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DIPARTIMENTO DI CHIMICA G. CIAMICIAN – CHIMICA ANALITICA STRUMENTALE Next topics…. Orariodatan° ore LC-MS – Prof. Zattoni 12-1326-111 Accoppiamento LC-MS.

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1 DIPARTIMENTO DI CHIMICA G. CIAMICIAN – CHIMICA ANALITICA STRUMENTALE Next topics…. Orariodatan° ore LC-MS – Prof. Zattoni Accoppiamento LC-MS. Componenti di uno spettrometro di massa. Accoppiamento online della MS alla cromatografia liquida con sorgenti ioniche a pressione atmosferica Doppia spettrometria di massa Analizzatori di massa a quadrupolo, a trappola ionica, a tempo di volo, a trasformata di Fourier. Principi di doppia spettrometria di massa: modalità di acquisizione del segnale e modalità di scansione. Spettrometri di massa ibridi MS di molecole biologiche. Approcci alla MS per la proteomica. Spettrometria di massa di molecole biologiche. Scelta della tecnica di ionizzazione e dellanalizzatore di massa. Considerazioni sulla risoluzione dello spettrometro: massa monoisotopica e massa media. Approcci allanalisi proteomica: Obiettivi dellindagine proteomica. Proteomica sistematica, funzionale, differenziale. Approcci top-down, bottom-up, shotgun. Frammentazione dei peptidi. Digestione enzimatica. Interpretazione dello spettro di massa di peptidi Accoppiamento della MS con tecniche separative multidimensionali per la proteomica. Approcci gel-based e gel-free. 2D PAGE MS/MS. 2D LC MS/MS. Sequenziamento de novo e identificazione da banca dati. Totale ore5

2 DIPARTIMENTO DI CHIMICA G. CIAMICIAN – CHIMICA ANALITICA STRUMENTALE Schema di uno spettrometro di massa Sistema di introduzione Sorgente di ioni Analizzatore di massa Sistema di vuoto Rivelatore SegnaleComputer Campione torr Campione Ioni

3 DIPARTIMENTO DI CHIMICA G. CIAMICIAN – CHIMICA ANALITICA STRUMENTALE Classificazione delle sorgenti ioniche Sorgenti dure (elevata frammentazione) –Ionizzazione elettronica Sorgenti molli (bassa frammentazione) –Ionizzazione chimica –Desorbimento (MALDI, elettrospray) –Fotoionizzazione

4 DIPARTIMENTO DI CHIMICA G. CIAMICIAN – CHIMICA ANALITICA STRUMENTALE Sorgenti ioniche Stato del campioneSorgente LiquidoElettrospray – nanospray APCI ( atmospheric pressure chemical ionization ) APPI ( atmospheric pressure photoionization ) LC: flussi ~ 0.1 – 1 cm 3 min -1. Se leluente è acqua, 0.1 cm 3 min -1 = 5.6 mmol min -1 = 135 cm 3 min -1 (c.n.) Nano-HPLC: flussi ~ cm 3 min cm 3 min (c.n.)

5 DIPARTIMENTO DI CHIMICA G. CIAMICIAN – CHIMICA ANALITICA STRUMENTALE Meccanismo fisico dellelettrospray Lapplicazione di un potenziale elettrico ad alto voltaggio ad una goccia di liquido ne provoca la frammentazione in goccioline fini. La causa e la repulsione elettrostatica tra le cariche che si generano nella goccia.

6 DIPARTIMENTO DI CHIMICA G. CIAMICIAN – CHIMICA ANALITICA STRUMENTALE Sistema di nebulizzazione elettrospray Cono di Taylor Punta dellago

7 DIPARTIMENTO DI CHIMICA G. CIAMICIAN – CHIMICA ANALITICA STRUMENTALE Sistema di desolvatazione per elettrospray Campione Liquido di trasporto Gas di trasporto Cono di Taylor Capillare riscaldato Gas di desolvatazione 2-6 kV + - Gocce di circa 1 µm

8 DIPARTIMENTO DI CHIMICA G. CIAMICIAN – CHIMICA ANALITICA STRUMENTALE Meccanismo di deplezione degli ioni Soluzione del campione 4000 V Pressione atmosferica Calore o gas secco Il calore e/o il gas secco causano la riduzione delle dimensioni delle gocce Vapori del solvente Spettrometro di massa Livelli successivi di vuoto (2 torr – 0.1 torr – 0.01 torr) Limite di Rayleigh: Limite di dimensioni della al quale si prevede la frammentazione della goccia. Esplosione Coulombiana q 2 = 8π 2 ε 0 γd 3 q = carica totale della goccia ε 0 = permittività elettrica del mezzo γ = tensione superficiale della goccia d = diametro della goccia

