I Brassinosteroidi. Brassinolide (BL) I BRASSINOSTEROIDI (BR) sono una famiglia di > di 50 composti srtutturalmente correlati che regolano Crescita Divisione.

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1 I Brassinosteroidi

2 Brassinolide (BL) I BRASSINOSTEROIDI (BR) sono una famiglia di > di 50 composti srtutturalmente correlati che regolano Crescita Divisione cellulare, allungamento e differenziamento. Difesa dai patogeni Tolleranza agli stress Sviluppo riproduttivo Castasterone (CS)

3 I BR sono stati scoperti nel corso di studi volti ad identificare sostanze che promuovessero la crescita nei pollini POLLEN EXTRACTCONTROL ControlGibberellinBrassinosteroid L’estratto di polline di colza promuove in fagiolo l’allungamento delle cellule e del fusto (1941) La “brassicina” purificata promuove l’allungamento del fusto (Mitchell 1970)

4 [BR] crescente Saggio biologico BR Inclinazione della 2° lamina fogliare di riso Saggio biologico BR Secondo internodo fagiolo Saggi biologici

5 Nel 1979 identificata la struttura Brassinolide (BL) A partire dal polline raccolto dalle api..

6 230 Kg polline 10 mg BL I BR sono presenti in basse concentrazioni

7 Insect PlantMammal Brassinolide e Castasterone sono ormoni steroidei

8 WT det2 det2 + BL WT det2 det2 + BL WT cpd i due mutanti di Arabidopsis de- etiolated2 (det2) and constitutive photomorphogenesis and dwarfism (cpd) sono BR-deficienti La caratterizzazione dei mutanti det2 e cpd di arabidopsis ha consentito di stabilire che i BR sono essenziali per lo sviluppo della pianta

9 C5C5 C 10 C 15 C 20 C 30 C 40 Sintesi dei Terpeni dall’IPP

10 Via dei terpeni C30, squalene cicloartenolo Il cicloartenolo è il precursore di tutti gli steroidi vegetali

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12 Mutants blocati in questo passaggio sono: dwarf1 (Arabidopsis), lkb (pea) e brassinosteroid-deficient dwarf2 (rice). lkbWild type LKB BRD2 Wild typebrd2 Wild typedwf1 Piante mutate nella sintesi di Campesterolo sono nane

13 cpd dwf4 C6-oxidase C22-oxidase C23-oxidase C6-oxidase*** d x (tomato) C22-oxidase C3-oxidase Molti geni della biosintesi dei BR sono citocromo P450 monoossigenasi (CYP)

14 dwf4 wild-type DWF4 codifica per citocromo P450 CYP90B1, una C22- oxidase. Mutanti loss-of function sono nani DWF4 Four dwarf4 mutants

15 DWF4 è espresso nei tessuti giovani, in allungamento

16 DET2 codifica per una 5° reduttasi DET2 WTdet2

17 Nelle dicotiledoni ci sono due CYP85A differenti, una sintetizza Castasterone e l’altra Brassinolide CYP85A1 CYP85A2 or 3 CYP85A2 o 3 In pomodoro e Arabidopsis, CYP85A1 sintetizza il castasterone (CS). CYP85A2 o A3 ha una seconda attività catalitica che converte CS a BL.

18 Nel pomodoro Castasterone e Brassinolide si accumulano in tessuti differenti CYP85A1 è espresso nei tessuti vegetativi e converte il 6- deoxocastasterone a castasterone Il Castasterone è abbondante nei tessuti vegetativi

19 Il Brassinolide si accumula nei frutti, dove viene espressa CYP85A3 CYP85A3 CYP85A3 è espresso nei frutti in sviluppo e converte il castasterone a Brassinolide Il Brassinolide è abbondante nel frutto del pomodoro

20 Il mutante d x (CYP95A1) non produce Brassinosteroidi nei tessuti vegetativi ed è nano ma ha frutti normali La pianta non produce BR nei tessuti vegetativi, a causa della mutazione d x sul gene CYP85A1. il gene CYP85A3 produce BL solo nei frutti.

