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Anatomia Patologica Dr. Maurizio Maisano Servizio di Anatomia Patologica Azienda Ospedaliera Bianchi-Melacrino-Morelli Reggio Calabria

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Presentazione sul tema: "Anatomia Patologica Dr. Maurizio Maisano Servizio di Anatomia Patologica Azienda Ospedaliera Bianchi-Melacrino-Morelli Reggio Calabria"— Transcript della presentazione:

1 Anatomia Patologica Dr. Maurizio Maisano Servizio di Anatomia Patologica Azienda Ospedaliera Bianchi-Melacrino-Morelli Reggio Calabria

2 Che cosè ? E una branca della medicina che studia le modificazioni morfologiche che una malattia produce su organi e tessuti. Se le alterazioni morfologiche sono tipiche della malattia (patognomoniche) il loro riscontro comporta la diagnosi della malattia in sé (a differenza di altre discipline di laboratorio). Anatomia Patologica

3 Lo scopo finale della diagnosi AP è fornire un giudizio il più preciso possibile su 1. La natura della malattia 2. Lo stadio di sviluppo e le prospettive evolutive 3. Indicazioni utili ai fini della terapia

4 Anatomia Patologica Caratterizzazione morfologica delle lesioni: Istologia: studio dei tessuti Istologia: studio dei tessuti Citologia: studio delle cellule Citologia: studio delle cellule Patologia oncologica Patologia oncologica Patologia non oncologica (es. infiammatoria, degenerativa etc.) Patologia non oncologica (es. infiammatoria, degenerativa etc.)

5 Anatomia Patologica Stretta correlazione con la clinica: i dati clinici sono un fondamentale supporto per la diagnosi isto e citopatologica. i dati clinici sono un fondamentale supporto per la diagnosi isto e citopatologica. In assenza di dati clinici o in presenza di dati clinici non corretti o non adeguatamente raccolti, esiste un concreto rischio di diagnosi errata o incompleta

6 Risposta del patologo alle richieste del clinico (1) Risposta diagnostica Risposta diagnostica Diagnosi di certezza: il campione inviato contiene tutte le informazioni di una precisa malattia; Diagnosi di certezza: il campione inviato contiene tutte le informazioni di una precisa malattia; Diagnosi di compatibilità: il campione contiene alcune informazioni (non tutte) caratteristiche della malattia sospettata. Viene formulato un giudizio di compatibilità con il sospetto clinico. Diagnosi di compatibilità: il campione contiene alcune informazioni (non tutte) caratteristiche della malattia sospettata. Viene formulato un giudizio di compatibilità con il sospetto clinico.

7 Risposta del patologo alle richieste del clinico (2) Risposta non diagnostica Risposta descrittiva: il campione inviato contiene alterazioni aspecifiche, che si possono riscontrare in varie patologie (es. la flogosi). Non si possono pertanto trarre conclusioni precise su una malattia. Risposta descrittiva: il campione inviato contiene alterazioni aspecifiche, che si possono riscontrare in varie patologie (es. la flogosi). Non si possono pertanto trarre conclusioni precise su una malattia. Risposta non descrittiva: il materiale è in quantità insufficiente, non proviene dalla sede adeguata, non è stato adeguatamente trattato (mal fissato). In questi casi la risposta del patologo contiene lindicazione alleffettuazione di un nuovo prelievo. Risposta non descrittiva: il materiale è in quantità insufficiente, non proviene dalla sede adeguata, non è stato adeguatamente trattato (mal fissato). In questi casi la risposta del patologo contiene lindicazione alleffettuazione di un nuovo prelievo.

8 Anatomia Patologica Quali materiali biologici sottoporre allesame ? (1) Biopsie escissionali: Biopsie escissionali: piccoli prelievi di tessuto conseguenti ad un atto chirurgico, Es.: losanghe cutanee asportate per patologie neoplastiche (melanomi, epiteliomi) o infiammatorie (dermatiti). Il numero di biopsie effettuate ed analizzate è direttamente proporzionale allesperienza del medico che le invia al patologo.

9 Anatomia Patologica Quali materiali biologici sottoporre allesame ? Biopsia escissionale: Es. resezione cutanea in paziente con dermatofibrosarcoma protuberans

10 Anatomia Patologica Quali materiali biologici sottoporre allesame ? (2) Agobiopsie Agobiopsie Biopsie effettuate con aghi di calibro compreso tra 0,8 e 1,2 mm (14-16 gauche) a mano libera o sotto guida ecografica o TAC. Vengono ottenuti piccoli frammenti di tessuto da inviare al patologo. Biopsie effettuate con aghi di calibro compreso tra 0,8 e 1,2 mm (14-16 gauche) a mano libera o sotto guida ecografica o TAC. Vengono ottenuti piccoli frammenti di tessuto da inviare al patologo. Solitamente riguardano organi profondi (fegato, rene, prostata). Solitamente riguardano organi profondi (fegato, rene, prostata).

