nutrienti (albumina, lipoproteine), di ioni metallici (trasferrina, ceruloplasmina), di ormoni (TBG, transcortina, RBP), altro… (aptoglobina). - difesa (complemento, immunoglobuline, inibitori enzimatici, proteine della fase acuta). - emostasi e coagulazione ( fibrinogeno, plasmina). Sono queste funzioni specifiche cui si associano gli effetti sull Equilibrio idrico (attraverso il mantenimento della pressione oncotica), Effetto tampone (anfotere), Funzione catalitica, Riserva proteine corporee. ….in base alla migrazione elettroforetica (albumina, alfa1, alfa2, beta1,beta2, gamma) PROTEINE PLASMATICHE

4 -in base alla migrazione elettroforetica (albumina, alfa1, alfa2, beta, gamma) Poiché i metodi di separazione e di misurazione impiegati rispecchiano in prevalenza aspetti molecolari, chimici, fisici o la loro funzione, unidentica sostanza viene molte volte, a seconda delle circostanze e del metodo impiegato, denominata in diversi modi: macroglobulina, immunoglobulina M, -globulina, glicoproteina. E quindi importante lo studio delle caratteristiche strutturali, metaboliche e funzionali delle numerose proteine del plasma e delle loro variazione genetiche. A) Caratteristiche chimiche: proteine semplici, glicoproteine, lipoproteine B) Caratteristiche chimico-fisiche: solubilità, sedimentazione, carica elettrica Frazionamento (precipitazione frazionata con sali o solventi organici) Tecniche immunochimiche (nef-turb) Immunofissazione Migrazione elettroforetica Immunoelettroforesi e. bidimensionale Metodi quantitativi Metodi qualitativi Per ultracentrifugazione (massa, forma, densità, coefficiente di frizione)

5 Nella precipitazione frazionata mediante aggiunta di solfato di ammonio, si esprime la concentrazione del sale come % DI SATURAZIONE Le proteine del plasma possono essere così suddivise: a) GLOBULINE (33%) b) ALBUMINA (60%) c) FIBRINOGENO. Presente in quantità inferiori alle prime due ed è meno solubile. Nel siero presente solo in tracce Frazionamento secondo Chon, ottenuto con alcool etilico a bassa temperatura. Variando la concentrazione di etanolo e la temperatura, le diverse proteine possono essere precipitate in differenti frazioni Frazione I fibrinogeno 60% globulina antiemofilica (fattore VIII) globuline insolubili a freddo protrombina componente C1q, C1r, C1s Frazione IIgammaglobuline 95% Frazione IIIbetaglobuline 60% (e betalipoproteine) isoagglutinine, immunoglobuline M, alfa2 macroglobulina protrombina e plasminogeno Frazione IVtransferrina aptoglobina ceruloplasmina globulina legante gli ormoni tiroidei alfa1antitripsina alfa1glicoproteina antitrombina III componenti del Complemento Frazione V albumina 95% alfa1glicoproteina alfa e beta globuline Metodi quantitativi

6 Immunofissazione Metodi quantitativi Tecnica di DOSAGGIO IN SITU Consiste nel fissare le CM (catene pesanti e leggere) in situ (lastrine di agarosio) mediante specifici antisieri e poi colorarle dopo aver rimosso tutte le altre bande non fissate, permettendo lidentificazione di una banda. Si esegue su siero e su urine. Immunofissazione su siero G A M kλ

7 MIGRAZIONE ELETTROFORETICA Le proteine sono sostanze anfotere, cioè si possono comportare da acido, liberando ioni H+, o da base liberando anioni OH-. Inoltre modificano le cariche elettriche dei loro residui chimici ionizzabili a secondo del mezzo in cui sono sciolte. In soluzione sono facilmente ionizzabili e si dissociano in ioni R-COO- (Asp, Glu) o ioni R-NH3+ (Lys, Arg). L'elettroforesi è una tecnica analitica e separativa basata sul movimento di particelle elettricamente cariche immerse in un fluido per effetto di un campo elettrico applicato mediante una coppia di elettrodi al fluido stesso. Le particelle con carica positive si spostano verso il catodo e quelle con carica negativa verso l'anodo. Può essere di diversi tipi: -libera: in un mezzo liquido -zonale: su un supporto solido (carta, cellulosa, poliacrilamide, agarosio)