9 DIPARTIMENTO DI CHIMICA G. CIAMICIAN – CHIMICA ANALITICA STRUMENTALE Lelettrospray genera spettri multicarica m/z La carica degli ioni è dovuta agli ioni metallici (es Na + ) o ai protoni associati alla molecola. Gli addotti carichi sono quindi della forma: (M + H) +, (M + 2H) 2+, …, (M + nH) n+

10 DIPARTIMENTO DI CHIMICA G. CIAMICIAN – CHIMICA ANALITICA STRUMENTALE Sorgenti ioniche a desorbimento Lanalita viene codepositato su un bersaglio con una matrice, scelta per favorire la vaporizzazione dellanalita. Caratteristiche della matrice: –Elevata assorbività alla lunghezza donda del laser. –Massa molare abbastanza bassa da sublimare facilmente. –Bassa reattività chimica. –Stabilità al vuoto. Le matrici più utilizzate sono acidi aromatici Desorbimento/ionizzazione laser assistiti da matrice (Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization, MALDI)

11 DIPARTIMENTO DI CHIMICA G. CIAMICIAN – CHIMICA ANALITICA STRUMENTALE Il processo MALDI Il bersaglio viene colpito da un impulso laser che viene assorbito dalla matrice e provoca la formazione di un plasma contenente gli atomi dellanalita ed atomi e ioni della matrice.

12 DIPARTIMENTO DI CHIMICA G. CIAMICIAN – CHIMICA ANALITICA STRUMENTALE MALDI-TOF MS Range di massa fino a 10 6 Analizzatore a tempo di volo.

13 DIPARTIMENTO DI CHIMICA G. CIAMICIAN – CHIMICA ANALITICA STRUMENTALE Lo spettro di massa Spettro di massa di ioni monocarica (MALDI/TOFMS) Spettro di massa del batterio intero Escherichia coli Intensità relativa m/z

14 DIPARTIMENTO DI CHIMICA G. CIAMICIAN – CHIMICA ANALITICA STRUMENTALE MALDI: vantaggi e limitazioni Poco sensibile alle contaminazioni (sali, tamponi, detergenti ecc.) Solitamente non richiede complessi passaggi di purificazione del campione. Può analizzare velocemente miscele complesse di analiti (lo spettro è facile da interpretare) = Non è una sorgente a flusso La ionizzazione è un processo competitivo, per cui la simultanea presenza di più analiti può dare luogo ad interferenze. Lanalisi quantitativa è limitata dalla ridotta omogeneità del campione.

15 DIPARTIMENTO DI CHIMICA G. CIAMICIAN – CHIMICA ANALITICA STRUMENTALE Schema di uno spettrometro di massa Sistema di introduzione Sorgente di ioniAnalizzatore di massa Sistema di vuoto Rivelatore SegnaleComputer Campione torr Campione (gassoso) Ioni

16 DIPARTIMENTO DI CHIMICA G. CIAMICIAN – CHIMICA ANALITICA STRUMENTALE Risoluzione La capacità di uno spettrometro di massa di differenziare le masse è generalmente espressa dalla risoluzione R definita come : R = m/Δm dove Δm è la differenza di massa tra due picchi adiacenti risolti e m è la massa nominale del primo picco (o la media delle masse dei due picchi). Due picchi sono considerati separati se laltezza della valle tra di essi è inferiore ad una certa percentuale della loro altezza (di solito il 10%). Uno spettrometro con una risoluzione di risolverà due picchi con valori di m/z 400,0 e 400,1 (o di 40,00 e 40,01). Gli spettrometri commerciali hanno R che variano circa tra 500 e

17 DIPARTIMENTO DI CHIMICA G. CIAMICIAN – CHIMICA ANALITICA STRUMENTALE Risoluzione Picchi risolti al 10% della valle Picchi risolti al 80% della valle Intensità Definizione alternativa La risoluzione di un picco isolato si può anche definire come larghezza δm del picco al x% dellaltezza. Spesso si prende x = 50%, e δm è la larghezza a metà altezza.

