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In realtà gli spettri di standard e campione non sono identici Si usa lintegrale spettrale Lintegrale va calcolato in !

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Presentazione sul tema: "In realtà gli spettri di standard e campione non sono identici Si usa lintegrale spettrale Lintegrale va calcolato in !"— Transcript della presentazione:

1 In realtà gli spettri di standard e campione non sono identici Si usa lintegrale spettrale Lintegrale va calcolato in !

2 Osservabili: spettro di emissione ecc. fissa. em. variabile. F in funzione di em..

3 Rilassamento del solvente E h h S0S0 S1S1 S 1 S 0 Ass. Em.

4 H2OH2OEtOHDMFc-Hex 6-propionil-2-(N,N-dimetilammino)naftalene (PRODAN) d = 2.8 Debye d = 10 Debye Rilassamento del solvente

5 H, hexane; CH, cyclohexane; T, toluene; EA, ethyl acetate; Bu, n-butanol. 4-dimetilammino-4'-nitrostilbene (DNS) Rilassamento del solvente

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8 Denaturazione proteica The use of fluorescence methods to monitor unfolding transitions in proteins. Biophys. J : 482.

9 Partizione acqua-membrana Orioni et al., BBA KPKP

10 Transizioni di fase in membrana

11 Biophys. J. 2000, 78: 290 Bocchinfuso et al., J. Pept. Sci., 2009

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14 Red-edge excitation Eccezione alla regola di Kasha!

15 Red-edge excitation

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17 Segnale di fondo: diffusione elastica ed anelastica della luce

18 Perché vediamo la luce del laser anche osservando a 90°?

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20 Scattering Rayleigh È una diffusione elastica. Lenergia e la lunghezza donda della radiazione vengono conservate.

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23 Visione quantistica Il dipolo indotto oscilla alla stessa frequenza del campo applicato. Un dipolo oscillante emette radiazione. La molecola emette radiazione della stessa frequenza di quella incidente. Visione classica

24 Normalmente la diffusione elastica non crea problemi perché è alla lunghezza donda di eccitazione (mentre la fluorescenza è a lunghezze donda maggiori). E dovuta essenzialmente al solvente (C solvente >>C soluto ). Si può sottrarre misurando uno spettro del solo solvente.

25 Diffusione Raman (anelastica)

26 Stokes ed anti-Stokes A T ambiente normalmente la linea anti- Stokes non si vede.

27 Visione classica Se la molecola vibra, con frequenza m, la sua polarizzabilità cambierà con la stessa frequenza. Il dipolo oscillante emetterà a p, p m,, p m.

28 Lenergia persa dipende dai livelli vibrazionali della molecola coinvolta.

29 La differenza in energia (non ) tra luce incidente e diffusa è costante.

30 Raman e fluorescenza Come la fluorescenza è a lunghezze donda maggiori delleccitazione A differenza della fluorescenza si sposta al variare della lunghezza donda di eccitazione. Può essere spostata a lunghezze donda diverse da quelle di emissione cambiando lunghezza donda di eccitazione. È dovuta essenzialmente al solvente e può essere sottratta.

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32 Osservabili: spettro di eccitazione em. fissa. ecc. variabile. F in funzione di ecc.. Se: unico fluoroforo indipendente da ecc. (unico stato eccitato). A<<1 Allora F( ecc. ) A( ecc. ) Altrimenti: separazione dei diversi cromofori

33 exc =variable, em = fixed exc =510 nm exc =510 nm exc =480 nm exc =480 nm em =525 nm em =525 nm em =540 nm em =540 nm


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