8 MIGRAZIONE ELETTROFORETICA * + - le proteine sono evidenziate mediante una colorazione specifica, e la loro composizione percentuale è misurata mediante densitometria. anodo catodo

9 MIGRAZIONE ELETTROFORETICA Da ricordare che: Lintensità del picco non corrisponde alla quantità delle proteine perché ogni colorante possiede affinità diversa per le diverse proteine La proteina che principalmente contribuisce ad una data frazione non è la sola che migra in quella zona, ad eccezione dellalbumina, che può essere considerata unica. Lelettroforesi delle proteine del siero, su acetato di cellulosa o su agarosio, ecaratterizzata da una ottimale separazione e risoluzione di 7 bande elettroforetiche. CLASSIFICAZIONE DELLE PROTEINE SELEZIONATE IN BASE ALLA MOBILITA ELETTROFORETICA OConnel et al, aafp 2005

10 1. banda della prealbumina 2. banda dellalbumina 3. banda 1 1-antitripsina 1-glicoproteina acida 1-antichimotripsina 1-lipoproteina (HDL) 1-fetoproteina4. 4. banda 2 2-macroglobulina (anodica) aptoglobina (catodica) ceruloplasmina proteina legante la vit.D (globulina GC) 5. banda 1 transferrina 1-lipoproteine (LDL) 6. banda 2 C3 2-microglobulina emopessina fibrinogeno (talvolta in zona ) 7. zona immunoglobuline (IgM ed IgA talvolta in zona 2)

11 globuline prealbumina Proteine totaliAlbuminaGlobuline α1α1 α2α2 β1β1 β2β2 γ1γ1 γ2γ2 Concentrazione g/L Percentuale Proteineα 1 globuline Transcortina Fattori della coagulazione II, VII, X AT-III Fattore IX Aptoglobina ceruloplasmina Fibrinogeno β 2 microglobulina Plasminogeno Fattore V Transferrina Emopessina C3, C6, C7 Proteina C reattiva Immunoglo buline Fattore XI C8, C1q

12 Aumento : emoconcentrazione, gammopatie mono e policlonali. Diminuzione : Insufficiente apporto Digiuno prolungato,dieta ipoproteica. Ridotto assorbimento Vomito, diarrea, s.da malassorbimento Perdita S.nefrosica, enteropatie, ustioni estese, emorragie Ridotta sintesi Epatopatie acute e croniche Ipercatabolismo Ipertiroidismo, febbre,infezioni acute, traumi, interventi chirugici, neoplasie Emodiluizione Emorragie profuse, scompenso cardiaco congestizio, terapie idratanti PROTEINE PLASMATICHE Gli intervalli di riferimento normali per le proteine del siero sono tra 63 e 84g/L. Valori> 90: iperproteinemia, valori < 60 : ipoproteinemia

13 Condizioni patologiche e modifiche delle proteine sieriche AlbuminaGlobuline α1α1 α2α2 βγ Sindrome nefrosica Epatopatia cronica Infiammazione Anemia sideropenica Malattie autoimmuni (policlonali) Gammopatie monoclonali AIDS (policlonali) Enteropatia essudativa

14 Proteine della fase acuta Positive Α1-antitripsina, -chimotripsina, -GP acida; Ceruloplasmina; aptoglobina, C3 e C4, ATIII, Ig Negative Albumina; Transferrina; Pre-albumina Indicazioni cliniche: Presenza di malattie infiammatorie Diagnosi differenziale tra patologie infiammatorie croniche Follow-up post-chirurgico nei pazienti a rischio post operatorio infettivo Follow-up dei pazienti onologici

