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MICROBIOLOGIA E LABORATORIO CORSO IFTS TECNICO SUPERIORE DEI PRODOTTI AGROALIMENTARI PROF. G. DANGELO.

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1 MICROBIOLOGIA E LABORATORIO CORSO IFTS TECNICO SUPERIORE DEI PRODOTTI AGROALIMENTARI PROF. G. DANGELO

2 LA MICROBIOLOGIA La Microbiologia studia i batteri, le alghe, i funghi, i protozoi, i virus e, di conseguenza, le sue branche hanno assunto la loro denominazione da questi microrganismi (Batteriologia, Immunologia, Algologia, Micologia, Protozoologia, Virologia) La Microbiologia ha molte aree di applicazione tanto nel campo alimentare e farmaceutico, quanto in quello delle malattie delluomo, degli animali e dei vegetali. Esiste poi una microbiologia del suolo e delle acque. La Microbiologia degli alimenti si interessa anche della prevenzione del degrado del prodotto alimentare, del miglioramento dei prodotti in termini di valore nutritivo, di aroma, di sapore e della qualità generale dellalimento. La Microbiologia dei prodotti lattiero-caseari si interessa della manifattura dei formaggi, degli yogurt e di altri prodotti similari. Unaltra importante prerogativa di questo settore è quella della produzione di alimenti privi di microrganismi patogeni..

3 CONTROLLO MICROBIOLOGICO DEL LABORATORIO DISINFEZIONE E PRINCIPALI DISINFETTANTI CHIMICI 1.ALCOOLI 2.ALDEIDI 3.FENOLI 4.ALOGENI 5.OSSIDANTI 6.ACIDI E ALCALI 7.DETERGENTI SINTETICI 8.AMMONIO QUATERNARIO 9.METALLI PESANTI

4 1.ALCOOL ETILICO, ISOPROPILICO, GLICOLE BUTILENICO (DENATURAZIONE DELLE PROTEINE) 2.ALDEIDE FORMICA, ALDEIDE GLUTARICA (FORMALINA = 40% VOL, LISOFORMIO = FORMALDEIDE IN SOLUZIONE SAPONOSA, PARAFORMIO = FORMALDEIDE IN COMPRESSE O TAVOLETTE) 3.ACIDO FENICO o FENOLO, CRESOLO (2-metilidrossibenzene [o-cresolo]. il cresolo si presenta come un liquido scuro oleoso allapparenza. E composto dal 50% di oli aromatici e cresoli; questi ultimi sono la sostanza attiva e sono presenti in concentrazione compresa tra il 17 e il 18%. Il resto è costituito da acqua e tensioattivi (detergenti) che hanno il compito di disperdere la parte attiva nellacqua di diluizione; ), LISOLO (soluzione saponosa di cresolo grezzo, dotata di potere disinfettante ), CREOLINA ( La composizione era formata da olio di catrame, saponi, soda caustica e pochissima acqua. I suoi usi divennero molteplici, a partire dal campo umano, zootecnico, civile e veterinario. Inoltre, l'uso della creolina, in campo di opere di restauro motoristico, viene usata per riportare allo splendore originale di fonderia, le parti in alluminio macchiate da olio e dai vapori dello stesso ), ECC.catramesaponisoda caustica CLORO, IPOCLORITI (moscan 15% cloro attivo, caporite: ipoclorito di calcio ), CLORAMINE (Derivati dellammoniaca (uno o più atomi di idrogeno vengono sostituiti con il cloro) Ha la stessa attività degli ipocloriti, ma più lenta e dura più a lungo Se ingerita può provocare insufficienza respiratoria, AMUCHINA (OSSICLORURO DI CALCIO) 1.ACQUA OSSIGENATA, AC. PERACETICO 2.Ac. CLORIDRICO, SOLFORICO, IDROSSIDI, CARBONATI 3.DETERGENTI ANIONICI, CATIONICI(COMPOSTI QUATERNARI DELLAMMONIO), ANFOLITI 4.MERCURIO, ARGENTO 5.FUNGICIDI, ANTISETTICI SPRAY A BASE DI FENOLO E AMMONIO QUATERNARIO, SAPONI NEUTRI A BASE DI O-FENILFENOLO Il cloro uccide gli agenti patogeni come batteri e virus rompendo i legami chimici delle loro molecole. I disinfettanti usati a tale fine consistono in composti di cloro che possono scambiare atomi con altri composti, quali enzimi batteri ed altre cellule. Quando gli enzimi entrano in contatto con il cloro, uno o più atomi della molecole di idrogeno sono sostituiti dal cloro. Ciò la deformazione o il deterioramento dell'intera molecola. Quando gli enzimi non funzionano correttamente, la cellula o il batterio muoiono. Quando si aggiunge all'acqua cloro, si formano gli acidi ipocloritici: Cl2 + H2O -> HOCl + H+ + Cl- A seconda del valore del pH una parte degli acidi ipocloridrici si trasforma in ioni ipoclorito: Cl2 + 2H2O -> HOCl + H3O + Cl- HOCl + H2O -> H3O+ + OCl- Essi si scindono in ioni di cloro e ossigeno: OCl- -> Cl- + O2- L'acido ipocloroso (HOCl, che è elettricamente neutro) e gli ioni ipoclorito (OCl-, elettricamente negativi) formano cloro libero quando legati insieme, realizzando la disinfezione. Le due sostanze hanno un comportamento diverso. L'acido ipocloridrico è più reattivo ed è un disinfettante più forte rispetto all'ipoclorito. Esso inoltre e' scisso in acido cloridrico (HCl) ed ossigeno atomico (O). L'atomo di ossigeno è un potente disinfettante. Le proprietà di disinfezione del cloro in acqua si basano sul potere ossidante degli atomi di ossigeno liberi e sulle reazioni di sostituzione del cloro.

