Enzimi di restrizione La scoperta degli enzimi di restrizione è dovuta a Werner Arber, microbiologo svizzero, insieme a Daniel Nathans e Hamilton Smith.

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1 Enzimi di restrizione La scoperta degli enzimi di restrizione è dovuta a Werner Arber, microbiologo svizzero, insieme a Daniel Nathans e Hamilton Smith. Nel 1978 i tre ricevettero il Premio Nobel in medicina per "per la scoperta degli enzimi di restrizione e la loro applicazione a problemi di genetica molecolare".

2 Ciascun enzima di classe II possiede una propria sequenza bersaglio (detta anche sequenza consenso), che riconosce e taglia. Questa sequenza, solitamente di 4-8 paia di basi, è detta sito di restrizione e permette di tagliare il DNA a livello di quel sito.

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5 Plasmide ingegnerizzato

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7 Sequenziamento del genoma
Sequenziamento DNA Sequenziamento del genoma

8 Determinazione dell’ordine dei nucleotidi nel Dna dell’organismo

9 METODO SANGER Nucleotidi Terminator di-dedossi-Nucleotidi-Trifosfati

10 Si amplifica un frammento di DNA
Si denatura il DNA e si lavora su 1 emielica Si sceglie un Primer radioattivo a sequenze nota e DNA Polimenrasi 4 provette con i 4 nucleotidi + un solo tipo di ddNTP (concentrazione 1/100) Caricamento e corsa elettroforetica per separare i frammenti

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12 Metodo Sanger

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15 L’elettroforesi in gel è il metodo standard utilizzato per separare, identificare e purificare frammenti di DNA.  Il gel può essere costituito da agarosio se i frammenti sono di poche centinaia di pb.. Esso, se fuso e gelificato, forma una matrice, la cui porosità dipende dalla concentrazione dell’ agarosio.

16 La molecola del DNA è caricata negativamente e, quindi, in un campo elettrico migrerà verso il polo positivo. La matrice porosa del gel ritarda la migrazione del DNA, consentendo ai piccoli frammenti di spostarsi più velocemente rispetto ai più grandi. Il risultato è che i frammenti di DNA si separeranno nella matrice in funzione del peso molecolare

17 Dna Finger printing

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20 Trasformazione batterica

21 Trasformazione batterica

22 Piastre con terreno selettivo per selezionare batteri trasformati
LB LB+ ampicillina LB+ ampicillina LB+ ampicillina+ arabinosio