15 SINGOLE FRAZIONI PROTEICHE

16 PREALBUMINA o TRANSTIRETINA: sintesi in parte nel fegato, in parte anche nella retina ed in altri tessuti. E il vettore sia per la tiroxina che per la proteina legante il retinolo. E una proteina negativa della fase acuta. ALBUMINA: MW 66,5 kDa. Il dosaggio dellalbumina è un ottimo indice della funzionalità epatica. E una proteina di trasporto (bassa specificità ed affinità, farmaci, bilirubina, acidi grassi, metalli ed ormoni). Contribuisce alla pressione osmotica. La concentrazione plasmatica dellalbumina diminuisce nei processi infiammatori, ustioni, epatopatie e nefropatie, malassorbimento, enteropatie protido-dispersive. Edema, ipocalcemia, alterazione nei livelli di sostanze trasportate

17 BANDA 1 1-ANTITRIPSINA: GP. In circolo costituisce la maggiore componente delle proteasi circolanti. E sintetizzata dagli epatociti in forma immatura, dai macrofagi ma anche in altri tessuti (rene, pancreas, stomaco, intestino, milza, surrene). 1-ANTICHIMOTRIPSINA: GP. Inibisce la chimotripsina pancreatica. Protegge lorganismo dai processi infiammatori (polmoni e bronchi) e dai danni tessutali, modula la risposta immune proteggendo da reazioni allergiche. Uno sdoppiamento raro della banda può essere dovuto ad elevati livelli di 1-fetoproteina, i quali, dopo il secondo anno di vita, sono indicatori di epatiti evolutive, carcinoma epatico BANDA 2 2 -MACROGLOBULINA: GP. Sintetizzata dal fegato. Modulatore dellattività delle citochine. Aumenta fisiologicamente nel 3° trimestre della gravidanza, nellinfanzia e nelletà avanzata. Aumenti patologici si hanno nellinfiammazione acuta, nelle epatopatie, nel diabete. APTOGLOBINA: GP. Lega lemoglobina libera (in modo forte ed irreversibile).La sua concentrazione aumenta dalla nascita fino alletà adulta. Diminuisce per iperconsumo in tutti i casi di emolisi intravascolare e per difetto di sintesi in condizione di riduzione del numero di epatociti. Può diminuire anche in seguito a sport prolungati, che comportano distruzione di eritrociti. E una proteina della fase acuta. CERULOPLASMINA: glicoproteina. Maggiore proteina di trasporto plasmatico del rame. La sua sintesi avviene nel fegato, ma la regolazione della sintesi è indipendente dalla quantità di rame in circolo. Diminuzione dei livelli di ceruloplasmina si osservano nel morbo di Wilson, caratterizzato da elevati depositi tossici di rame nel fegato, cervello, cuore. PROTEINA TRASPORTATRICE DELLA VITAMINA D: non si conosce bene la sua funzione specifica, me è la maggior proteina trasportatrice della vitamina D e dei suoi metaboliti. Sintetizzata del fegato. CERULOPLASMINA: GP. Maggiore proteina di trasporto plasmatico del rame. La sua sintesi avviene nel fegato. Diminuisce nel morbo di Wilson. PROTEINA TRASPORTATRICE DELLA VITAMINA D: non si conosce bene la sua funzione specifica, me è la maggior proteina trasportatrice della vitamina D e dei suoi metaboliti. Sintetizzata del fegato. PROTEINA TRASPORTATRICE DELLA VITAMINA D

18 BANDA 1 TRANSFERRINA: GP. Lega e trasporta in modo reversibile lo ione ferrico. Aumenta nelle sideropenie e diminuisce negli accumuli di ferro. Le funzioni principali della transferrina sono:-trasporto di ferro assorbito dallintestino alle cellule che lo richiedono; -fattore protettivo contro cellule batteriche e neoplastiche in quanto compete con esse per lutilizzo di ferro. BANDA 2 C3: proteina della fase acuta che si eleva molto lentamente e richiede 2-10 giorni per raggiungere il massimo livello dopo uninfiammazione. EMOPESSINA: GP. Lega il gruppo eme libero in rapporto 1:1 e lo trasporta al fegato, dove leme entra nella cellula e libera il ferro che è riutilizzato. 2-MICROGLOBULINA: costituisce la catena leggera degli antigeni del complesso maggiore di istocompatibilità (MHC) e si trova sulla superficie di tutte le cellule che esprimono questo antigene.

