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1 STATISTICA CHEMIOMETRICA per il corso di CHIMICA ANALITICA E CLINICA Laurea Specialistica in Scienze Biologiche Sanitarie 1) TESTO 1 Luigi Spandrio Principi.

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1 1 STATISTICA CHEMIOMETRICA per il corso di CHIMICA ANALITICA E CLINICA Laurea Specialistica in Scienze Biologiche Sanitarie 1) TESTO 1 Luigi Spandrio Principi e Tecniche di Chimica Clinica PICCIN, 2001 Riferimenti bibliografici 2) TESTO 2 Elio Desimoni, Barbara Brunetti Assicurazione di qualità nel laboratorio chimico Validazione dei metodi di analisi CLUEB, 2003 Argomenti a)Metodi quantitativi ed errori in Chimica Analitica (Spandrio, Cap. 4 e dispense) b)Qualità del dato analitico e validazione (Spandrio, Cap. 5 e Desimoni: diapo 1-8,11, 14, 17, 21, , 196, )

2 2 Tecnica analitica è linsieme di principi teorici e accorgimenti sperimentali che sfrutta un fenomeno scientifico fondamentale per ottenere uninformazione sulla composizione di un certo campione. Metodo analitico è lapplicazione di una tecnica analitica per risolvere un problema analitico specifico. Procedura è linsieme delle istruzioni base necessarie per utilizzare un metodo analitico. Protocollo è linsieme delle istruzioni e direttive dettagliate da eseguire rigidamente affinché il risultato possa essere accettato per fini particolari. Misura: è uninformazione costituita da un numero, unincertezza ed ununità di misura. Misurazione: è la determinazione analitica vera e propria.

3 3 1. Definizione generale del problema. (cliente) 2. Definizione analitica del problema. (cliente - analista) 3. Scelta del metodo, tecnica, procedura ed eventuale protocollo. (analista) 4. Campionamento. (cliente-analista) 5. Trattamento del campione. (analista) 6. Analisi. (analista) 7. Elaborazione. (analista) 8. Relazione. (cliente-analista) PROCEDURA ANALITICA TOTALE TRATTAMENTO DATI Procedimento per estrarre da un set di dati numerosi dei valori descrittori che caratterizzano il set di dati Errore: - grossolano - sistematico - casuale Livello di confidenza Livello di significatività

4 4 Ripetendo infinite volte una misura, la distribuzione dei valori ottenuti come risultato della misura è gaussiana (o normale). Punto di massimo: x= Massimo: Una curva gaussiana ha: Punti di flesso: x= STATISTICA DELLE MISURE RIPETUTE misura di una grandezza X Larghezza a metà altezza f x w 1/2

5 5 Il punto di massimo è il VALORE VERO. La semidistanza tra i flessi è la DEVIAZIONE STANDARD f x +t - t La migliore stima di è la MEDIA La migliore stima di è n= numero di misure n-1= numero di gradi di libertà È nota e tabulata la probabilità P che una misura cada nellintervallo x =( ± t ) cioè z = ± t STATISTICA DELLE MISURE RIPETUTE misura di una grandezza X

6 6 STATISTICA DELLE MISURE RIPETUTE misura di una grandezza X f x +t - t Ripetendo una misura singola per ln+1esima volta, abbiamo probabilità P s che essa cada nellintervallo, detto INTERVALLO DI CONFIDENZA: Il parametro t dipende dal livello di probabilità P s scelto e dal numero di misure. Ripetendo n misure abbiamo probabilità P s che la nuova media cada nellINTERVALLO DI CONFIDENZA

7 7 PROPAGAZIONE DEGLI ERRORI STIMA DELERRORE

8 8 ESEMPIO: Stimare la deviazione standard di un dato ottenuto con spettrofotometria UV-Vis sapendo: A=0,529 ( =7,0 X ) =7900 M -1 cm -1 ( =200 M -1 cm -1 ) b=0.1 cm ( =1,0 X10 -3 cm)

9 9 PRESENTAZIONE DEI RISULTATI NUMERICI cifre significative Cifre significative = tutte le cifre certe più la prima su cui cade lerrore. La prima cifra incerta è determinata dal numero che dà lerrore, espresso con una sola cifra significativa Es: ± = ± Esprimendo il risultato numerico in forma esponenziale, le cifre significative sono quelle del fattore pre-esponenziale Esempi: (errore su 8) = ha 5 cifre significative (errore sul 9) = ha 4 cifre significative ADDIZIONI O SOTTRAZIONI:il risultato ha numero di decimali come il dato a minor cifre decimali (155,5±0,1) + (0,085±0,0011) = 155,585( ±0,1)=155,6 PRODOTTI O QUOZIENTI: il risultato ha numero di cifre significative pari al fattore con minor numero di cifre significative: 2,3567*8,45=19,914115= /6,24=1,65833=1,66