11 Anatomia Patologica Quali materiali biologici sottoporre allesame ? (3) Biopsie endoscopiche Biopsie endoscopiche Durante un esame endoscopico (es. gastroscopia o colonoscopia) vengono prelevati frustoli di tessuto attraverso pinze endoscopiche o fibre ottiche. Trova principali applicazioni nella patologia dellapparato gastroenterico e respiratorio.

12 Biopsia endoscopica in corso di gastroscopia

13 Anatomia Patologica Quali materiali biologici sottoporre allesame ? (4) Reperti chirurgici Reperti chirurgici Tessuti o organi (interi o in parte) asportati in seguito ad intervento chirurgico. Esaminando il pezzo operatorio il patologo si esprime sulla natura della patologia ma anche sulla completezza dellintervento chirurgico. Es. resezione intestinale per tumore: valutazione dei margini di resezione, livello di infiltrazione della neoplasia, mappatura dei linfonodi etc.

14 Anatomia Patologica Quali materiali biologici sottoporre allesame ? Reperti chirurgici Es: asportazione di utero, retto e vescica per carcinoma della cervice uterina localmente avanzato

15 Anatomia Patologica Quali materiali biologici sottoporre allesame ? (5) Esame estemporaneo al congelatore Esame estemporaneo al congelatore Esame patologico di un frammento tissutale che avviene durante lintervento chirurgico, attraverso il rapido congelamento del frammento stesso. Viene effettuato in pochi minuti per una risposta a determinati quesiti del chirurgo (natura benigna o maligna di una lesione, studio di un margine di resezione, presenza di una metastasi linfonodale etc.). Lesame dà al chirurgo la possibilità di modificare il proprio intervento in itinere

16 Esame estemporaneo al congelatore Criostato: strumento che consente Il congelamento rapido di frammenti di tessuto e il successivo taglio di sezioni sottili che opportunamente colorate consentono la diagnosi patologica durante lintervento chirurgico

17 Esame estemporaneo al congelatore Esempio di sezione criostaica

18 Anatomia Patologica Quali materiali biologici sottoporre allesame ? (6) Campioni citologici Agoaspirato Agoaspirato Lagoaspirato è il prodotto di unaspirazione tramite ago sottile (21-23 gauche) infisso in organi o tessuti superficiali o profondi. E rapido e indolore, con basso rischio di complicanze e consente di ottenere cellule sulle quali il patologo esprime un giudizio diagnostico. Può essere eseguito a mano libera (es. nodulo tiroideo o mammario) o sotto guida ecografica o TAC (agoaspirato polmonare o epatico o lesione superficiale ma non palpabile

19 Agoaspirato a mano libera Agoaspirato a mano libera di nodulo mammario superficiale.

20 Anatomia Patologica Quali materiali biologici sottoporre allesame ? (7) Campioni citologici Aspirati di liquidi da cavità (pleura, pericardio o peritoneo); possono essere eseguiti a paziente sveglio o durante un intervento chirurgico. Aspirati di liquidi da cavità (pleura, pericardio o peritoneo); possono essere eseguiti a paziente sveglio o durante un intervento chirurgico. Escreati, broncoaspirati, lavaggi bronchiali (applicazione in patologia respiratoria) Escreati, broncoaspirati, lavaggi bronchiali (applicazione in patologia respiratoria) Urine: la raccolta delle urine (in genere in più campioni) è il primo test diagnostico in caso di sospetta neoplasia vescicale o per un controllo dopo terapia della stessa. Urine: la raccolta delle urine (in genere in più campioni) è il primo test diagnostico in caso di sospetta neoplasia vescicale o per un controllo dopo terapia della stessa.