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20 ZONA E costituita dalle diverse classi delle immunoglobuline. A causa della loro eterogeneità, le immunoglobuline si estendono dalla regione a quella e talvolta occupano anche la zona. Le Ig sono lespressione dellattività secretoria di diversi cloni plasmacellulari AGAMMAGLOBULINEMIA Legata al sesso IPOGAMMAGLOBULINEMIA Più frequenti quelle acquisite. Negli adulti e negli anziani deve far sospettare una malattia Immunoproliferativa (linfoma) Riduzione:

21 ZONA GAMMAPATIA MONOCLONALE comparsa in zona - di una banda stretta, che può essere rilevata come picco al densitogramma quando presente al di sopra di 1g/L. ZONA Aumento: IPERGAMMAGLOBULINEMIA POLICLONALE Tutte le malattie croniche infettive, collagenopatie, malattie autoimmuni. Utile seguire il decorso delle epatiti acute virali e di alcune malattie autoimmuni tipo LES e artrite reumatoide AlbuminaGlobuline α1α1 α2α2 β1β1 β2β2 γ

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23 La proliferazione di un singolo clone plasmacellulare con produzione di ununica classe, sottoclasse, idiotipo di immunoglobulina, detta monoclonale. La presenza di Ig patologiche si mette in evidenza allelettroforesi del siero come una banda netta che nella maggior parte dei casi si trova in zona, da qui il nome di gammapatia monoclonale alla malattia e di componente monoclonale della proteina (CM). Il termine CM si riferisce quindi a qualunque banda immunoglobulinica che presenti le caratteristiche duna mobilità elettroforetica e sia costituita da un solo tipo di catena pesante e da un solo tipo di catena leggera. La frequenza è 1-2% nella popolazione al di sopra dei 25 anni ed aumenta al 3-7% negli ultrasettantenni. Il rischio di progressione in mieloma è dell1% allanno la presenza di un picco a banda stretta nella regione gamma indica una gammapatia monoclonale. La gammapatia monoclonale è associata ad una proliferazione clonale maligna o potenzialmente tale che rientra nella diagnosi di MM, macroglobulinemia di Waldenström, plasmacitoma solitario, MM smoldering, MGUS, PCL, HCD, LCDD, AL. LE GAMMAPATIE MONOCLONALI

24 LELETTROFORESI su acetato di cellulosa e su gel di agarosio è la tecnica essenziale per il riconoscimento di una CM. E possibile effettuare una quantificazione e la tipizzazione delle Ig e delle catene leggere della CM. Per il DOSAGGIO IN FASE LIQUIDA si possono usare la nefelometria (reazione Ag-Ab con deviazione del fascio di luce del nefelometro (scatter) tanto maggiore quanto più numerosi e più grandi sono i complessi e quindi la concentrazione della proteina) o la turbidimetria (tecnica in assorbimento che utilizza un normale spettrofotometro). Per il DOSAGGIO IN SITU si utilizza lIMMUNOFISSAZIONE Consiste nel fissare le CM (catene pesanti e leggere) in situ (lastrine di agarosio) mediante specifici antisieri e poi colorarle dopo aver rimosso tutte le altre bande non fissate, permettendo lidentificazione di una banda

25 Le immunoglobuline sintetizzate dalle plasmacellule maligne in ordine di frequenza nel siero sono: IgG (70%) IgA(20%) IgM (1%) λ IgD IgE Una volta sorto il sospetto di gammapatia monoclonale bisogna quantificare la proteina M con IFE siero ed urine. MGUS, MM, macroglobulinemia di Waldenström, plasmacitoma solitario, MM smoldering, PCL, HCD, LCDD, AL.