18 DIPARTIMENTO DI CHIMICA G. CIAMICIAN – CHIMICA ANALITICA STRUMENTALE Classi di analizzatori di massa A settore magnetico A doppia focalizzazione A quadrupolo lineare (Q) Trappola ionica a quadrupolo (QIT) A tempo di volo (TOF) A risonanza ciclotronica e trasformata di Fourier (FT-ICR)

19 DIPARTIMENTO DI CHIMICA G. CIAMICIAN – CHIMICA ANALITICA STRUMENTALE Analizzatore di massa a quadrupolo Potenziale nel quadrupolo

20 DIPARTIMENTO DI CHIMICA G. CIAMICIAN – CHIMICA ANALITICA STRUMENTALE Traiettorie dello ione piano xz piano yz piano xz piano yz Traiettoria instabile lungo x, stabile lungo y Traiettoria stabile sia lungo x che lungo y

21 DIPARTIMENTO DI CHIMICA G. CIAMICIAN – CHIMICA ANALITICA STRUMENTALE Traiettorie ioniche nella trappola a quadrupolo Moto degli ioni in direzione z Moto degli ioni in direzione r tempo Gli ioni vengono intrappolati forzandoli su traiettorie chiuse stabili allinterno della trappola. Quando la traiettoria di uno ione diventa instabile, questo esce dalla trappola e viene rivelato.

22 DIPARTIMENTO DI CHIMICA G. CIAMICIAN – CHIMICA ANALITICA STRUMENTALE Analizzatore di massa a quadrupolo Massimo valore m/z ~ Risoluzione ~ –I quadrupoli sono strumenti a bassa risoluzione –Si lavora normalmente alla risoluzione di una unità di massa. Leggero, di dimensioni contenute Facile da accoppiare alla cromatografia Efficiente trasmissione degli ioni Necessaria una elevata precisione nellallineamento delle barre degli elettrodi

23 DIPARTIMENTO DI CHIMICA G. CIAMICIAN – CHIMICA ANALITICA STRUMENTALE Analizzatore a tempo di volo (TOF) Ioni positivi Sorgente L d Zona di accelerazione con campo elettrostatico E V = 0 dE = V 0 = V V = V 0

24 DIPARTIMENTO DI CHIMICA G. CIAMICIAN – CHIMICA ANALITICA STRUMENTALE Analizzatore di massa a tempo di volo Massimo valore m/z > Risoluzione fino a Il reflectron consente di: –Ridurre le dimensioni –Aumentare la risoluzione Ideale accoppiamento con sorgenti pulsate Efficiente trasmissione degli ioni Per la doppia spettrometria di massa può essere accoppiato con altri analizzatori (qTOF)

25 DIPARTIMENTO DI CHIMICA G. CIAMICIAN – CHIMICA ANALITICA STRUMENTALE Principi della ICRFT MS Gli ioni in un campo elettromagnetico si muovono su traiettorie circolari (o a spirale), generando esse stesse una radiazione elettromagnetica. Tale r.e.m. può essere rivelata da unantenna, generando un segnale che contiene le radiofrequenze di tutti gli ioni in funzione del tempo. Mediante trasformata di Fourier il segnale viene passato dal dominio del tempo al dominio delle frequenze, e di conseguenza al dominio delle masse.

26 DIPARTIMENTO DI CHIMICA G. CIAMICIAN – CHIMICA ANALITICA STRUMENTALE Analizzatore a risonanza ciclotronica Piano di ricezione Piano di emissione

27 DIPARTIMENTO DI CHIMICA G. CIAMICIAN – CHIMICA ANALITICA STRUMENTALE Analisi di massa a trasformata di Fourier Segnale nel dominio del tempoSegnale trasformato nel dominio delle frequenze m/z

28 DIPARTIMENTO DI CHIMICA G. CIAMICIAN – CHIMICA ANALITICA STRUMENTALE Analizzatore di massa a ICR FT Massimo valore m/z > Risoluzione fino a Possibilità di confinare gli ioni per la MS/MS. Massima accuratezza nella determinazione delle masse. Semplicità nel passaggio da ioni positivi a ioni negativi. Prezzi ancora proibitivi per molte applicazioni (500 –1 400 k)

29 DIPARTIMENTO DI CHIMICA G. CIAMICIAN – CHIMICA ANALITICA STRUMENTALE Doppia spettrometria di massa (MS/MS) Ionizzazione e frammentazione analisi di massa m/z decomposizione m1m1 analisi di massa m/z m1m1