21 Anatomia Patologica Come inviare il materiale Premessa: qualunque materiale biologico va incontro a più o meno rapida degenerazione e diventa pertanto non più utilizzabile per lesame patologico Premessa: qualunque materiale biologico va incontro a più o meno rapida degenerazione e diventa pertanto non più utilizzabile per lesame patologico Condizione fondamentale per una corretta diagnosi è che il campione pervenga in laboratorio in condizioni ottimali di conservazione Condizione fondamentale per una corretta diagnosi è che il campione pervenga in laboratorio in condizioni ottimali di conservazione

22 Anatomia Patologica Come inviare il materiale (2) Campione istologico fresco (per esame estemporaneo) Campione istologico fresco (per esame estemporaneo) Deve essere portato entro pochissimi minuti in laboratorio e viene in genere trasportato in un contenitore avvolto in garza imbevuta di soluzione fisiologica Deve essere portato entro pochissimi minuti in laboratorio e viene in genere trasportato in un contenitore avvolto in garza imbevuta di soluzione fisiologica Campione citologico Campione citologico Devono essere conservati in frigorifero a 4° e consegnati il più rapidamente possibile. Devono essere conservati in frigorifero a 4° e consegnati il più rapidamente possibile. N.B. I campioni non devono essere mai congelati prima della consegna in laboratorio

23 Anatomia Patologica Come inviare il materiale (3) Campione istologico tradizionale Campione istologico tradizionale Il prelievo istologico che deve essere esaminato in via tradizionale (non al congelatore) deve essere fissato. La fissazione è un processo che arresta la proteolisi e rende permeabile il tessuto al colorante. N.B. La fissazione errata può danneggiare irreversibilmente la morfologia impedendo una corretta diagnosi patologica ed impedendo lapplicazione di metodiche supplementari dindagine (es. immunoistochimica)

24 Anatomia Patologica Come inviare il materiale (4) Sostanze adoperate per la fissazione (in istologia) Formalina: soluzione in acqua (in percentuale variabile dal 35 al 40%) del gas formaldeide; viene usata in soluzione acquosa al 10% (formalina neutra tamponata); è il fissativo più utilizzato Formalina: soluzione in acqua (in percentuale variabile dal 35 al 40%) del gas formaldeide; viene usata in soluzione acquosa al 10% (formalina neutra tamponata); è il fissativo più utilizzato Liquido di Bouin: soluzione satura di acido picrico, acido acetico e formalina Liquido di Bouin: soluzione satura di acido picrico, acido acetico e formalina Glutaraldeide (per la microscopia elettronica) Glutaraldeide (per la microscopia elettronica) Zenker (mercurio) Zenker (mercurio) Carnoy (acido acetico glaciale,etanolo e cloroformio) Carnoy (acido acetico glaciale,etanolo e cloroformio) Per i campioni citologici i fissativi più usati sono letanolo 95°, il liquido di Bouin (per gli espettorati) e lessiccazione allaria

25 Anatomia Patologica Come inviare il materiale (5) Fissazione dei tessuti in istologia Il volume del fissativo deve essere di almeno 10 volte superiore al campione Il volume del fissativo deve essere di almeno 10 volte superiore al campione La velocità di penetrazione del fissativo nel tessuto è variabile (per la formalina 1mm x ora) La velocità di penetrazione del fissativo nel tessuto è variabile (per la formalina 1mm x ora) La fissazione deve avvenire a temperatura ambiente La fissazione deve avvenire a temperatura ambiente

26 Anatomia Patologica Quali informazioni devono accompagnare il campione (1) Informazioni cliniche: Sesso ed età del paziente Sesso ed età del paziente Sede esatta della lesione Sede esatta della lesione Rapporto della lesione con organi adiacenti Rapporto della lesione con organi adiacenti Eventuali patologie concomitanti o pregresse Eventuali patologie concomitanti o pregresse Sintomatologia corrente o pregressa Sintomatologia corrente o pregressa Eventuale esame radiologico (referto) Eventuale esame radiologico (referto) Eventuale familiarità per patologia Eventuale familiarità per patologia

27 Anatomia Patologica Quali informazioni devono accompagnare il campione (2) La richiesta di esame deve inoltre essere corredata da tutte le informazioni possibili riguardanti il mittente (nome del medico che invia il prelievo, reparto di appartenenza, numeri telefonici etc.) e adeguatamente firmata (in modo leggibile).

28 Richiesta di esame istologico Mario Rossi Mario Rossi Neoformazione cutanea Neoformazione cutanea NO NO

29 Richiesta di esame istologico Mario Rossi Mario Rossi 01/01/01 01/01/01 Neoformazione cutanea del III inferiore della gamba destra Neoformazione cutanea del III inferiore della gamba destra Neoformazione insorta da ………. Neoformazione insorta da ………. Contorni, colore, rilevatezza Contorni, colore, rilevatezza Eventuale presenza di altre lesioni Eventuale presenza di altre lesioni SI SI

30 Richiesta di esame citologico Mario Rossi Mario Rossi Espettorato Espettorato NO NO

31 Richiesta di esame citologico Mario Rossi Mario Rossi 01/01/01 01/01/01 Espettorato Espettorato Lesione polmonare con caratteristiche radiologiche …………presente da …….. Lesione polmonare con caratteristiche radiologiche …………presente da …….. Sintomatologia cliniche (sangue nellespettorato?? Tosse secca ???, presenza di febbre????, dolori ???? Sintomatologia cliniche (sangue nellespettorato?? Tosse secca ???, presenza di febbre????, dolori ???? SI SI