5 L'acido peracetico (C2H4O3) e' una miscela di acido acetico (CH3COOH) e perossido di idrogeno (H2O2) in una soluzione acquosa. E' un liquido luminoso, incolore che ha un odore pungente a pH basso (2,8). L'acido paracetico e' prodotto tramite reazione tra perossido di idrogeno ed acido acetico: O O || || CH3-C-OH + H2O2 -> CH3C-O-OH + H2O acido acetico + perossido di idrogeno -> acido peracetico L'acido peracetico può anche essere prodotto tramite ossidazione dell'acetaldeide. L'acido peracetico è prodotto solitamente in concentrazioni di 5-15%. Quando l'acido peracetico si dissolve in acqua, si scinde in perossido di idrogeno ed acido acetico, degenerano in acqua, ossigeno e anidride carbonica. I prodotti di degradazione dell'acido paracetico non sono tossici e possono dissolversi facilmente in acqua. L'acido peracetico è un ossidante molto potente; il potenziale di ossidazione supera quello di cloro e diossido del cloro.idrogenoossidazione acquaossigenoanidride carbonicaclorodiossido del cloro Il cloruro di benzalconio (o benzalconio cloruro) è una miscela di sali di ammonio quaternari, più esattamente è una miscela di cloruri di alchil-benzil-dimetilammonio, in cui il gruppo alchile varia dall'ottile (C8H17-) all'ottadecile (C18H37-).sali di ammonio quaternari A temperatura ambiente è un solido giallo chiaro deliquescente (fonde a bassa temperatura), molto solubile in acqua, in acetone e in etanolo, dall'odore aromatico intenso. acquaacetoneetanolo Trova impiego principalmente cone battericida e spermicida in numerosi preparati destinati all'uso quotidiano: disinfettanti, colliri, collutori, creme spermicide.battericidaspermicida disinfettanticolliricollutoricreme spermicide Tego® 51 è un disinfettante anfotero ad alta tensioattività, di sicura e rapida azione contro lieviti, funghi, batteri grampositivi e gramnegativi, inodoro. Tego® 51 è utilizzato nella disinfezione di pareti, pavimenti, piani di lavoro, apparecchiature, nastri trasportatori precedentemente detersi.