21 Le monocotiledoni hanno un solo gene CYP85 e non producono Brassinolide Le dicotiledoni hanno una coppia di geni

22 Ci sono diverse vie per la disattivazione dei BR CYP72B1 ACTIVE INACTIVE CYP72B1

23 I BR possono essere disattivati anche mediante glicosilazione Poppenberger, B., Fujioka, S., Soeno, K., George, G.L., Vaistij, F.E., Hiranuma, S., Seto, H., Takatsuto, S., Adam, G., Yoshida, S., and Bowles, D. (2005). The UGT73C5 of Arabidopsis thaliana glucosylates brassinosteroids. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102: 15253-15258, copyright 2005 National Academy of Sciences, USA.15253-15258 Quando è overespressa UDP- glycosyltransferase UGT73C5 disattiva i BR e limita la crescita

24 La biosintesi dei BR è regolata dalla luce e dal fotoperiodo Brassinolide Campesterol BL regola negativamente l’espressione dei suoi geni di biosintesi Brassinolide Campesterol RAVL1TCP1 Sono stati identificati diversi fattori di trascrizione per i geni di biosintesi dei BR L’overespressione di TCP1 incrementa l’espressione di DWF4 e stimola la crescita

25 Esperimenti con innesti indicano che i BR non vengono trasportati a lunga distanza Radici WT di pisello non recuperano il fenotipo nano del germoglio del mutante carente in BR, indicando che per l’allungamento del fusto è necessaria sintesi localizzata di BR

26 EFFETTI FISIOLOGICI BRs contribuiscono al differenziamento del tessuto vascolare BRs promuovono la divisione cellulare, l’allungamento e il differenziamento La manipolazione dei livelli di BR può incrementare le rese dei raccolti Architettura della pianta, dimensioni del fusto, orientamento delle foglie Resistenza ai patogeni e a stress ambientale Dimensioni dei semi BRs interagiscono con altri ormoni (come l’auxina) o stimoli (come la luce)

27 Differenziamento del tessuto vascolare Reprinted from Szekeres, M. et al. (1996) Brassinosteroids rescue the deficiency of CYP90, a cytochrome P450, controlling cell elongation and de-etiolation in Arabidopsis. Cell 85: 171–182 with permission from Elsevier.171–182 Wild type Mutanti BR-deficienti mostrano un pattern alterato del tessuto vascolare: sovraproduzione di floema (p) e sottoproduzione di xilema cpd p p x x

28 Il trattamento con Brassinazolo interferisce con la formazione dello xilema Reprinted from Nagata, N., Asami, T., and Yoshida, S. (2001). Brassinazole, an inhibitor of brassinosteroid biosynthesis, inhibits development of secondary xylem in cress plants (Lepidium sativum). Plant Cell Physiol. 42: 1006-1011 by permission of the Japanese Society of Plant Physiologists.1006-1011 Control BZ-treated Brassinazolo: inibitore della sintesi di BRs

29 ControlUniconazoleBrassinosteroid Uniconazole + Brassinosteroid Mesophyll cellTracheary element (TE)Zinnia elegans Cellule del mesofillo coltura di Zinnia elegans differenziano in trachee

30  Xilema e floema originano dal differenziamento delle cellule del procambio  Generazione della asimmetria adaxiale/abaxiale (foglie);centrale/periferica (fusto)  Interazione tra geni HDZIPIII (adaxiali) KANADI (abaxiali)  BRs promuovono l’espressione in zinnia di geni omologhi ai fattori HDZIPIII di arabidopsis

31 I BR promuovono la crescita cellulare Wang, T.W., Cosgrove, D.J., and Arteca, R.N. (1993). Brassinosteroid stimulation of hypocotyl elongation and wall relaxation in pakchoi (Brassica chinensis cv Lei- Choi). Plant Physiol. 101: 965-968. Yamamuro, C., Ihara, Y., Wu, X., Noguchi, T., Fujioka, S., Takatsuto, S., Ashikari, M., Kitano, H., and Matsuoka, M. (2000). Loss of function of a rice brassinosteroid insensitive1 homolog prevents internode elongation and bending of the lamina Joint. Plant Cell 12: 1591-1606.965-9681591-1606 Wild-type Receptor mutant L’allungamento cellulare e la organizzazione dei microtubuli sono anormali in un mutante del recettore dei BRs BR promuove l’allungamento dell’ipocotile