32 Fasi di lavorazione in Anatomia Patologica Campione istologico Descrizione macroscopica e campionamento Descrizione delle caratteristiche macroscopiche del campione (dimensioni, colore, consistenza, aspetto ed estensione delle lesioni presenti). Sezionamento del campione per ottenere prelievi dimostrativi delle lesioni e dei rapporti delle stesse con i tessuti normali circostanti; isolamento delle strutture linfonodali eventualmente presenti; i prelievi ottenuti vengono posti in biocassette e quindi in formalina. Il pezzo operatorio viene in genere manipolato dopo una fissazione di circa 24 ore ma può essere campionato anche fresco

33 Fasi di lavorazione in Anatomia Patologica Campione istologico Descrizione macroscopica e campionamento La descrizione macroscopica del pezzo viene in genere riportata insieme alla diagnosi anatomo-patologica (a volte con fotografie allegate) La descrizione macroscopica del pezzo viene in genere riportata insieme alla diagnosi anatomo-patologica (a volte con fotografie allegate) Si può procedere alla marcatura dei margini di resezione con inchiostro di china di vari colori. Questo serve alla valutazione orientata dei margini di resezione in quanto i colori restano sulle sezioni prelevate e permettono di riconoscere i diversi margini e leventuale presenza della lesione in corrispondenza di questi Si può procedere alla marcatura dei margini di resezione con inchiostro di china di vari colori. Questo serve alla valutazione orientata dei margini di resezione in quanto i colori restano sulle sezioni prelevate e permettono di riconoscere i diversi margini e leventuale presenza della lesione in corrispondenza di questi

34 Fasi di lavorazione in Anatomia Patologica Campione istologico Esame macroscopico in laboratorio

35 Fasi di lavorazione in Anatomia Patologica Campione istologico Disidratazione Disidratazione Effettuato il prelievo il tessuto viene completamente disidratato immergendolo in etanolo a concentrazione crescente (da 60 a 100). Successivamente viene fatto passare in un solvente che ne determina la trasparenza (xilolo). Effettuato il prelievo il tessuto viene completamente disidratato immergendolo in etanolo a concentrazione crescente (da 60 a 100). Successivamente viene fatto passare in un solvente che ne determina la trasparenza (xilolo).

36 Fasi di lavorazione in Anatomia Patologica Campione istologico Inclusione Inclusione Dopo la disidratazione il tessuto viene immerso in paraffina liquida, cera con punto di fusione a 54-58°; con il raffreddamento la paraffina ingloba il tessuto. Ne deriverà un blocchetto pronto per il taglio.

37 Fasi di lavorazione in Anatomia Patologica Campione istologico Le fasi di processazione e inclusione sono attualmente realizzate tramite apparecchiature automatiche computer-assistite il che assicura una maggiore affidabilità e riproducibilità.

38 Fasi di lavorazione in Anatomia Patologica Campione istologico Taglio al microtomo Taglio al microtomo Il microtomo è uno strumento dotato di lama che consente di ottenere dal blocchetto di paraffina sezioni molto sottili (intorno ai 5 micron) adatte alla visione con il microscopio Il microtomo è uno strumento dotato di lama che consente di ottenere dal blocchetto di paraffina sezioni molto sottili (intorno ai 5 micron) adatte alla visione con il microscopio Esistono due tipi principali di microtomo Esistono due tipi principali di microtomo 1. Rotativo automatico 2. A slitta

39 Fasi di lavorazione in Anatomia Patologica Campione istologico Effettuato il taglio delle sezioni queste vengono prima distese in un bagno di acqua tiepida, quindi collocate su un vetrino e fatte asciugare in termostato Per permettere al colorante di penetrare nel tessuto si effettua la sparaffinatura in xilolo Quindi si effettua lidratazione del tessuto immergendo i vetrini in concentrazioni decrescenti di alcol etilico ( )

40 Fasi di lavorazione in Anatomia Patologica Campione citologico In genere il campione citologico viene depositato (strisciato) su un vetrino in modo da formare un unico strato di cellule, quindi fissato in etanolo a 95° e quindi colorato

41 Fasi di lavorazione in Anatomia Patologica Campione citologico Pap Test (striscio cervico-vaginale) Il vetrino deve essere contrassegnato con cognome e nome della paziente (a matita sulla parte smerigliata del vetrino) e fissato con fissativo spray (cytofix) Il campione così trattato rimane inalterato per diversi giorni

42 Fasi di lavorazione in Anatomia Patologica Campione citologico Esame citologico delle urine La raccolta si effettua per tre giorni consecutivi consegnando al laboratorio un campione ogni mattina Lurina raccolta è quella della seconda minzione mattutina (scartando lurina della notte) Lurina va consegnata entro 1-3 ore dalla raccolta senza aggiungere nessun liquido fissativo.

