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Strategie di miglioramento per … GRC ad alto valore qualitativo 1.Rigorosa selezione del donatore 2.Uniformare i valori Hct delle unità raccolte 3.Uniformare.

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1 Strategie di miglioramento per … GRC ad alto valore qualitativo 1.Rigorosa selezione del donatore 2.Uniformare i valori Hct delle unità raccolte 3.Uniformare lefficienza di separazione (centrifugazione) 4.Verificare e migliorare lefficienza della leucodeplezione … (la rimozione di 3-5 log permette la riduzione dellemolisi < 0,2%) 5.Evitare la rimozione del buffy coat (ricca di reticolociti) 6.Migliorare gli attuali sistemi di conservazione 7.Trasfondere sangue fresco (short storage) 8.Eliminare il removal-prone RBCs Heaton, TR 2009

2 8) Removal-prone RBCs Frazione (circa 30%) di GRC trasfusi che vengono rimossi entro 24h dal sistema reticolo endoteliale del ricevente Principale responsabile degli effetti collaterali (nei politrasfusi!) accumulo marziale stato infiammatorio (adesione GRC allendotelio) reazioni immuni (allo e auto anticorpi) Riducibile mediante limpiego di nuove soluzioni conservanti !?? Rimuovibile !?? Luten, TR 2008 Reverberi … work in progress 2011

3 Gerociti (senescent erythrocytes) in vivo: i gerociti vengono individuati dagli anticorpi (autologhi) prodotti verso antigeni di scenescenza prodotti a seguito delle modificazioni del dominio banda 3 (Naturally occuring antibodies = Nabs) in vitro: le stesse modificazioni intervengono negli eritrociti durante la conservazione Bosman, TM 2008

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5 Proteomica Applicazioni della proteomica – allo studio delle lesioni da conservazione dei GRC – Responsabile: Lello Zolla – Collaboratori: Anna Maria Timperio, Sara Rinalducci, Gian Maria DAmici, Angelo DAlessandro, Federica Gevi – Convenzionato con il Centro Nazionale Sangue studio dei fenomeni di stress ossidativo subiti dalle proteine della membrana eritrocitaria durante lo stoccaggio di emazie leucodeplete risospese in soluzioni additive.

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7 Conservare i GRC in atmosfera di gas inerti a saturazione di O 2 < 4% … fino a 9 settimane!!

8 6) Sistemi di conservazione SAGM (ipertonico = 376 mOsm/L) PAGGS (isotonico = 285 mOsm/L) AS-1 = Adsol (ridotto contenuto di mannitolo … rispetto al SAGM) AS-3 = Nutricel (ricco in fosfato e citrato, ma privo di mannitolo) AS-5 = Optisol (composizione simile al SAGM) RAS-2 = ErythroSol (autorizzato in Europa, con ½ dose CPD) EAS-64/76 = Experimental Additive Solution (arricchito di bicarbonati) (Hess, TR 2000/03) AS in maggior volume (e con un miglior sistema tampone) (Hamasaki, VS 2000) Washing! (Meryman, VS 1991)

9 4) Leucodeplezione Dalla lisi dei globuli bianchi vengono liberati enzimi (glicosidasi, lipasi e proteasi) che attaccano la membrana eritrocitaria determinando: – rimozione della componente glucidica (immunoprotettiva) – dealchilazione dei lipidi – clivaggio delle proteine Rimuovendo i leucociti si migliora la vitalità dei globuli rossi e si riduce lemolisi!! Hess, J Pr 2010

10 2) Standardizzare le caratteristiche delle unità raccolte Contenuto di Hb … sempre diverso per: – Il diverso valore per ogni singolo donatore – Le diverse lavorazioni post-raccolta (leucodeplezione, rimozione BC) – Il tempo di conservazione diverso (al momento dellutilizzo)

11 Contenuto di Hb in unità GRC (in AS) private di buffy coat Contenuto di Hb in unità GRC (in AS) private di buffy coat e leucodeplete Högman and Meryman, TR 2006

12 GRC da aferesi: quantità 1.Improved red blood cell products: collection by apheresis. Smith JW, Axelrod FP, Ness PM. AABB Abstract #S263, [n = 1,612] 2.Haemonetics' internal study, [n = 352]. 2. GRC da sangue intero1. GRC da aferesi

13 GRC da aferesi: qualità (I) Parametri (range) GRC da aferesiGRC da sangue intero (leucodepleti) Contenuto medio di Hb / unità 58.1 g (53 – 61.2 g)59.6 g (45.2 – 76.6 g) Ematocrito medio62% (61-65%)58% (50-76%) Volume medio dellunità 269 mL ( )302.7 mL ( ) Harrison, TM 2006

14 Valori espressi come media e deviazione standard GRC da aferesiGRC da sangue intero giorno Hb libera (mg/dl) K + (mmol/l) pH Leitner, JCA 2003 GRC da aferesi: qualità (II)