32 I BR inducono geni che promuovono la crescita cellulare Goda, H., Shimada, Y., Asami, T., Fujioka, S., and Yoshida, S. (2002). Microarray analysis of brassinosteroid-regulated genes in Arabidopsis. Plant Physiol. 130: 1319-1334.1319-1334 Geni up-regolati dai BRs Molti geni che codificano per enzimi che sintetizzano o modificano componenti della parete Geni down-regolati dai BRs Molti geni codificanti per P450 coinvolti nella biosintesi dei BRs

33 Il mutante nano di orzo uzu ha una ridotta sensibilità ai BR Chono, M., et al., (2003) A semidwarf phenotype of barley uzu results from a nucleotide substitution in the gene encoding a putative brassinosteroid receptor. Plant Physiology 133:1209-1219.1209-1219 Le piante uzu hanno una mutazione nonsenso nel recettore dei BR rendendole meno sensibili ai BRs CRESCITA Wild-typeuzu minor crescita

34 Un mutante di riso biosintetico per i BR ha foglie più erette e una resa maggiore Le foglie erette si ombreggiano meno consentendo una maggiore fotosintesi Reprinted by permission from Macmillan Publishers Ltd. Nature; Sakamoto, T., et al. (2006). Erect leaves caused by brassinosteroid deficiency increase biomass production and grain yield in rice. Nat Biotech 24: 105-109, copyright 2006.105-109

35 Anche piante di riso over-esprimenti CYP90 hanno rese maggiori Wu, C.-y., Trieu, A., Radhakrishnan, P., Kwok, S.F., Harris, S., Zhang, K., Wang, J., Wan, J., Zhai, H., Takatsuto, S., Matsumoto, S., Fujioka, S., Feldmann, K.A., and Pennell, R.I. (2008). Brassinosteroids regulate grain filling in rice. Plant Cell 20: 2130-2145.2130-2145 L’over-espressione di CYP90B determina più semi e di dimensioni maggiori Modulando finemente la sintesi o la risposta ai BR si può influire sull’architettura della pianta e quindi sulla produttività At-gCYP-5WT

36 I BR sono necessari per lo sviluppo degli stami e del polline Filament elongation Pollen development Pollen tube elongation Image credits: Safro; Graham Matthews; Szumlanski, A.L., and Nielsen, E. (2009). The Rab GTPase RabA4d regulates pollen tube tip growth in Arabidopsis thaliana. Plant Cell 21: 526-544.SafroGraham Matthews526-544

37 I BRs contribuiscono alla resistenza ai patogeni Pathogen response genes PATHOGENS BRs RESISTANCE BRs inducono la risposta ai patogeni insieme ad altri ormoni ed elicitori BR treatedControl Il trattamento con BRs induce una maggiore resistenza ad alcuni patogeni, inclusi virus, funghi e batteri

38 I BRs contribuiscono alla tolleranza agli stress ambientali Antioxidants STRESS BRs Tolerance Heavy metals (OUT) Heavy metals (IN) Uptake Detox BRs CELLULAR DAMAGE BRs contribuiscono alla produzione di antiossidanti BRs interferiscono con l’assorbimento dei metalli pesanti o promuovono la loro detossificazione

39 I BRs contribuiscono alla maturazione dei frutti I livelli endogeni di BRs aumentano durante la maturazione BRs esogeni accelerano la maturazione; inibitori la rallentano Symons, G.M., Davies, C., Shavrukov, Y., Dry, I.B., Reid, J.B., and Thomas, M.R. (2006). Grapes on steroids. Brassinosteroids are involved in grape berry ripening. Plant Physiology 140: 150-158.150-158.

40 I BR contribuiscono alla deeziolatura WT det2 det2 + BL det2: mutante biosintetico per I BRs fenotipo deeziolato al buio LIGHT BRs Light responsive genes and growth patterns BRs interferiscono con la risposta alla luce e la luce inibisce la sintesi e promuove la disattivazione dei BRs

41 BR e auxina interagiscono AuxinBRs ARF Auxina induce l’espressione di CPD, un enzima di biosintesi dei BRs BR attiva ARF2, un fattore di risposta all’auxina Auxina e BRs inducono set di geni con funzioni simili che promuovono la crescita cellulare Gene expression Cell elongation Gene expression