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28 La maggior parte dei pazienti hanno una proteina M rilevabile ma l 1-3% ha un mieloma non secernente Circa il 20% dei pazienti produce solo catene leggere non rilevabili nel siero poiché passano attraverso i glomeruli e vengono escrete con le urine. Si parla in tal caso di mieloma Micromolecolare o mieloma di Bence Jones in cui la componente sierica è costituita da sole catene leggere in forma di monomeri, dimeri o trimeri. E dovuta ad una eccessiva produzione di catene leggere omogenee (kappa o lambda) parallelamente ad una mancata sintesi di catene pesanti. MIELOMA MULTIPLO Il mieloma multiplo è la forma più comune di neoplasia plasmacellulare nelluomo. Produce in genere unimmunoglobulina monoclonale ed un eccesso di catene leggere libere. Le Ig possono appartenere a tutte le classi di Ig con frequenza corrispondente al loro normale contenuto serico (mieloma secernente, oligosecernente) Beetham et al, ann clin biochem 2000

29 Le plasmacellule normalmente producono un eccesso di catene leggere che non si legano alle catene pesanti per formare una molecola Ig completa e si ritrovano nel sangue come catene leggere libere (sFLC). Ciò avviene anche per le PC maligne. Il monitoraggio delle sFLC è parte integrante della diagnostica e del decorso delle discrasie plasmacellulari. Tosi et al, tah 2013

30 The International Myeloma Working Group (IMWG) recommends: - a complete history taking and physical examination; - routine laboratory testing including serum protein electrophoresis (SPEP), serum immunofixation electrophoresis (SIFE), nephelometric quantitation of immunoglobulins, and measurement of serum FLCs (SFLCs); - bone marrow aspiration and biopsy with immunophenotyping, conventional cytogenetics, and fluorescence in situ hybridization; -and imaging. Il nuovo test Freelite della Binding Site (USA), utilizzato con il nefelometro BN II, permette un accurata e rapida quantificazione delle flc nel siero, nell urina e nel liquor. Il nefelometro è in grado di quantificare solo le flc senza determinare anche le catene leggere legate alla catena pesante dellAb. Ciò è reso possibile grazie alla presenza di Ab specifici che legano esclusivamente le flc (Ag). Brebner et al, rep-med 2013

31 Il saggio SFLC (Freelite Assay, The Binding Site Ltd., Birmingham, United Kingdom) è stato introdotto nel Esso riconosce un epitopo presente solo sulle catene leggere delle Ig nel siero. E lunico test approvato dalla U.S. Food and Drug Administration ed è classificato come un test immunologico sulle catene leggere. Misura k e l separatamente rilevandone basse concentrazioni (meno di 1 mg/dL nel siero e meno di 200 mg/day nelle urine). Il vantaggio maggiore è il calcolo del rapporto kappa/ lambda per cui il range diagnostico è 0.26–1.65. Un rapporto alterato è utile indice di clonalità, poiché un disordine clonale produce elevate concentrazioni di un tipo solo di catene leggere. Si ritiene che questo saggio potrebbe avere un ruolo aggiuntivo nello screening, nella diagnosi, nel monitoraggio e nella prognosi delle PCD nella pop. Ad alto rischio.Oltre la rilevanza in Fase diagnostica e nel monitoraggio durante la terapia potrebbero anche essere lunico marcatore della malattia in alcuni casi (MM non secernente; AL; LC MM)

32 Sindrome di Fanconi: depositi di catene k nel tubulo prossimale e presenza di catene k nelle urine e dolore (1/14 evolve in MM) Sindrome POEMS: Isotipo L. VEGF (Policlinico San Matteo di Pavia-siero separato da provetta tappo rosso senza gel messo in un eppendorf). MM IgM: 1%. IFT. Malattia da emoagglutinine fredde: IgMk. Emolisi extravascolare. Anemia. Cercare le agglutinine fredde con un titolo >1:64 A 4 GRADI. AL IgM: 5%, associata a catene l. Biopsia del nervo surale se neuropatia. R. Scleromixedema: 1-eruzione generalizzata papulare o sclerodermoide; 2-depositi di mucina e fibrosi; 3-gammapatia monoclonale IgG (l); 4-assenza di patologia tiroidea.

33 Conclusioni -Porre attenzione nella lettura al protidogramma delle singole bande raccogliendo una storia clinica completa del paziente - Di fronte un picco monoclonale fare ulteriori approfondimenti -Ricordare i nuovi test (sFLC) -Tenere a mente i casi rari

34 Grazie dellattenzione

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38 Diagnosi differenziale di alterazioni del protidogramma

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