15 Doppia raccolta GRC in aferesi Procedura completamente automatica Validata per unità di raccolta fisse e mobili Prodotto raccolto con contenuto Hb programmabile Standardizzazione della raccolta Garanzia di integrità dei GRC Anticoagulazione costante Filtrazione in linea Risospensione in sol additiva Ottimale sottrazione plasma Ben tollerata dal donatore

16 ProcedurenPalloreNausea Vomito SincopeConvulsioniCefaleaTossicità da citrato Sangue intero :1111:1.0001:5881:2.9411: Piastrino- aferesi :14701: Plasma- feresi :551: :7691: GRC aferesi : Jaster, HAG/DGTI 2005 Reazioni alla donazione

17 Ragioni della buona tolleranza alla donazione di 2GRC in aferesi Il tempo di donazione (30 min) porta ad un buon equilibrio volemico Il rimpiazzo con soluzione salina comporta isovolemia La stringente selezione porta alla donazione soggetti in condizioni ottimali Non sono evidenti differenze – di pressione / frequenza cardiaca – nei tempi di recupero di Hb / Hct nei donatori di 2GRC in aferesi vs donatori di 1GRC in aferesi …

18 Doppia raccolta GRC in aferesi vantaggi per il paziente Riduce lesposizione antigenica Riduce leffetto immunomodulante Migliora il controllo del dosaggio terapeutico Riduce (nelle prime fasi) i danni da conservazione

19 Trattamenti post-storage: – Leucodeplezione – Irraggiamento – Inattivazione – Quarantena Solo per PFC

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25 Inattivazione dei patogeni Allinizio degli anni 80 la quasi totalità dei pazienti che impiegavano i concentrati dei fattori della coagulazione – ottenuti da pool di plasma umano – si infettavano con gli agenti virali (HBV / nAnBV) causa di devastanti sindromi epatiche … da cui i primi tentativi di inattivazione virale … Con lavvento dellepidemia HIV le tecniche di inattivazione virale vennero applicate sistematicamente … In questi ultimi anni le tecniche di inattivazione dei patogeni hanno raggiunto un elevato grado di sicurezza, di pari passo con i nuovi esami di validazione biologica

26 AGENTI PATOGENI VIRUS – ARBOVIRUS – HERPESVIRUS – RETROVIRUS – VIRUS EPATITICI – FILOVIRUS – PARVOVIRUS BATTERI – STAPHYLOCOCCUS EPIDERMIDIS – BACILLUS CEREUS – STAPHYLOCOCCUS AUREUS – PSEUDOMONAS FLUORESCENS E AERUGINOSA – KLEBSIELLA PNEUMONIAE – SERRATIA MARCESCENS E LIQUEFACIENS – CLOSTRIDIUM PERFRIGENS – PROPIONIBACTERIUM ACNES PROTOZOI – PLASMODIUM – BABESIA MICROTI – TRYPANOSOMA CRUZI PRIONI

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28 Esami di Validazione Biologica (VB) Agenti patogeni in grado di essere trasmessi attraverso emocomponenti ed emoderivati oggetto di esami di VB (HIV 1 e 2, HBV, HCV, Treponema) non oggetto di esami di VB (Arbovirus, Parvovirus B19, HAV, HFV, HGV, HEV, EBV, HHV8, TTV, CMV, Batteri, Protozoi.. in particolare Leishmania, Trypanosoma, Babesia microti, Tricomonas, Plasmodio, Toxoplasma, Pneumocystis) Ancora oggetto di verifica CJD e SARS (Coronavirus)

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30 Evoluzione esami di validazione biologica Anni 70VDRL (test non treponemico) e HBsAg 1982Enzima epatico (ALT) 1985EIA HIV 1a g.ne 1990EIA HCV 1a g.ne/ EIA HIV 2a g.ne 1991EIA HCV 2a g.ne 1994EIA HIV / HCV 3a g.ne 1995VDRL + TPHA (test treponemico) / EIA HIV 4a g.ne 2001EIA Sifilide (Ac IgM e IgG) 2002NAT HCV 2006/2008NAT HIV/HBV e chemiluminescenza Sifilide 2009NAT WNV

31 Infezione HIV: periodo finestra con test sierologici e molecolari B. Weber, Exp Rev Mol Diagn 2006; 63 (3):

32 S.H. Kleinman, Transfusion 2009; 49: Infezioni trasmissibili: il periodo finestra

33 Rischio residuo (n/10 6 ) di trasmissione di … in Italia nel 2009 HBV1,6 (0,6 – 2,1) HCV0,1 (0,1 -0,2) HIV0,7 (0,6 – 2,1) Italian Society of Transfusion Medicine and Immunohaematology – R & D – Dr C. Velati Italian Group for the Study of Transfusion Transmissible Diseases

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35 Agosto 2007

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39 Patogeni emergenti Protozoi del genere Leishmania … Leishmaniosi 4 protozoi del genere Plasmodium … Malaria Protozoo specie Trypanosoma cruzi … Malattia di Chagas

40 Malaria

41 Malattia di Chagas

42 Leishmaniosi


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