6 DISINFETTANTI Etanolo (alcool etilico), isopropanolo (alcool isopropilico) : Ampio spettro d'azione, rapida attività senza residui nell'ambiente; non è attivo sulle spore e sulle oocisti dei coccidi, per l'azione battericida il tempo richiesto è di 5-10 min., troppo lungo rispetto all'alta percentuale di evaporazione. Agiscono distruggendo le membrane cellulari in seguito a estrazione dei lipidi, nonché denaturando le proteine microbiche e disidratando la cellula microbica; quando lalcool si trova in forma idrata viene rapidamente assorbito e penetra allinterno della cellula; viceversa lalcool puro tende a richiamare acqua sulla superficie cellulare e a produrre fenomeni coagulativi nella membrana citoplasmatica, che proteggono parzialmente le cellule batteriche dal disinfettante; Iodoformi (Lo iodoformio (nome IUPAC: triiodometano) è un alogenuro alchilico. A temperatura ambiente si presenta come un solido giallo.IUPACalogenuro alchilico Trova impiego come antisettico e disinfettante; si ottiene dalla reazione dello iodio e dell'idrossido di potassio con l'alcol metilico.): Ampio spettro d'azione, bassa tossicità acuta, tempo d'attività antimicrobica elevato, associabile ad altri disinfettanti, possibilità di colorazioni delle superfici trattate, potere corrosivo sui metalli, molto tossico per gli anfibi, inefficace contro Cryptosporidium spp., possono risultare caustici se non vengono diluiti.antisetticodisinfettanteiodioidrossido di potassioalcol metilico Fenoli: Ampio spettro d'azione, irritazioni cutanee da frequente uso, alcune formulazioni sono inefficaci contro i virus, oocisti di coccidi, spore batteriche, trattenute da materiale poroso, difficoltà di eliminazione da esso, possono essere molto tossici per i rettili. Lazione germicida del fenolo sembra associata alla sua capacità di denaturare le proteine. Il fenolo in soluzione si adsorbe sulle cellule batteriche e riesce ad oltrepassare la membrana per le sue proprietà lipofile. Si lega quindi (attraverso legami idrogeno) alle proteine batteriche, alterandone la struttura e compromettendo la loro attività naturale. Sali quaternari d'ammonio (es. benzalconio cloruro benzalconio cloruro): Elevato spettro d'azione, basso costo, medio-bassa tossicità,agente di scelta contro Cryptosporidia spp., l'attività disinfettante può essere ridotta dal contatto di sapone ed acqua "dura", materiale organico, fibre (cotone, lana), inefficace contro oocisti e spore, spesso inefficace contro Pseudomonas. Ipoclorito di sodio (varechina, amuchina): Poco costoso, ampio spettro di attività anche contro alcuni virus, rapida azione disinfettante, non facilmente miscelabile ad altri disinfettanti/detergenti. Glutaraldeide: Elevata azione disinfettante, sterilizzante per la strumentazione in ca. 10 ore, irritante, corrosivo, elevata attività residua nell'ambiente, elevata tossicità. Perossido di idrogeno (acqua ossigenata), acido acetico: Bassa tossicità acuta, corrosivi per alcuni metalli. Ossido di etilene: Per la sterilizzazione degli strumenti, molto tossico per l'uomo e gli animali, esplosivo e infiammabile ad elevate concentrazioni, cancerogeno, costoso. L'ossido di etilene uccide batteri, muffe e funghi; trova uso come agente sterilizzante come alternativa alla pastorizzazione per quei prodotti che verrebbero danneggiati dal calore. Viene inoltre usato per la sterilizzazione dei materiali e degli strumenti usati in chirurgia.batterimuffefunghisterilizzantepastorizzazionechirurgia La maggior parte dell'ossido di etilene trova impiego come intermedio nella produzione di numerosi altri composti chimici. Il principale di essi è il glicol etilenico, usato nell'industria automobilistica come antigelo e come liquido di raffreddamento. Viene usato anche nella preparazione dei poliesteri.poliesteri

7 FILTRAZIONE QUANDO IL MATERIALE NON PUO ESSERE STERILIZZATO SI FILTRA CON FILTRI DI CAOLINO, FARINA FOSSILE, ACETATO DI CELLULOSA AVENTI PORI DI DIAMETRO OPPORTUNO(micron) Lapertura in micron dei pori delle membrane è la seguente: Lieviti 0,8 Flora batterica del vino 0,65 Sterilizzazione dellacqua 0,2 Flora microbica dellacqua 0,45 ULTRASUONI CON FREQUENZE SUPERIORI AI 20 K HERTZ NELLE CELLULE SI VERIFICANO PRECIPITAZIONI DI PROTEINE, ROTTURA DI MOLECOLE COMPLESSE, COAGULAZIONE, ECC. Efficaci sono i trattamenti, da 2 a 20 minuti, con frequenze da 175 a 1500 K Hertz RADIAZIONI ELETTROMAGNETICHE Raggi gamma: < di 1 nm (ottenuti per bombardamento del Co-60. Uso permesso solo per la inibizione della germogliazione di patate, cipolle e aglio e per la sterilizzazione di materiali monouso) Raggi X: da < di 1 nm a 100 nm Raggi ultravioletti: da 100 a 380 nm (prodotti da lampade a vapori di mercurio, non hanno azione sulle spore batteriche) Luce bianca: da 380 nm a 750 nm Raggi infrarossi:da 750 nm a < di 1mm Microonde: da < di 1 mm a 12 cm Onde radio: > 12 cm

