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Quali sono gli strumenti a disposizione dellistologo per lo studio della cellula e dei tessuti?

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Presentazione sul tema: "Quali sono gli strumenti a disposizione dellistologo per lo studio della cellula e dei tessuti?"— Transcript della presentazione:

1 Quali sono gli strumenti a disposizione dellistologo per lo studio della cellula e dei tessuti?

2 ordine di grandezza delle strutture di interesse istologico in questo corso raramente ci soffermeremo sulle esatte dimensioni delle strutture oggetto di studioin questo corso raramente ci soffermeremo sulle esatte dimensioni delle strutture oggetto di studio è però di fondamentale importanza conoscere lordine di grandezza di tali struttureè però di fondamentale importanza conoscere lordine di grandezza di tali strutture

3 Cosa significa ordine di grandezza? Semplificando: due oggetti differiscono di un ordine di grandezza quando uno è circa 10 volte più grande dellaltroSemplificando: due oggetti differiscono di un ordine di grandezza quando uno è circa 10 volte più grande dellaltro

4 Importanza degli ordini di grandezza quale sarebbe lesito di questo incidente?

5 può una proteina attraversare la membrana tramite un canale ionico?

6 scale lineari e scale logaritmiche 1 mm 100 µm 10 µm 1 µm 100 nm 10 nm 1 nm 1 Å 8 µm 7 µm 6 µm 5 µm 4 µm 3 µm 2 µm 1 µm 80 mm 70 mm 60 mm 50 mm 40 mm 30 mm 20 mm 10 mm In una scala logaritimica, il valore di ogni suddivisione si ottiene moltiplicando (o dividendo) il valore della suddivisione precedente. In questa scala, il fattore è 10

7 Questione di dimensioni… 1 mm 100 µm 10 µm 1 µm 100 nm 10 nm 1 nm 1 Å cellule epiteliali globuli rossi batteri virus proteine aminoacidi atomi le frecce bianche indicano lordine di grandezza di alcune strutture biologiche e chimiche spessore di un capello umano

8 immagine istologica - lorganismo è composto di cellule - esistono molti tipi diversi di cellule - lorganismo è composto di cellule - esistono molti tipi diversi di cellule

9 immagine istologica tipicamente, cellule relativamente simili fra loro si aggregano … …formando i cosiddetti tessuti. Listologia può anche essere definita come lo studio dei tessuti dellorganismo tipicamente, cellule relativamente simili fra loro si aggregano … …formando i cosiddetti tessuti. Listologia può anche essere definita come lo studio dei tessuti dellorganismo

10 immagine istologica cosa si osserva?

11 Anatomia del microscopio ottico o luce

12 bx51 interior schema di funzionamento di un moderno microscopio ottico

13 immagine istologica come si ottiene, a partire da tessuti biologici, unimmagine come questa?

14 Problema 1 la luce del microscopio può attraversare solo materiale di spessore molto ridottola luce del microscopio può attraversare solo materiale di spessore molto ridotto La preparazione di materiale istologico il tessuto deve essere sezionato mediante speciali apparecchi, detti microtomi

15 microtomo a slitta

16 microtomi elettronici

17 Problema 2 i tessuti biologici sono per lo più mollii tessuti biologici sono per lo più molli La preparazione di materiale istologico prima del taglio, il tessuto deve essere indurito –Fissazione con aldeidi –Inclusione –Congelamento

18 criostato

19 Problema 3 i tessuti sono normalmente quasi incolori e privi di contrastoi tessuti sono normalmente quasi incolori e privi di contrasto La preparazione di materiale istologico prima dellosservazione al microscopio, il tessuto deve essere colorato coloranti con affinità per componenti cellulari e tissutali diverse possono essere combinati nella stessa sezione istologica

20 acidofilia e basofilia le sostanze acide che si trovano nei tessuti possiedono affinità per i coloranti basici (basofilia)le sostanze acide che si trovano nei tessuti possiedono affinità per i coloranti basici (basofilia) le sostanze basiche che si trovano nei tessuti possiedono affinità per i coloranti acidi (acidofilia o eosinofilia)le sostanze basiche che si trovano nei tessuti possiedono affinità per i coloranti acidi (acidofilia o eosinofilia)

21 diversi tipi di granulociti acidofilo (eosinofilo) basofilo neutrofilo

22 sequenza dei passaggi in una tipica procedura istologica 1.fissazione di un campione di tessuto in formaldeide 2.congelamento del pezzo 3.taglio al microtomo 4.montaggio su vetrino 5.bagni in soluzioni di coloranti 6.disidratazione e coverslipping

23 lo striscio di sangue Lo striscio, una delle tecniche istologiche più diffuse, consente lo studio microscopico delle cellule del sangue e si distingue dal protocollo generico appena delineato perché, ovviamente, non richiede il taglio del tessuto.