43 Fasi di lavorazione in Anatomia Patologica Campione citologico Escreati bronco-polmonari Lesame viene eseguito su materiale raccolto per tre mattine consecutive. Il materiale si ottiene con unespettorazione profonda, quello prevalentemente salivare non è idoneo. Viene raccolto in appositi contenitori di plastica. La consegna deve avvenire entro 1-3 ore dalla raccolta

44 Fasi di lavorazione in Anatomia Patologica Campione citologico Liquidi di versamenti di cavità sierose (pleurico, peritoneale e pericardici) Il liquido è collocato in contenitori eparinati (possibilmente sodio-eparina) La consegna deve avvenire entro 1-3 ore dalla raccolta

45 Fasi di lavorazione in Anatomia Patologica Campione citologico Citologia agoaspirativa I campioni agoaspirativi prelevati altrove devono pervenire come vetrini già strisciati, fissati con citospray. Se la fissazione è avvenuta per immersione in etanolo a 95% i vetrini devono essere consegnati immersi nello stesso liquido Strisci a secco (non fissati) essiccati allaria: non sono raccomandati tranne che per i prelievi da ghiandola salivare e tiroidei comunque in aggiunta agli strisci fissati

46 Fasi di lavorazione in Anatomia Patologica Colorazione Colorazione Le fettine di tessuto ottenute dal taglio del blocchetto di paraffina o le cellule strisciate sono trasparenti (non presentano contrasto apprezzabile dellimmagine). Per definire le diverse parti di tessuto o cellula è necessaria una colorazione adeguata In base alla struttura che lo compone un tessuto assume i coloranti con intensità diversa nelle sue parti

47 Fasi di lavorazione in Anatomia Patologica In base alla composizione chimica: In base alla composizione chimica: 1. Coloranti acidi (colorano il citoplasma cellulare) 2. Coloranti basici (colorano il nucleo cellulare) 3. Coloranti neutri (acido+basico: colorano nucleo e citoplasma)

48 Fasi di lavorazione in Anatomia Patologica Principali coloranti in AP Ematossilina*-eosina (istologia) Ematossilina*-eosina (istologia) Lematossilina colora i nuclei in blu-viola Leosina colora in rosa i citoplasmi, connettivo e le sostanze intercellulari Papanicolau (citologia) miscela di ematossilina, EA50 e Og6 Papanicolau (citologia) miscela di ematossilina, EA50 e Og6 * lematossilina è una sostanza estratta dal fusto di una pianta * lematossilina è una sostanza estratta dal fusto di una pianta la colorazione avviene tramite il suo prodotto ossidato, lemateina la colorazione avviene tramite il suo prodotto ossidato, lemateina

49 Fasi di lavorazione in Anatomia Patologica Colorazioni speciali Vengono adoperate (in aggiunta allEE) per dimostrare più selettivamente particolari componenti cellulari o tissutali. Con lintroduzione di tecniche più avanzate il loro uso si è ridimensionato

50 Fasi di lavorazione in Anatomia Patologica Colorazioni speciali PAS (acido periodico Schiff) consente di identificare il glicogeno, mucine, glicoproteine, membrane basali e vari miceti (Candida Albicans) PAS (acido periodico Schiff) consente di identificare il glicogeno, mucine, glicoproteine, membrane basali e vari miceti (Candida Albicans)

51 Fasi di lavorazione in Anatomia Patologica Colorazione PAS in una neoplasia testicolare intratubulare A destra le cellule neoplastiche PAS+ A sinistra lepitelio normale PAS-

52 Fasi di lavorazione in Anatomia Patologica Colorazioni speciali Colorazioni per micro-organismi Colorazioni per micro-organismi Coloranti per evidenziare batteri, funghi, parassiti e micobatteri Es. colorazione Ziehl-Neelsen evidenzia i micobatteri della tubercolosi.