8 STERILIZZAZIONE LA STERILIZZAZIONE SI PREFIGGE LA DISTRUZIONE DI OGNI ORGANISMO VIVENTE, SPORE BATTERICHE COMPRESE LA STERILIZZAZIONE PUO AVVENIRE MEDIANTE CALORE UMIDO IN AUTOCLAVE A 121°C PER 15 min. O MEDIANTE CALORE SECCO IN STUFE TERMOSTATICHE A 180°C PER 1 ORA (VETRERIA E MATERIALE DI LABORATORIO) STERILIZZAZIONE PER FLAMBATURA PASTORIZZAZIONE E UN PROCESSO DI RISANAMENTO INDUSTRIALE IN CAMPO ALIMENTARE. AD ESEMPIO IL LATTE VIENE PASTORIZZATO A 72°C PER ALMENO 15 SECONDI

9 TECNICHE DI CONSERVAZIONE DEGLI ALIMENTI Microrgani smi T.C° minimaT.C° massimaT.C° optimumGeneri/Specie Psicrofili-5/+515/2012/15 Psicrotrofi-5/+530/3525/30 Pseudomonas, Aeromonas,Yer sinia, Listeria, Clostridium,stafi lococchi, salmonelle,lievit i, muffe Mesofili-5/+1535/4730/40 Termofili30/4560/9055/75 Tranne Listeria monocytogenes e yersinia enterocolitica, i principali batteri patogeni responsabili di intossicazioni alimentari (Clostridium botulinum, C. perfrigens, stafilococchi salmonelle) sono inibiti sotto i 3°C

10 CONGELAMENTO E SURGELAMENTO La differenza tra tale tecnica di conservazione e il congelamento è che nel primo caso le basse temperature vengono raggiunte più rapidamente fino al cuore dellalimento, in questo modo lacqua e i liquidi cellulari solidificando formano dei piccolissimi cristalli; nel congelamento, invece, i tempi più lunghi determinano la formazione di cristalli più grandi i quali nel processo di dilatazione provocano delle lesioni nei tessuti cellulari e, nella successiva fase di scongelamento, una maggiore perdita di liquidi Il surgelamento è regolato da una precisa legislazione secondo la quale i cibi devono essere portati ad una temperatura di -18 °C in un tempo massimo di 4 ore, una volta surgelati devono essere venduti in confezioni chiuse che riportino precise indicazioni relative alla conservazione e alla procedura ottimale di scongelamento e, inoltre, deve essere rispettata la catena del freddo senza interruzioni dalliniziale surgelamento fino al momento dellacquisto. Infatti la sopravvivenza di un batterio in sospensione acquosa portata a -18°C è molto più alta che non a -2°C. Infatti le basse temperature mantengono una maggiore integrità enzimatica. Non a caso i ceppi microbici vengono conservati a bassissima temperatura(neve carbonica o azoto liquido) Le categorie alimentari che possono essere sottoposte a surgelazione sono la carne e i derivati, il pesce, le verdure e gli ortaggi, i prodotti lattiero-caseari, gli alimenti precotti.