30 DIPARTIMENTO DI CHIMICA G. CIAMICIAN – CHIMICA ANALITICA STRUMENTALE Applicazioni della MS/MS Maggior contenuto di informazioni Studio della struttura –Informazioni addizionali per determinare la struttura di uno ione Rivelazione selettiva di uno ione –Drastica riduzione delle interferenze Studio delle reazioni ione-molecola

31 DIPARTIMENTO DI CHIMICA G. CIAMICIAN – CHIMICA ANALITICA STRUMENTALE MS/MS nello spazio e nel tempo MS/MS nello spazio MS/MS nel tempo Scansione dello ione prodotto Cella di collisione Tempo 1Tempo 2Tempo 3 Scansione Selezione m/z

32 DIPARTIMENTO DI CHIMICA G. CIAMICIAN – CHIMICA ANALITICA STRUMENTALE Combinazioni strumentali per MS/MS MS/MS nello spazio Settori elettrico-magnetico: EB/EB o BE/BE (max MS 4 ). Triplo quadrupolo: QqQ Tempo di volo lineare/reflectron: TOF/TOF. Analizzatori ibridi: Analizzatori ibridi: EBqQ QqTOF MS/MS nel tempo (MS n ) Trappola ionica a quadrupolo (max MS 8 ) Risonanza ciclotronica (ICR FTMS) Combinati: Combinati: Qq(trap) MS n nello spazio e/o nel tempo

33 DIPARTIMENTO DI CHIMICA G. CIAMICIAN – CHIMICA ANALITICA STRUMENTALE Modalità di scansione MS/MS Scansione dello ione prodotto Scansione Selezione m/z Scansione dello ione precursore Scansione Selezione m/z Scansione di perdita neutra Monitoraggio di reazione selezionata Scansione m/z = x Scansione m/z = x-a Selezione del precursore m/z = a Selezione del frammento m/z = b Analizzatore di massa fisso Spettrometro di massa a scansione Scansione dello ione prodotto Scansione dello ione precursore Scansione di perdita neutra Monitoraggio di reazione selezionata Simbolismo alternativo

34 DIPARTIMENTO DI CHIMICA G. CIAMICIAN – CHIMICA ANALITICA STRUMENTALE Modalità di scansione MS/MS 1.Scansione dello ione prodotto: consiste nel selezionare uno ione precursore, di m/z fissato, e nella determinazione di tutti gli ioni prodotti dalla frammentazione attivata per collisione (CID). Se nella cella di collisione si usa un gas reagente, si osservano i prodotti di reazione attivate per collisione (CAR). Quando vengono prodotti solo ioni frammento, questa modalità di scansione è detta anche scansione di ioni frammento. 2.Scansione dello ione precursore: consiste nello scegliere uno ione prodotto e nel determinare gli ioni precursori. Permette di identificare gli ioni precursori di un certo frammento. Questa modalità di scansione, che non si può realizzare con la in time MS/MS, richiede la focalizzazione del secondo analizzatore su di uno ione selezionato, e la scansione di massa sul primo analizzatore. Vengono rivelati gli ioni precursori che per reazione o frammentazione producono ioni figlio della massa selezionata.

35 DIPARTIMENTO DI CHIMICA G. CIAMICIAN – CHIMICA ANALITICA STRUMENTALE Modalità di scansione MS/MS 3.Scansione di perdita neutra (NLS): consiste nello scegliere un frammento neutro e nel rivelare tutte le frammentazioni che portano alla perdita di tale frammento. Come nel caso della scansione dello ione precursore, questa modalità non è realizzabile in MS/MS nel tempo. La scansione richiede che entrambi gli analizzatori scandiscano contemporaneamente, ma con una differenza di massa fissa a fra di loro. Quando uno ione di massa m attraversa il primo analizzatore, viene rivelato solo se produce un frammento di massa m – a. 4.Monitoraggio di reazioni selezionate (SRM): consiste nel selezionare una reazione di frammentazione. In questa modalità, entrambi gli analizzatori sono focalizzati su masse selezionate. Non si ha quindi scansione. È analogo al monitoraggio di ioni selezionati in spettrometria di massa singola, ma in questo caso gli ioni selezionati dal primo analizzatore danno un segnale solo se producono un certo frammento mediante una certa reazione. Lassenza di scansione permette di aumentare la sensibilità, oltre che la selettività.