42 MECCANISMO DI AZIONE

43 BRI1 codifica per il principale recettore dei BRs I mutanti bri1 sono BR-insensibili Clouse, S.D., Langford, M., and McMorris, T.C. (1996). A brassinosteroid-insensitive mutant in Arabidopsis thaliana exhibits multiple defects in growth and development. Plant Physiol. 111: 671-678.671-678 bri1 Wild-type bri1 In piante wild-type plants, la crescita della radice è inibita da alte concentrazioni di BR Il mutante di Arabidopsis bri1 è molto piccolo (e insensibile a BR esogeno)

44 Recettori simili a BRI sono stati identificati in riso e pomodoro Yamamuro, C., et al. (2000). Loss of runction of a rice brassinosteroid insensitive1 homolog prevents internode elongation and bending of the lamina joint. Plant Cell 12: 1591-1606. Montoya, T., et al. (2002). Cloning the tomato Curl3 gene highlights the putative dual role of the leucine-rich repeat receptor kinase tBRI1/SR160 in plant steroid hormone and peptide hormone signaling. Plant Cell 14: 3163-3176.1591-16063163-3176 Receptor mutantBiosynthesis mutant Wild type osbri1

45 BRI1 è localizzato sulla membrana plasmatica BRI1 Leucine-rich repeat (LRR) Dominio trans membrana Dominio chinasico Reprinted from Li, J., and Chory, J. (1997). A putative leucine-rich repeat receptor kinase involved in brassinosteroid signal transduction. Cell 90: 929-938, with permission from Elsevier; Bishop, G.J., and Koncz, C. (2002). Brassinosteroids and plant steroid hormone signaling. Plant Cell 14: S97-110.929-938S97-110 BRI1 è un recettore Leucine-rich repeat – receptor like kinase (LRR- RK)

46 I recettori degli steroidi negli animali sono proteine intracellulari Transcription Steroids freely cross plasma membrane Steroid receptor When the receptor binds the hormone, the complex moves into nucleus, binds DNA and initiates transcription

47 I recettori LRR-RLKs sono presenti in animali e piante I recettori LRR-RLKs sono molto abbondanti in piante ed animali e legano una gran varietà di molecole. Nelle piante gli LRR-RLKs sono coinvolti nello sviluppo e nella risposta ai patogeni PLANTANIMAL Bishop, G.J., and Koncz, C. (2002). Brassinosteroids and plant steroid hormone signaling. Plant Cell 14: S97-110.S97-110

48 Il signaling di BRI1 è inibito da BKI1 Wang, X., and Chory, J. (2006) Brassinosteroids regulate dissociation of BKI1, a negative regulator of BRI1 signaling, from the plasma membrane. Science 313:1118-1122. Reprinted with permission from AAAS1118-1122 Wild-type Arabidopsis BKI1 overexpression Low BR Receptor (BRI1) Inhibitor (BKI1) BKI1 interagisce direttamente con BRI1

49 BRI1 si autofosforila quando lega BR Receptor (BRI1) PP

50 Il legame di BR a BRI1 fa dissociare BK1 Receptor (BRI1) No BL5 min BL10 min BL In assenza di BL, BKI1 (marcato conYFP) sulla membrana BL causa la dissociazione di BKI1 dal recettore di membrana e il suo trasferimento nel citoplasma Wang, X., and Chory, J. (2006) Brassinosteroids regulate dissociation of BKI1, a negative regulator of BRI1 signaling, from the plasma membrane. Science 313:1118-1122. Reprinted with permission from AAAS1118-1122 PP

51 l’azione di BRI1 richiede l’attivazione del corecettore BAK1 BAK1 identificato mediante uno screening di piante in grado di revertire parzialmente il fenotipo nano bri1-5. Reprinted from Li, J., Wen, J., Lease, K.A., Doke, J.T., Tax, F.E., and Walker, J.C. (2002). BAK1, an Arabidopsis LRR Receptor-like protein kinase, interacts with BRI1 and modulates brassinosteroid signaling. Cell 110: 213-222 with permission from Elsevier.213-222

52 BAK1 è una chinasi localizzata sulla membrana plasmatica Extracellular domain Cytoplasmic protein kinase domain BAK1 BRI1 BAK1 di per sè non lega BL