11 ESSICCAMENTO Lacqua funziona da solvente dei nutrienti e come agente chimico nelle reazioni di idrolisi, dalle quali si ottengono composti (amminoacidi, carboidrati, grassi) fondamentali per la formazione di nuove molecole e per la produzione di energia Attività dellacqua: indica lacqua libera di un mezzo disponibile per reazioni chimiche. Aw = n2/(n1+n2) n1 = numero di molecole di soluto; n2 = numero di molecole di solvente. Aw diminuisce con laumentare della concentrazione. LIOFILIZZAZIONE Consiste nellallontanamento dellacqua per sublimazione. Il prodotto finito ha un contenuto in acqua del 2-5% facilmente reidratabile. La liofilizzazione non distrugge la flora microbica ADDITIVI CONSERVANTI I conservanti hanno lo scopo di distruggere la microflora presente negli alimenti per ritardarne i processi alterativi o per conservare nel tempo le caratteristiche chimico-fisiche e/o esaltarne favorevolmente particolari caratteristiche di aspetto, forma sapore, odore Un additivo alimentare diventa, esso stesso o un suo derivato, un componente dellalimento medesimo

12 La maggior parte dei conservanti agisce in ambiente acido. Lintervallo di pH per la moltiplicazione batterica varia da 4,5 a 9 con un optimum a pH 7. I batteri lattici sopportano ambienti acidi sotto 3,5 Nelle carni lassenza dellossigeno determina la diminuzione del pH per via della fermentazazione lattica Lazione antimicrobica del cloruro di sodio è legata al suo effetto di depressione dellattività dellacqua (Aw = n2/n1+n2 dove n1 = numero di molecole di soluto e n2 = numero di molecole di solvente) e per gli ioni cloro liberati. In salumeria si impiegano i nitrati di sodio e potassio che vengono trasformati dai batteri alotolleranti in nitriti. Per gli alimenti si usano additivi conservanti organici quali il difenile e gli acidi sorbico, formico, propionico che agiscono in particolare contro funghi e lieviti

13 ANTIMICROBICI Nota: La lettera E indica che il singolo additivo è stato approvato dalla CEE. Tutti gli additivi, approvati e non, riportano attualmente la E. Cod.Denominazione chimicaEventuale tossicità E 200Acido sorbico-- E 201Sodio sorbato-- E 202Potassio sorbato-- E 203Calcio sorbato-- E 210Acido benzoico Sostanza particolarmente tossica, con dose massima giornaliera accettabile, secondo le tabelle del comitato FAO/OMS molto bassa ( 5 mg per Kg di peso al giorno). E 211Sodio benzoatoCome sopra E 212Potassio benzoatoCome sopra E 213Calcio benzoatoCome sopra E 214Etile p-ossibenzoatoCome sopra E 216Propile p-ossibenzoatoCome sopra E 217 Sale sodico dell'estere propilico dell'acido p- ossibenzoico Come sopra E 218Metil-p-ossibenzoatoCome sopra E 219 Derivato sodico dell'est. met. delI'acido p- ossibenzoico Come sopra E 220Anidride solforosa Sostanza abbastanza tossica, interferisce col metabolismo di alcuni aminoacidi ed inattiva la Vit.B1. E 221Sodio solfitoPoduttore di E220, ha gli stessi effetti tossici E 222Sodio bisolfitoCome sopra E 223Sodio metabisolfitoCome sopra E 224Potassio metabisolfitoCome sopra E 226Calcio solfitoCome sopra E 227Calcio bisolfitoCome sopra E 228Potassio solfitoacidoCome sopra

14 230Difenile Sostanza molto tossica ( dose giornaliera accettabile pari a 0,005 mg per kg di peso al giorno). Attenzione, è usato come antimuffa sugli agrumi. E 231Ortofenilfenolo Della stessa categoria del difenile, composto molto tossico. E 232Orfofeilfenato di sodioCome sopra E 233TiobendazoloTossico E 235PimaricinaTossico E 236Acido formicoTossico E 237Formiato di sodioTossico E 238Formiato di calcioTossico E 239EsametilentetraminaTossico E 240Aldeide formicaTossica e canceroren

15 SOSTANZE DESTINATE PRINCIPALMENTE AD ALTRI USI, MA AVENTI UN EFFETTO CONSERVATIVO SECONDARIO Cod.Denominazione chimicaEventuale tossicità E 249Potassio nitrito Si possono formare composti chiamati "nitrosamine", alcune delle quali sono ritenute cancerogene. Se questi composti sono associati all'acido ascorbico (Vit.C), denominato E300, E301, E302, questo rischio diminuisce. E 250Sodio nitritoCome sopra E 251Sodio nitratoCome sopra E 252Potassio nitratoCome sopra E 260Acido acetico -- E 261Potassio acetato -- E 262Sodio diacetato -- E 263Calcio acetato -- E 270Acido lattico -- E 280Acido propionico -- E 281Sodio propionato -- E 282Calcio propionato -- E 283Potassio propionato -- E 290Anidride carbonica-- E 325Sodio lattato-- E 326Potassio lattato-- E 327Calcio lattato-- E234NisinaAntibiotico