53 Fasi di lavorazione in Anatomia Patologica Colorazioni speciali Colorazioni per argentaffinità (capacità di una sostanza di ridurre i sali dargento) e argirofilia (reazione indotta con lausilio di una sostanza riducente). Fontana Masson per argentaffinità Grimelius per argirofilia Queste colorazioni sono utili per identificare cellule neuroendocrine e loro derivati neoplastici

54 Fasi di lavorazione in Anatomia Patologica Reazione argentaffine di Fontana Masson Evidenzia (in colore bruno) i granuli di secrezione posti nel citoplasma alla base della cellula in un tumore neuroendocrino (carcinoide)

55 Fasi di lavorazione in Anatomia Patologica Colorazioni speciali Reticolo: le fibre reticolari sono presenti nei tessuti connettivali umani e composti principalmente da vari tipi di collagene (tipo III e IV). Le colorazioni che evidenziano le fibre reticolari (es. Gomori) vengono adoperate per distinguere neoplasie epiteliali e connettivali, varie neoplasie connettivali tra loro e tra neoplasie invasive e neoplasie non infiltranti (in situ) Reticolo: le fibre reticolari sono presenti nei tessuti connettivali umani e composti principalmente da vari tipi di collagene (tipo III e IV). Le colorazioni che evidenziano le fibre reticolari (es. Gomori) vengono adoperate per distinguere neoplasie epiteliali e connettivali, varie neoplasie connettivali tra loro e tra neoplasie invasive e neoplasie non infiltranti (in situ)

56 Fasi di lavorazione in Anatomia Patologica Colorazioni speciali Colorazioni tricromiche Colorazioni tricromiche Consentono di evidenziare contemporaneamente in un tessuto nuclei, citoplasmi e collagene extracellulare

57 Fasi di lavorazione in Anatomia Patologica Colorazioni speciali Pearls (emosiderina e altri sali e ossidi di ferro) Pearls (emosiderina e altri sali e ossidi di ferro) Fontana Masson (melanina) Fontana Masson (melanina) Von Kossa (depositi di calcio) Von Kossa (depositi di calcio)

58 Fasi di lavorazione in Anatomia Patologica Metodiche accessorie Lo sviluppo della tecnologia ha consentito di introdurre in campo diagnostico anatomo patologico una serie di metodiche che permettono una diagnosi più accurata e talora sono utili (in campo oncologico) per definire la prognosi di malattia Immunoistochimica Immunoistochimica Biologia molecolare Biologia molecolare Microscopia elettronica Microscopia elettronica

59 Metodiche accessorie Immunoistochimica Insieme di tecniche che consentono di identificare nei preparati microscopici prodotti o costituenti molecolari di una cellula attraverso una reazione antigene- anticorpo opportunamente evidenziata. Queste metodiche possono essere applicate a sezioni istologiche incluse in paraffina o su materiale criostatico (da diagnostica intraoperatoria) o su preparati citologici.

60 Metodiche accessorie Immunoistochimica La metodica si basa sullutilizzo di anticorpi specifici (immunoglobuline) diretti contro lantigene da ricercare che si trova (o dovrebbe trovarsi) nel tessuto indagato o nelle cellule: la reazione antigene-anticorpo, in presenza di particolari cromogeni produce precipitati colorati visibili al microscopio.

61 Metodiche accessorie Immunoistochimica Lanticorpo specifico viene definito anticorpo primario; dopo il legame con lantigene viene posto in incubazione con un anticorpo (secondario) coniugato con un sistema di rivelazione che lega la porzione FC del primario. Il sistema di rivelazione più adoperato è il complesso Avidina Biotina (ABC) Il sistema di rivelazione più adoperato è il complesso Avidina Biotina (ABC)

62 Metodiche accessorie Immunoistochimica Le metodiche immunoistochimiche hanno trovato ampio utilizzo nella caratterizzazione delle neoplasie solide e del sistema emopoietico Queste metodiche hanno reso obsolete e superate molte delle colorazioni speciali in quanto hanno: Alta sensibilità e specificità Alta sensibilità e specificità Fattibilità su materiale routinario anche darchivio Fattibilità su materiale routinario anche darchivio Ottima correlazione con le osservazioni morfologiche tradizionali Ottima correlazione con le osservazioni morfologiche tradizionali Ampio pannello di anticorpi disponibili Ampio pannello di anticorpi disponibili

63 Metodiche accessorie Immunoistochimica Scopi dellanalisi immunoistochimica 1. Diagnostico 2. Prognostico 3. Terapeutico Linsieme dei marcatori espressi costituisce limmunofenotipo della cellula neoplastica (fenotipo originale + fenotipo indotto dai danni genetici che hanno prodotto la neoplasia)