10 10 TEST DI SIGNIFICATIVITÀ LIVELLO DI CONFIDENZA = P LIVELLO DI SIGNIFICATIVITÀ: = 1 - P Nel caso di misure ripetute distribuite normalmente, il LIVELLO DI CONFIDENZA è larea sottesa dalla funzione distribuzione sullintervallo di confidenza, il LIVELLO DI SIGNIFICATIVITÀ è larea sottesa dalla funzione distribuzione sulle code f x +t - t IPOTESI NULLA (H 0 )= ipotesi che un valore misurato appartenga alla popolazione rappresentata da una certa distribuzione TEST DI SIGNIFICATIVITÀ = stabilire se lipotesi nulla è vera ad un certo livello di confidenza P ovvero di significatività =1-P

11 11 TEST DI SIGNIFICATIVITÀ confronto tra un risultato sperimentale ed il valore noto f X X noto Non cè differenza significativa tra e X noto

12 12 Esempio: TEST DI SIGNIFICATIVITÀ confronto tra un risultato sperimentale ed il valore noto Si sottopone un campione a concentrazione (c) nota Ad un determinato metodo analitico. Si vuole quindi determinare se tale metodo dà il risultato atteso. Eseguendo 3 misure si ottiene: X 1 = 38.9 ppb X 2 = 37.4 ppb X 3 = 37.1 ppb Quindi: x medio = 37.8 ppb s=0.964 ppb t tab = 4.3 per livello confidenza 95% e numero gradi di libertà=2 t oss = 1.98 Poichè t oss

13 13 TEST DI SIGNIFICATIVITÀ confronto tra medie Assumiamo che le due medie appartengano a popolazioni aventi uguale deviazione standard Confrontare due medie e equivale a confrontare la loro differenza con lo zero. Si esegue un t-test analogo al precedente: Non cè differenza significativa tra e Numero gradi di libertà: n 1 +n 2 -1 n 1 = numero di misure ripetute per ottenere n 2 = numero di misure ripetute per ottenere s 2 1 = varianza delle misure ripetute per ottenere s 2 2 = varianza delle misure ripetute per ottenere

14 14 Esempio: TEST DI SIGNIFICATIVITÀ confronto tra medie Due metodi hanno dato i seguenti risultati sullo stesso campione: X 1 = 28.0 ppm s 1 = 0.3 ppm n° misure= 10 X 2 = 26.3 ppm s 1 = 0.2 ppm n° misure= 9 S= t oss = ( )/[0.258(1/10+1/9) 1/2 ] =14.3 t tab = 2.11 con un livello di confidenza pari a 95% e con 17 gradi di libertà Poichè t oss >t tab, H 0 è rifutata, cioè cè diffeerenza significativa tra i due risultati

15 15 Il test delle differenze accoppiate si applica quando si abbiano h campioni diversi e su ciascuno si esegua una singola misura col metodo 1 e una singola misura col metodo 2. Siano: x i,1 il risultato ottenuto sul campione i-esimo col metodo 1 x i,2 il risultato ottenuto sul campione i-esimo col metodo 2 h-1 gradi di libertà Per verificare se ci sia differenza significativa tra i vari risultati ottenuti con le due tecniche, si fa lipotesi nulla che d=0 e si esegue un t-test con: TEST DI SIGNIFICATIVITÀ test delle differenze accoppiate

16 16 Esempio: TEST DI SIGNIFICATIVITÀ test delle differenze accoppiate Se ci sono h campioni diversi e su ognuno eseguo una misura con il metodo1 ed una misura con il Metodo2: Campione met1 met2 d d medio = S d =2.5 t oss =0.7 T tab0,005;3 =3.18 Poichè toss

17 17 TEST DI SIGNIFICATIVITÀ ANOVA Non cè differenza significativa tra le due varianze

18 18 Q-TEST per la verifica dei dati anomali Q= (valore sospetto-valore più vicino)/(valore massimo-valore minimo) Q oss < Q tab Il dato sospetto non è rigettabile TEST per la verifica della normalità della distribuzione (n>50) TEST della frequenza cumulativa per la verifica della normalità della distribuzione (n<50)

19 19 Si definisce ACCURATEZZA la contemporanea sussistenza di ESATTEZZA e PRECISIONE Si definisce ESATTEZZA laccordo tra il valor medio ottenuto da un ampio set di misure e un valore di riferimento accettato (ISO , 1993). La mancanza di esattezza è principalmente in relazione con gli errori sistematici Si definisce PRECISIONE laccordo, ovvero la vicinanza reciproca, tra i risultati di più misure replicate. La mancanza di precisione è principalmente in relazione con gli errori casuali ACCURATEZZA: ESATTEZZA E PRECISIONE RIPETIBILITÀ E RIPRODUCIBILITÀ Si definisce RIPETIBILITÀ la precisione ottenuta con lo stesso operatore, la stessa strumentazione, in un breve lasso di tempo

20 20 Metodo1. non preciso non esatto Metodo2. preciso non esatto Metodo3. non preciso esatto Metodo4. preciso esatto ESATTEZZA E PRECISIONE

21 21 CALIBRAZIONI Si definisce CURVA DI CALIBRAZIONE il grafico che riporta il segnale analitico (S) in funzione della quantità di analita (q) e viene ottenuta sottoponendo a misura degli standard a quantità nota di analita Nella quasi totalità dei metodi analitici quantitativi il dato di quantità incognita viene ottenuto per interpolazione sulla CURVA DI CALIBRAZIONE.