53 Il legame di BAK1 a BRI1 ne potenzia l’attività chinasica BAK1 High BR PPPP

54 Receptor (BRI1) Low BR Inhibitor (BKI1) BAK1 High BR Low BR levels – receptor inactive and inhibited by BKI1 High BR levels BRI1 autophosphorylates, BKI1 dissociates, BAK1 binds and enhances BRI1 activity. PPPP

55 What happens between the receptor and nucleus? Il segnale percepito sulla membrana viene trasdotto al nucleo

56 BZR2/BES1 è un fattore di trascrizione che attiva la trascrizione di geni regolati dai BR BAK1 High BR Genes promoting growth and cell elongation BL induces BZR2/BES1 to move into the nucleus. BZR2 BES1 Reprinted from Yin, Y., Wang, Z.-Y., Mora-Garcia, S., Li, J., Yoshida, S., Asami, T., and Chory, J. (2002). BES1 accumulates in the nucleus in response to brassinosteroids to regulate gene expression and promote stem elongation. Cell 109: 181-191, with permission from Elsevier.181-191 PPPP

57 BZR1 è un fattore di trascrizione che induce alcuni geni regolati e ne reprime altri regolati da BL BAK1 BZR1 is a BR-activated transcription factor that turns OFF BR biosynthesis genes BZR1 CPD DWF4 BR6OX High BR PPPP

58 Quando i livelli di BR sono bassi, la protein kinasi BIN2 fosforila BZR1/2. Le forme fosforilate sono sequestrate nel citoplasma e soggette a degradazione proteolitica Low BR P P BIN2 P 26S proteasome Le attività di questi fattori di trascrizione sono regolate da protein chinasi e protein fosfatasi BIN 2: protein chinasi

59 BIN2 BAK1 High BR Elevati livelli di BR inibiscono BIN2. I fattori di trascrizione defosforilati sono attivi e migrano nel nucleo PPPP In presenza di BR la protein chinasi BIN2 viene inibita

60 In presenza di BL la protein fosfatasi BSU1 viene attivata Il complesso recettore attivato fosforila BSK, che fosforila BSU1, una protein fosfatasi che defosforila BIN2. BIN2 BAK1 BSU1 P BSKs P High BR PPPP

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62 FINE

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64 Due altri recettori dei BRs hanno un profilo di espressione ristretto Reproduced with permission from Caño-Delgado, A., Yin, Y., Yu, C., Vafeados, D., Mora-García, S., Cheng, J.-C., Nam, K.H., Li, J., and Chory, J. (2004). BRL1 and BRL3 are novel brassinosteroid receptors that function in vascular differentiation in Arabidopsis. Development 131: 5341-5351.5341-5351 Il gene BRI1 è espresso in tutta la pianta BRL1e BRL3 sono espressi nei tessuti vascolari.

65 quando BRL1 o BRL3 sono espressi con il promotore di BRI1 recuperano la funzione della mutazione loss-of- function del mutante bri bri1 loss-of- function mutant Rescued by BRL1 or BRL3 expressed from BRI1 promoter I geni BRL probabilmente codificano per recettori con funzioni specifiche Reproduced with permission from Caño-Delgado, A., Yin, Y., Yu, C., Vafeados, D., Mora-García, S., Cheng, J.-C., Nam, K.H., Li, J., and Chory, J. (2004). BRL1 and BRL3 are novel brassinosteroid receptors that function in vascular differentiation in Arabidopsis. Development 131: 5341-5351.5341-5351

66 I componenti della catena di signaling sono stati identificati in arabidopsis mediante studi di genetica molecolare Reprinted from Wang, Z.-Y., et al and Chory, J. (2002). Nuclear-localized BZR1 mediates brassinosteroid-induced growth and feedback suppression of brassinosteroid biosynthesis. Developmental Cell 2: 505-513., with permission from Elsevier; Yin, Y., et al and Chory, J. (2002). BES1 accumulates in the nucleus in response to brassinosteroids to regulate gene expression and promote stem elongation. Cell 109: 181-191, with permssion from Elsevier; Li, J., et al., and Chory, J. (2001). BIN2, a new brassinosteroid-insensitive locus in Arabidopsis. Plant Physiol. 127: 14-22.505-513181-19114-22 WTbzr1-1D brassinazol-resistant bri1-EMS-suppressor1 WTbin2-1 brassinosteroid- insensitive BIN2