64 Metodiche accessorie Immunoistochimica Anticorpi maggiormente adoperati in IHC Citocheratine: famiglia di proteine fibrose presenti in quasi tutti gli epiteli; ne esistono oltre 20, classificate in base al loro peso molecolare Citocheratine: famiglia di proteine fibrose presenti in quasi tutti gli epiteli; ne esistono oltre 20, classificate in base al loro peso molecolare Rappresentano un utile marker della differenziazione epiteliale di un tumore indipendentemente dalla sua origine specie se adoperate in combinazione Rappresentano un utile marker della differenziazione epiteliale di un tumore indipendentemente dalla sua origine specie se adoperate in combinazione Es. CK7+CK20+: neoplasie del pancreas e dellurotelio CK7+CK20-: neoplasie mammella, polmone, endometrio CK7+CK20-: neoplasie mammella, polmone, endometrio CK 7-CK20+: neoplasie del colon CK 7-CK20+: neoplasie del colon n.b. questi fenotipi sono mantenuti in genere nelle metastasi n.b. questi fenotipi sono mantenuti in genere nelle metastasi

65 Metodiche accessorie Immunoistochimica Citocheratina in carcinoma del pancreas scarsamente differenziato

66 Metodiche accessorie Immunoistochimica Anticorpi maggiormente adoperati in IHC Vimentina: è uno dei principali filamenti citoplasmatici intermedi ed è caratteristica delle cellule di natura mesenchimale come gli endoteli, i fibroblasti e le cellule muscolari Vimentina: è uno dei principali filamenti citoplasmatici intermedi ed è caratteristica delle cellule di natura mesenchimale come gli endoteli, i fibroblasti e le cellule muscolari GFAP: filamento citoplasmatico tipico delle cellule nervose; viene usata per caratterizzare le neoplasie cerebrali e quelle dei nervi periferici GFAP: filamento citoplasmatico tipico delle cellule nervose; viene usata per caratterizzare le neoplasie cerebrali e quelle dei nervi periferici Actina: proteina contrattile responsabile della motilità delle cellule; marker dei tumori muscolari Actina: proteina contrattile responsabile della motilità delle cellule; marker dei tumori muscolari Recettori ormonali: estrogeni e progesterone, espressi dalle neoplasie mammarie ed endometriali Recettori ormonali: estrogeni e progesterone, espressi dalle neoplasie mammarie ed endometriali

67 Metodiche accessorie Immunoistochimica Es. GFAP in astrocitoma (neoplasia maligna cerebrale) Diagnosi differenziale con neoplasie metastatiche al cervello

68 Metodiche accessorie Immunoistochimica es. citomegalovirus in colite es. citomegalovirus in colite virale (paz. immunodepresso) virale (paz. immunodepresso)

69 Metodiche accessorie Immunoistochimica Marcatori neuroendocrini Cromogranina: famiglia di proteine acide (A,B,C) presenti in quasi tutti i tumori neuroendocrini Cromogranina: famiglia di proteine acide (A,B,C) presenti in quasi tutti i tumori neuroendocrini NSE (enolasi neuro specifica):presente in neuroni e cellule nervose NSE (enolasi neuro specifica):presente in neuroni e cellule nervose Sinaptofisina: presente nelle vescicole pre- sinaptiche ed isolabile nelle neoplasie neuroendocrine di surrene e tiroide Sinaptofisina: presente nelle vescicole pre- sinaptiche ed isolabile nelle neoplasie neuroendocrine di surrene e tiroide La combinazione di questi marcatori consente si caratterizzare gran parte delle neoplasie neuroendocrine di varie sedi corporee

70 Metodiche accessorie Immunoistochimica Positività di cromogranina in carcinoma neuroendocrino (carcinoide) dello stomaco

71 Metodiche accessorie Immunoistochimica Antigene prostatico specifico (PSA) e Fosfatasi acida prostatica (PAP): sostanze proteiche secrete dal tessuto prostatico normale e neoplastico. Antigene prostatico specifico (PSA) e Fosfatasi acida prostatica (PAP): sostanze proteiche secrete dal tessuto prostatico normale e neoplastico. Utili per la caratterizzazione del carcinoma prostatico specie se metastatico Utili per la caratterizzazione del carcinoma prostatico specie se metastatico Il loro dosaggio nel tessuto è un indice utile anche nel caso di ripresa di malattia dopo trattamento Il loro dosaggio nel tessuto è un indice utile anche nel caso di ripresa di malattia dopo trattamento

72 Metodiche accessorie Immunoistochimica Espressione di PSA nel carcinoma della prostata

73 Metodiche accessorie Immunoistochimica Marcatori di proliferazione Ki67 e MIB1, PCNA: anticorpi che legano in genere cellule nella fase proliferativa del ciclo cellulare Presentano buona correlazione con le mitosi cellulari e sono utili per valutare lindice proliferativo di una neoplasia (generalmente indicativo di aggressività biologica della stessa) (generalmente indicativo di aggressività biologica della stessa)