22 22 INTERVALLO DINAMICO E LINEARE Si definisce INTERVALLO DINAMICO quellintervallo di quantità di analita entro il quale il SEGNALE ANALITICO varia al variare della quantità stessa Si definisce INTERVALLO LINEARE un intervallo dinamico entro il quale il SEGNALE ANALITICO varia linearmente al variare della quantità di analita A c SENSIBILITÀ Si definisce SENSIBILITÀ di un metodo analitico la PENDENZA della curva di calibrazione.

23 23 REGRESSIONE LINEARE x1x1 xixi xnxn y1y1 yiyi ynyn retta: y=a+ b x

24 24 COEFFICIENTE DI CORRELAZIONE LINEARE (R) La retta è una buona approssimazione dellandamento dei punti sperimentali se R ha valore vicino ad 1 REGRESSIONE LINEARE

25 25 x1x1 xixi xnxn y1y1 yiyi ynyn y0y0 x0x0 CALIBRAZIONE CON STANDARD ESTERNI INTERPOLAZIONE m = numero di ripetizioni per y 0

26 26 Determinazione ICP/OES (Mn) minimi quadrati lineari: segnale = a*conc. + b Concentrazion e Mn (ppm) Segnale Esempio Calibrazione con standard esterni

27 27 SASA SXSX OEOE OSOS CACA 0 xExE CALIBRAZIONE CON IL METODO DELLE AGGIUNTE STANDARD

28 28 Il campione viene suddiviso in più aliquote dello stesso volume (almeno 3). Unaliquota viene lasciata inalterata, agli altri sub-campioni si addizionano quantità crescenti dellanalita, aggiungendo piccoli volumi di una soluzione standard della specie in esame a concentrazione nota e portando a volume in recipiente tarato. Si effettua la misura su ciascuna soluzione e si costruisce il grafico: CALIBRAZIONE CON IL METODO DELLE AGGIUNTE STANDARD

29 29 Esempio Calibrazione con metodo delle aggiunte Determinazione del rame in un campione di sangue. Il campione è di 15 mL e viene diviso in 3 aliquote da 5 mL ognuna. -Alla prima aliquota non viene aggiunto nulla, -alla seconda vengono aggiunti 5 L di una soluzione standard di cloruro di rame a 100 ng/mL -Alla terza aliquota vengono aggiunti 100 L della stessa soluzione standard (v Tabella). Il rame aggiunto è 0 ng/mL nella prima soluzione, 0.1 ng/ml nella seconda e 0.2 ng/mL nella terza e le relative risposte strumentali sono: 0.2 per il primo campione, 0.31 per il secondo campione e 0.41 per il terzo. Si costruisce la retta con questi punti e per estrapolazione si calcola la concentrazione di rame presente nel campione = 0.17 ppm Aliquota 1 Aliquota 2 Aliquota 3

30 30 CALIBRAZIONE CON IL METODO DELLO STANDARD INTERNO Gli n campioni standard da sottoporre a misura allo scopo di costruire una retta di taratura, etichettati con i=1,…,n, contengono quantità note x i dellanalita, variabili da standard a standard, e contengono una quantità nota z, uguale per tutti gli standard, di uno STANDARD INTERNO. La retta di taratura si costruisce riportando il rapporto tra il segnale (S x ) dellanalita e il segnale (S z ) dello standard in funzione del rapporto tra x e z.

31 31 LIMITE DI RIVELABILITA f LIMITE DI RIVELABILITÀ (y LOD ) = il minimo segnale significativamente diverso da quello del bianco LIMITE DI RILEVABILITÀ (x LOD ) = la quantità di analita che corrisponde al limite di rivelabilità

32 32 DETERMINAZIONE DEL LOD DALLA RETTA DI REGRESSIONE LINEARE Retta di regressione: y = a + b x y x

33 33 DETERMINAZIONE DEL LoD DAL RAPPORTO SEGNALE/RUMORE

34 34 TEST DI ESATTEZZA 1) USO DI MATERIALI DI RIFERIMENTO 2) USO DI UN METODO DI RIFERIMENTO VALIDATO 3) USO DI CAMPIONI FORTIFICATI (SPIKING) SI APPLICA UN TEST DI SIGNIFICATIVITÀ PER IL CONFRONTO TRA MEDIE AD UNO DEI CASI SEGUENTI TEST DI PRECISIONE SI APPLICA UN TEST ANOVA PER IL CONFRONTO TRA DEVIAZIONI STANDARD AD UNO DEI CASI SEGUENTI VALIDAZIONE VALIDARE un metodo analitico significa attestarne lESATTEZZA e la PRECISIONE


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