16 ANTIOSSIDANTI E 300Acido L-ascorbico -- E 301Sodio L acorbato -- E 302Calcio L ascorbato -- E 304L ascorbile palmitato -- E 306 Estratti di origine naturale ricchi di tocoferoli -- E 307Alfa tocoferolo di sintesi -- E 308 Gamma tocoferolo di sintesi -- E 309Delta tocoferolo di sintesi -- E 310Gallato di propileSostanza sospetta E 311Gallato di ottileCome sopra E 312gallato di dodecileCome sopra E 320Butilidrossianisolo Sostanza sospetta, perchè non presente in natura E 321ButilidrossitoluoloCome sopra E330Acido citrico -- E 331Citrati di sodio -- E 332Citrati di potassio -- E 333Citrati di calcio -- E 335Tartrati di sodio -- E 336Tartrati di potassio -- E 337 Tartrato doppio di sodio e potassio --

17 STABILIZZANTI, ADDENSANTI E GELIFICANTI STABILIZZANTI, ADDENSANTI E GELIFICANTI E 339Ortofosfati di sodio -- E 340Ortofosfati di potassio -- E 341Ortofosfati di calcio -- E 400Acido alginico -- E 401Alginato di sodio -- E 402Alginato di potassio -- E 403Alginato di ammonio -- E 404Alginato di calcio -- E 405Alginato di propilenglicol -- E 406Agar-agar -- E 407Carragenani -- E 410Farina di semi di carrube -- E 412Farina di semi di guar --

18 E 413Gomma adragante -- E 414Gomma arabica -- E 415Gomma xantano -- E 420Sorbitolo -- E 420Sciroppo di sorbitolo -- E 421Mannitolo -- E 422Glicerolo -- E 440a) pectina -- E 440b) pectina amidata -- E 450a-i) pirofosfato disodico Sono conosciuti più comunemente col nome generico di polifosfati.Alcuni Autori hanno osservato fenomeni di ipocalcemia e lesioni renali, dovuti ad assunzioni continue e massicce, mentre altri hanno costatato accumulo di fosfati di calcio nelle reni. E 450a-ii) pirofosfato trisodicocome sopra E 450a-iii) pirofosfato tetrasodicoc.s. E 450a-iv) pirofosfato tetrapotassicoc.s. E 450b-i) trifosfato pentasodicoc.s. E 450b-ii) trifosfato pentapotassicoc.s. E 450c-i) polifosfati di sodioc.s. E 450c-ii) polifosfati di potassioc.s.

19 E 460i) cellulosa microcristallina -- E 460ii) cellulosa in polvere -- E 461metilcellulosa -- E 463Idrossipropilcellulosa -- E 464Idrossipropilmetilcellulosa -- E 465Metiletilcellulosa -- E 466Carbossimetilcellulosa -- Gelatine animali

20 EMULSIONANTI E 322lecitina -- E 470 sali di sodio, di potassio o di calcio degli acidi grassi -- E 471 mono e digliceridi degli acidi grassi -- E 472 a) esteri acetici del mono e digliceridi degli ac. grassi -- E 472 b) esteri lattici del mono e digliceridi degli ac. grassi -- E 472 c) esteri citrici dei mono e digliceridi degli ac. grassi -- E 472 d) esteri tartarici del mono e digliceridi degli ac. grassi -- E 472 e) esteri mono e diacetiltartarici dei mono e digl.. degli ac. grassi. -- E 473 f) esteri misti acetico tartarici del mono e digl.. degli ac. grassi -- E 473sucresteri -- E 474sucrogliceridi -- E 475 esteri poligliceridi degli acidi grassi -- E 477 esteri del propilenglicol con gli acidi grassi -- E 481stearoil 2 lattilato di sodio -- E 482stearoil 2 lattilato di calcio -- E 483tartatro di stearoile --