36 DIPARTIMENTO DI CHIMICA G. CIAMICIAN – CHIMICA ANALITICA STRUMENTALE Combinazioni strumentali per MS/MS MS/MS con risoluzione nello spazio Settori elettrico-magnetico: EB/EB o BE/BE (max MS 4 ). Triplo quadrupolo: QqQ Tempo di volo lineare/reflectron: TOF/TOF. Combinati: Combinati: EBqQ QqTOF MS/MS con risoluzione nel tempo (MS n ) Trappola ionica a quadrupolo (max MS 8 ) Risonanza ciclotronica (ICR FTMS) Combinati: Combinati: Qq(trap) MS n nello spazio e/o nel tempo

37 DIPARTIMENTO DI CHIMICA G. CIAMICIAN – CHIMICA ANALITICA STRUMENTALE MS di molecole biologiche Classi di biomolecole Proteine - Peptidi Acidi nucleici Polisaccaridi Lipidi Tecniche MS Sorgenti: (FAB), MALDI, ESI Analizzatori: TOF, quadrupolo (con ESI), FT ICR, ibridi Tecniche separative HPLC, SEC, CZE, elettroforesi su gel.

38 DIPARTIMENTO DI CHIMICA G. CIAMICIAN – CHIMICA ANALITICA STRUMENTALE I progetti -OMICI Genoma Identificare tutta la serie di ordini che il codice genetico può impartire ad una cellula, per comprendere e prevenire situazioni patologicheTrascrittoma Identificare e quantificare tutta la serie di ordini che il genoma impartisce effettivamente alla cellula, per comprendere ed eventualmente correggere le modalità di regolazione genicaProteoma Caratterizzare e quantificare il contenuto proteico di un sistema cellulare, mediante la determinazione di profili di espressione differenziati nel tempo e nello spazio, comprensivi delle informazioni sulle interazioni molecolari

39 DIPARTIMENTO DI CHIMICA G. CIAMICIAN – CHIMICA ANALITICA STRUMENTALE Scelta della tecnica MS

40 DIPARTIMENTO DI CHIMICA G. CIAMICIAN – CHIMICA ANALITICA STRUMENTALE Massa monoisotopica e massa chimica Massa monoisotopica (picco 12 C): Massa media (picco 12 C): Per peptidi e proteine la differenza fra massa media (chimica) e massa mono- isotopica è circa 0.06%, distinguibile se lo spettrometro ha risoluzione pari a: R = 100/0.06 = 1667 (nellesempio sopra, R = 5000)

41 DIPARTIMENTO DI CHIMICA G. CIAMICIAN – CHIMICA ANALITICA STRUMENTALE Identificazione del picco 12 C Per piccoli peptidi il primo picco, relativo alla massa monoisotopica, è anche quello più intenso. Questo non è vero per proteine di massa maggiore, in cui il picco 12 C può essere poco intenso o addirittura non rivelabile. Oltre un certo valore di massa, il dato analitico utile è la massa media, che si ricava dal centroide del picco. InsulinaAlbumina bovina

42 DIPARTIMENTO DI CHIMICA G. CIAMICIAN – CHIMICA ANALITICA STRUMENTALE Risoluzione e sensibilità Quando non è possibile raggiungere risoluzione unitaria, ed identificare il picco di massa monoisotopica, è poco conveniente superare la risoluzione alla quale si può determinare la massa media con accuratezza. Questo è vero in particolare quando si deve raggiungere un compromesso fra risoluzione e sensibilità

43 DIPARTIMENTO DI CHIMICA G. CIAMICIAN – CHIMICA ANALITICA STRUMENTALE Ruolo della MS in proteomica Proteomica sistematica Identificazione e sequenziamento di tutte le proteine contenute in una cellula. (MS o MS/MS accoppiata a 2D PAGE o 2D LC per lanalisi strutturale di miscele di peptidi e proteine intere) Proteomica differenziale Studio delle differenze rilevabili fra il proteoma di una cellula sana e quello di una cellula malata (2D PAGE + MS o MS/MS per la determinazione di mutazioni nella sequenza, modifiche post- traduzionali, modifiche conformazionali, sovra o sottoespressione) Proteomica funzionale Studio della funzione biologica delle proteine e delle loro interazioni con proteine e peptidi (Separazione in condizioni non denaturanti + MS di proteine e complessi proteici allo stato nativo)