24 strisciostriscio

25 Istologia funzionale Colture cellulariColture cellulari Coloranti vitaliColoranti vitali IstochimicaIstochimica ImmunoistochimicaImmunoistochimica ImmunofluorescenzaImmunofluorescenza Tecniche specialiTecniche speciali –Traccianti assonali –Tecniche combinate Listologia moderna non si limita allosservazione descrittiva degli aspetti morfologici e strutturali di base di cellule e tessuti. Esistono numerose tecniche che consentono di rispondere a quesiti su specifici correlati funzionali della composizione di un tessuto

26 Citochimica e Istochimica Lidentificazione e/o la misura quantitativa mediante reazioni di colorazione specifiche (o mediante metodi fisici) di costituenti chimici delle cellule e dei tessutiLidentificazione e/o la misura quantitativa mediante reazioni di colorazione specifiche (o mediante metodi fisici) di costituenti chimici delle cellule e dei tessuti Mentre nella biochimica tradizionale il materiale biologico viene studiato tipicamente in provetta, la citochimica e listochimica applicano tecniche biochimiche direttamente su sezioni di tessuto, consentendo di identificare i costituenti in situ.

27 Immunofluorescenza e immunoistochimica Metodi altamente sensibili per la localizzazione di proteine o polisaccaridi nei tessutiMetodi altamente sensibili per la localizzazione di proteine o polisaccaridi nei tessuti IF: anticorpi coniugati con sostanze fluorescentiIF: anticorpi coniugati con sostanze fluorescenti IIC: anticorpi coniugati con enzima perossidasi (rivelato poi da una reazione istochimica)IIC: anticorpi coniugati con enzima perossidasi (rivelato poi da una reazione istochimica)

28 immagine istologica che livello di dettaglio si apprezza in questa immagine?

29 stesso tessuto a maggiore ingrandimento

30 ulteriore ingrandimento... è sufficiente il microscopio ottico a saziare ogni curiosità sulle strutture viventi?

31 Questione di dimensioni… 1 mm 100 µm 10 µm 1 µm 100 nm 10 nm 1 nm 1 Å Occhio umano Microscopio ottico cell. epiteliali globuli rossi batteri virus proteine aminoacidi atomi le frecce indicano il massimo potere risolutivo di alcuni strumenti di osservazione

32 Che differenza cè fra: ingrandimento e potere di risoluzione?

33

34

35 Questo è quello che succede quando si ingrandisce indefinitamente unimmagine.

36 Aumentare a piacimento la risoluzione di unimmagine già acquisita è possibile solo nei film americani...

37 il potere risolutivo dello strumento di osservazione determina il livello di dettaglio contenuto nellimmagine. Lingrandimento non determina un aumento di risoluzione delle immagini

38 di conseguenza, lulteriore ingrandimento di questa immagine non rivela maggiori dettagli

39 il microscopio elettronico a trasmissione per fortuna esiste...

40 m. ottico e m. elettronico a confronto

41 Microscopia elettronica Preparazione del tessutoPreparazione del tessuto –Fissazione in glutaraldeide –Postfissazione in tetrossido di osmio –Disidratazione con alcol –Inclusione in plastiche acriliche o resine epossidiche Taglio allultramicrotomoTaglio allultramicrotomo –Sezioni ultrafini di nm Aumento del contrastoAumento del contrasto –Coloranti elettronici come acetato di uranile o citrato di piombo

42 ultramicrotomo

43 lultramicrotomo produce tipicamente sezioni di nm

44 Esempio di microscopia elettronica a trasmissione linfocito Le immagini di microscopia elettronica sono in bianco e nero. Le parti scure si dicono elettrondense. Laltissimo potere risolutivo del ME consente di distinguere numerose componenti subcellulari.

45 stereomicroscopio la luce incide sulloggetto e viene riflessa da essola luce incide sulloggetto e viene riflessa da esso si osservano oggetti in rilievosi osservano oggetti in rilievo

46 poi cè anche... Microscopio elettronico a scansione

47 Risoluzione inferiore rispetto alla ME a trasmissioneRisoluzione inferiore rispetto alla ME a trasmissione Consente di valutare il rilievo degli oggettiConsente di valutare il rilievo degli oggetti Usata per lo studio delle superfici cellulariUsata per lo studio delle superfici cellulari

48 Questione di dimensioni… 1 mm 100 µm 10 µm 1 µm 100 nm 10 nm 1 nm 1 Å Occhio umano Microscopio ottico Microscopio elettronico a trasmissione cell. epiteliali globuli rossi batteri virus proteine aminoacidi atomi Microscopio elettronico a scansione losservazione di diversi livelli di organizzazione della materia vivente richiede luso di diversi strumenti

49 capello alcuni esempi di microscopia elettronica a scansione…

50 formica

51 bug

52 ragno

53 tipi di microscopio Tipo di osservazione Sezioni di tessuto Morfologia esterna Fonte di energia Luce visibile Microscopio ottico Stereo- microscopio Elettroni Microscopio elettronico a trasmissione Microscopio elettronico a scansione


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