74 Metodiche accessorie Immunoistochimica Es. MIB1 espresso in un centro germinativo di un linfonodo

75 Metodiche accessorie Immunoistochimica Biopsia colon

76 Metodiche accessorie Immunoistochimica Positività di citocheratina

77 Metodiche accessorie Immunoistochimica Luso combinato di più marcatori immunoistochimici può consentire di definire dei fenotipi neoplastici ed associarli a profili di rischio o di responsività a determinate terapie

78 Metodiche accessorie Immunoistochimica Carcinoma della mammella La presenza di recettori per estrogeni e progesterone in una neoplasia mammaria definisce una tumore responsivo al trattamento ormonale

79 Metodiche accessorie Immunoistochimica Carcinoma della mammella Carcinoma della mammella Lespressione in una neoplasia mammaria delloncogene CERBB2-NEU definisce un tumore aggressivo con alto rischio di metastasi a distanza ed è in genere associato a recettori ormonali negativi

80 Immunoistochimica Limiti della metodica Falsi negativi 1. Perdita dellantigene per alterazioni del tessuto 2. Concentrazione bassa dellantigene 3. Impiego di anticorpi non adeguati o a basse concentrazioni Falsi positivi 1. Legami non specifici anticorpo-tessuto 2. Presenza di anticorpi contaminanti nella soluzione impiegata 3. Reattività crociata dellanticorpo che potrebbe reagire con un antigene diverso da quello ricercato I risultati dellindagine vanno sempre correlati allesame morfologico classico

81 Metodiche diagnostiche accessorie Biologia molecolare Biologia molecolare 1. Ibridazione in situ 2. PCR (Polymerase chain reaction)

82 Metodiche diagnostiche accessorie Ibridazione in situ Utilizza la capacità di molecole a singolo filamento di acidi nucleici di legare un filamento complementare Il principio di base è simile allIHC con gli acidi nucleici che sostituisco le proteine da ricercare Il principio di base è simile allIHC con gli acidi nucleici che sostituisco le proteine da ricercare Le sonde molecolari devono essere marcate (per la visualizzazione) da un sistema di rivelazione che può essere enzimatico o fluorescente (FISH)

83 Metodiche diagnostiche accessorie Ibridazione in situ La variante non fluorescente trova la principale applicazione nella ricerca di virus, specie il virus di Epstein Barr L Ibridazione fluorescente trova applicazioni nello studio dellamplificazione genica e nelle traslocazioni cromosomiche (es. nel carcinoma della mammella le pazienti con amplificazioni delloncogene Her2-Neu possono essere trattate con il farmaco Herceptin, anticorpo diretto contro loncogene stesso) (es. nel carcinoma della mammella le pazienti con amplificazioni delloncogene Her2-Neu possono essere trattate con il farmaco Herceptin, anticorpo diretto contro loncogene stesso)

84 Metodiche diagnostiche accessorie Metodiche diagnostiche accessorie PCR (Polymerase chain reaction) Tecnica di amplificazione che permette di ottenere un numero di copie di un acido nucleico maggiore di quello di partenza. Il prodotto finale può essere visualizzato tramite coloranti che legano il DNA

85 Metodiche diagnostiche accessorie PCR (Polymerase chain reaction) Lapplicazione pratica più comune è la determinazione della presenza di monoclonalità in una popolazione linfoide. In pazienti portatori di linfomi la PCR consente di valutare popolazioni neoplastiche eventualmente residue dopo la chemioterapia (malattia minima residua)

86 Metodiche diagnostiche accessorie Microscopia elettronica Utilizza un microscopio ad elevato potere risolutivo in grado di fornire immagini ad altissimo ingrandimento (utilizza un fascio di elettroni al posto della luce) La tecnica necessita di una speciale preparazione del campione: deve essere fissato in glutaraldeide al 2.5%, post-fissato in osmio-tetrossido, incluso in resina termo indurente e colorato con metalli pesanti (piombo) coloranti opachi per gli elettroni

87 Metodiche diagnostiche accessorie Microscopia elettronica Applicazioni principali * nella diagnosi differenziale di: 1. Neoplasie indifferenziate 2. Neoplasie pleuriche (mesoteliomi vs adenocarcinomi) 3. Neoplasie del mediastino 4. Neoplasie pediatriche a piccole cellule 5. Neoplasie neuroendocrine 6. Neoplasie dei tessuti molli * lavvento dellimmunoistochimica ha ridotto il campo di applicazione della ME


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