21 ESALTATORI DI SAPIDITÀ E 621glutammato monosodico Sostanza eccitante del sistema nervoso.Se usata in quantità eccessiva, può provocare sintomi definiti come "sindrome del ristorante cinese"(questo tipo di cucina ne fà abbondante uso), che consistono in irritabilità, cefalea, insonnia. E 260acido acetico -- E 270acido lattico -- E 300acido L ascorbico -- E 330acido citrico -- E 334acido tartarico -- SOSTANZE AROMATIZZANTI ARTIFICIALI aldeide paratoluica allilcicloesanpropionato allile capronato dimetilresorcina etilacetilacetato etilbetanaftolo etilvanillina metilamilchetone metilciclopentenolone metile eptilcarbonato metilionone naftilmetilchetone ossicitronellale propenilguaetolo undecalattone

22 Conservanti nocivi Acido benzoico e suoi sali (E210, E211, E212, E213): sono usati da soli o insieme all'acido sorbico e ai PHB. Non sono ammessi in alcuni paesi per la loro potenziale tossicità, inoltre gli alimenti ai quali vengono aggiunti sono soprattutto le confetture, le gelatine, le marmellate, le gomme da masticare e le bevande analcoliche, tutti prodotti che non necessitano di conservanti., Anche gli esteri dell'acido p-Idrossibenzoico (E214, E215, E216, E217, E218, E219), indicati con la siglia PHB, sono vietati in alcuni paesi. Vengono addizionati ai patè, ai rivestimenti di gelatina dei prodotti a base di carne, alla frutta in guscio ricoperta. I derivati dell'anidride solforosa (E220, E221, E222, E223, E224, E226, E227, E228) sono irritanti e hanno una tossicità acuta e cronica, per esempio interagiscono con gli enzimi cellulari e distruggono alcune vitamine (per esempio la tiamina). Vengono usati nel vino, nella birra (anche per questo bisogna moderarne il consumo, non solo per l'alcol) e in altre bevande come i succhi di frutta, nella senape e in altri condimenti. I derivati fenolici e il tiabendazolo (E230, E231, E232, E233) sono dotati di una certa tossicità, infatti sono proibiti in Australia. Vengono utilizzati per il trattamento superficiale degli agrumi e delle banane (per questo bisognerebbe usare solo la scorza delle arance non trattate). La netamicina (E235), un antibiotico utilizzato sulla superficie dei formaggi, (soprattutto dei provoloni) provoca problemi intestinali. I nitriti (E249 ed E250) e i nitrati (E251 ed E252) sono utilizzati nei salumi e nelle carni conservate.nitritinitrati Conservanti innocui Sono i sorbati (E 200, E202, E203), l'acido acetico e i suoi sali di potassio E260, E261, E262, E263, l'acido lattico e i suoi sali di sodio (E270, E325, E326, E327), l'acido propionico e i suoi sali (E280, E281, E282, E283), l'anidride carbonica (E 290).

23 Gli additivi 'naturali' Aceto L'aceto è frutto della fermentazione del vino. Noto fin dal tempo dei Romani, veniva usato anche come dissetante. L'aceto è impiegato come conservante per le verdure (sottaceti) e nella fase di preparazione delle verdure (scottatura o bollitura) per la successiva conservazione sotto'olio. Alcool L'alcool ha la proprietà di creare un ambiente poco favorevole allo sviluppo di microrganismi già da concentrazioni superiori al 15%. Puro o come liquore, es. grappa, viene impiegato per la conservazione di frutta come albicocche, amarene, ciliege, prugne, uva. Limone Il succo del limone è un buon antiossidante. Viene usato per evitare che verdure e frutta diventino nere dopo il taglio (es. carciofi, melanzane, macedonia di frutta ecc.) Olio Ottenuto dalla spremitura delle olive (o per estrazione dalle arachidi, girasole, mais, soia ecc.) permette la conservazione degli alimenti isolandoli dall'aria e quindi dai germi. Acciughe, funghi, ortaggi, sgombro e tonno sono i principali alimenti conservati sott'olio. Sale Uno dei metodi più antichi di conservazione degli alimenti. Usando il sale è possibile conservare gli alimenti in due modi: Salatura: consiste nello stipare il prodotto alternando strati di sale all'alimento. La conservazione, in un periodo iniziale, deve avvenire pressando il prodotto. La salatura è usata soprattutto per acciughe e baccalà, ma anche per i capperi, la bresaola ed altri insaccati. Salamoia: consiste nel conservare il prodotto in una soluzione di acqua e sale (circa 10%). La salamoia è usata soprattutto per olive ed ortaggi. Zucchero Lo zucchero in elevate concentrazioni impedisce la fermentazione. Con il 60-70% di zucchero le marmellate si riescono a conservare per lunghi periodi senza difficoltà. Soluzioni zuccherine con concentrazioni più basse, circa 20-25%, consentono, previa sterilizzazione, la conservazione della frutta. Vari sono i tipi di zucchero: fruttosio - nella frutta e nel miele, glucosio - nella frutta e nel miele, lattosio - nel latte, maltosio - dai cereali, saccarosio - deriva dalla canna da zucchero o dalla barbabietola da zucchero, è il più usato nelle nostre case.