44 DIPARTIMENTO DI CHIMICA G. CIAMICIAN – CHIMICA ANALITICA STRUMENTALE Strategie proteomiche basate sulla MS Proteina (sconosciuta) Miscela di peptidi Massa dei peptidi mediante LC/LC/ESIMS Ricerca dei pesi molecolari in banca dati Sequenziamento in MS n MS n per ulteriori Informazioni sulla sequenza Massa di proteine intere mediante (LC)ESI/MS Identificazione e caratterizzazione di proteine nota sconosciuta 2D SDS PAGE Top-down Ricerca dei pesi molecolari in banca dati bottom-up digestione shotgun

45 DIPARTIMENTO DI CHIMICA G. CIAMICIAN – CHIMICA ANALITICA STRUMENTALE Approccio proteomico top-down Si basa sulla determinazione della massa accurata (media) delle proteine in una matrice di complessità ridotta (ottenuta per purificazione con metodi biochimici o per separazione con tecniche non denaturanti) Permette di determinare la conformazione delle proteine nel loro stato nativo, e le interazioni proteina-proteina (complessi proteici fra biomarker e proteine di trasporto, oligomeri funzionali) Permette di determinare la composizione amminoacidica della proteina, ma non la loro sequenza Non identifica la proteina in modo univoco in un proteoma complesso Permette di studiare isoforme (mutazioni di singoli amminoacidi) e modificazioni post-traduzionali, ma non di localizzarle.

46 DIPARTIMENTO DI CHIMICA G. CIAMICIAN – CHIMICA ANALITICA STRUMENTALE Approccio proteomico top-down Spettro m/z in ESI/qTOF di perossidasi di rafano (HRP) allo stato nativo Il software dello spettrometro di massa identifica le famiglie di picchi negli spettri multicarica sovrapposti, ne determina il valore di m/z medio (il centroide del picco) e calcola lo spettro di massa ricostruito

47 DIPARTIMENTO DI CHIMICA G. CIAMICIAN – CHIMICA ANALITICA STRUMENTALE Approccio proteomico top-down A B C D E F Ca 2+ Glicosilazione Sullo spettro di massa ricostruito si possono identificare isoforme, complessi metallo-proteina e modificazioni post-traduzionali

48 DIPARTIMENTO DI CHIMICA G. CIAMICIAN – CHIMICA ANALITICA STRUMENTALE LC-MS/MS per lidentificazione de novo della sequenza peptidica Time [min ] MS trace MS/MS trace MS m/z y2 b3 y3 y4 y5 b7 y7 b8 y6 b9 y9 y10 b11 b12 MS/MS

49 DIPARTIMENTO DI CHIMICA G. CIAMICIAN – CHIMICA ANALITICA STRUMENTALE Masse degli aminoacidi AminoacidoCodice (3 lettere)Codice (1 lettera)Massa monoisotopicaMassa chimica GlicinaGlyG AlaninaAlaA SerinaSerS ProlinaProP ValinaValV TreoninaThrT CisteinaCysC IsoleucinaIleI LeucinaLeuL AsparaginaAsnN AspartatoAspD GlutamminaGlnQ LisinaLysK GluatammatoGluE MetioninaMetM IstidinaHisH FenilalaninaPheF ArgininaArgR TirosinaTyrY TriptofanoTryW

50 DIPARTIMENTO DI CHIMICA G. CIAMICIAN – CHIMICA ANALITICA STRUMENTALE Frammentazione dei peptidi H 2 N-CH R1R1 C NHCH R3R3 O x2x2 y2y2 z2z2 x1x1 y1y1 z1z1 C NHCH-COH R4R4 O O a2a2 b2b2 c2c2 a3a3 b3b3 c3c3 C NHCH R2R2 O x3x3 y3y3 z3z3 a1a1 b1b1 c1c1 H 2 N-CH R1R1 C O C NHCH R2R2 O + b2b2 NH 3 CH R3R3 C NHCH-COH R4R4 O O + y2y2

51 DIPARTIMENTO DI CHIMICA G. CIAMICIAN – CHIMICA ANALITICA STRUMENTALE Interpretazione dello spettro di massa di peptidi

52 DIPARTIMENTO DI CHIMICA G. CIAMICIAN – CHIMICA ANALITICA STRUMENTALE Modifiche post-traduzionali Glicosilazione Variabile ( >3000 Da) Fosforilazione Da Acetilazione Da Formilazione Da Ossidazione Da Riduz. ponti disolfurici+2.02 Da Ancora glicolipidica Variabile

53 DIPARTIMENTO DI CHIMICA G. CIAMICIAN – CHIMICA ANALITICA STRUMENTALE Identificazione di siti modificati Peso Molecolare Proteina Intatta Peptide/i modificato/i Identificazione Sito/i modificato/i No Sì Proteina sbagliata Mutazione Modifica post-traduz. Coincide con valore atteso? Peptide Mapping MS/MS

54 DIPARTIMENTO DI CHIMICA G. CIAMICIAN – CHIMICA ANALITICA STRUMENTALE Proteomica bottom-up Elettroforesi bidimensionale (2D PAGE) taglio degli spot; digestione con tripsina Mass (m/z) estrazione dei peptidi analisi MALDI/TOFMS identificazione della proteina

55 DIPARTIMENTO DI CHIMICA G. CIAMICIAN – CHIMICA ANALITICA STRUMENTALE Digestione enzimatica legame peptidico R-C-OH O H2OH2O Enzima * proteolitico H R-C N-R O N-R H H + proteina (frammenti proteolitici) * alcuni enzimi proteolitici specifici sono: tripsina tagli specifici solo a Lys-X o Arg-X Lys-C Lys-X Arg-C Arg-X Glu-C (V-8)Glu-X and Asp-X

56 DIPARTIMENTO DI CHIMICA G. CIAMICIAN – CHIMICA ANALITICA STRUMENTALE Identificazione di peptidi in banca dati È la più comune procedura per lidentificazione dei peptidi mediante spettrometria di massa La lista dei pesi molecolari ottenuta dallanalisi MALDI/TOFMS viene inserita in banca dati per lidentificazione della proteina incognita. Solitamente i segnali dei picchi a basso peso molecolare (< 500 Da) vengono esclusi dalla ricerca in quanto potrebbero essere segnali di matrice.

57 DIPARTIMENTO DI CHIMICA G. CIAMICIAN – CHIMICA ANALITICA STRUMENTALE Digestione automatizzata: MALDI prep MALDI/TOF MS elaborazione dei dati e ricerca in banca dati Risultati 2D GEL Spot Cutter Procedura di identificazione automatizzata

58 DIPARTIMENTO DI CHIMICA G. CIAMICIAN – CHIMICA ANALITICA STRUMENTALE Lelettroforesi bidimensionale è oggi la più potente tecnica separativa utilizzata per le proteine, tuttavia essa presenta una serie di svantaggi: E ristretta a proteine in un intervallo di masse molecolari tra 10 4 e 10 6 Da Non è possibile rivelare proteine poco espresse (bassa sensibilità) Bassa riproducibilità da gel a gel Lo spettrometro di massa non può essere interfacciato on-line con la tecnica separativa. Vantaggi e limiti dellelettroforesi

59 DIPARTIMENTO DI CHIMICA G. CIAMICIAN – CHIMICA ANALITICA STRUMENTALE Cromatografia bidimensionale In cromatografia multidimensionale due (o più) tecniche con proprietà ortogonali vengono combinate per migliorare la separazione Mass (m/z) Analisi di massa Raccolta di frazioni (*)digestione proteolitica (*) Separazioni cromatografiche Una alternativa alla 2D PAGE

60 DIPARTIMENTO DI CHIMICA G. CIAMICIAN – CHIMICA ANALITICA STRUMENTALE LC/LC MS n per lanalisi di miscele di peptidi frazione 1 frazione 2 minuti prima dimensione: cromatografia a scambio ionico diverse frazioni di peptidi vengono eluite effettuando un gradiente di tampone salino a valori crescenti di forza ionica.

61 DIPARTIMENTO DI CHIMICA G. CIAMICIAN – CHIMICA ANALITICA STRUMENTALE LC/LC MS n per lanalisi di miscele di peptidi Seconda dimensione: cromatografia a fase inversa (C 4 – C 18 ) Ciascuna frazione contenente i peptidi eluiti dalla colonna a scambio ionico viene ulteriormente separata su una colonna cromatografica a fase inversa e i singoli peptidi sono rivelati e identificati utilizzando uno spettrometro di massa ESI-Q/TOF in modalità MS/MS


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