24 ALTRE TECNICHE DI CONSERVAZIONE AFFUMICATURA (La conservazione deriva in parte dal calore e in misura minore dalla penetrazione di sostanze gassose come aldeide formica, fenoli, ecc) SALAGIONE ZUCCHERAGGIO ATMOSFERA MODIFICATA (Sottovuoto o aggiunta di anidride carbonica). Per alcuni ortaggi la miscela gassosa contiene l1% di ossigeno e percentuali di anidride carbonica variabili dallo 0,5 al 5%. La conservazione dei formaggi freschi può essere garantita da unatmosfera modificata contenente 61% di CO2, 26% di N2 e 7% di O2 IL MICROSCOPIO La costruzione del primo microscopio si deve ad un mercante olandese di tessuti Antonj Van Leeuwenhoek ( ). Per primo vide e descrisse gli animalcula (protozoi, batteri, alghe e lieviti) Indice di rifrazione dellolio di legno di cedro: 1,515(molto vicino a quello del vetro 1,555). Lolio di cedro(Juniperus virginiana) aumenta il potere risolutivo dellobiettivo fornendo una immagine più chiara ed un ingrandimento maggiore. Microscopio ottico 1.Microscopio semplice 2.Microscopia in campo oscuro 3.Microscopia in contrasto di fase 4.Microscopia in contrasto interferenziale 5.Microscopia a fluorescenza 6.Stereomicroscopia. Microscopio elettronico 1.M.E. a trasmissione 2.M.E. a scansione

25 Microscopio a fluorescenza Questo tipo di microscopio serve per apprezzare la disposizione delle molecole. La sorgente luminosa, che trasmette radiazioni ultraviolette, eccita il preparato dall'alto, infatti si parla di epifluorescenza. Le componenti del preparato emettono luce di lunghezza d'onda maggiore di quella emessa dalla sorgente luminosa, questo fenomeno è conosciuto come fluorescenza. Gli obiettivi usati per questo tipo di osservazione sono quelli a fluorite.molecoleradiazioni ultraviolette lunghezza d'ondafluorescenza obiettivifluorite Microscopio a contrasto di fase La maggior parte di componenti cellulari è trasparente alla luce visibile, anche a causa dell'elevata presenza di acqua, tuttavia vediamo che le radiazioni luminose una volta oltrepassata una componente o un organello cellulare, subiscono dei cambiamenti di fase che dipendono sia dallo spessore, sia dal diverso indice di rifrazione della struttura oltrepassata. Mediante il microscopio a contrasto di fase è possibile andare a determinare tali cambiamenti e convertirli in differenze di densità così da ottenere dei dati, cioè delle informazioni utili circa la composizione di cellule e tessuti analizzati. Questa tecnica di microscopia è molto utilizzata per andare ad osservare le cellule mantenute in vita in apposite colture in vitro; infatti tramite la microscopia a contrasto di fase si evita l'utilizzo di coloranti e fissativi che spesso comportano notevoli alterazioni strutturali ottenendo così dei dati molto più reali di quella che è l'organizzazione cellulare. Microscopio ad interferenza Si attua con due onde: una attraversa il preparato che, se non è omogeneo, deforma l'onda, che si incontra con la seconda onda non deformata, dando luogo a fenomeni di interferenza. Queste forniscono notizie utili sulle sostanze presenti nel provino. Analogamente al contrasto di fase è utilizzato per osservare strutture trasparenti non altrimenti visibili in campo chiaro ma fornisce immagini più contrastate e con un effetto "tridimensionale". Questo metodo di contrasto è conosciuto con il nome di "DIC" (differential interference contrast)oppure "Normaski", dal nome dell'inventore della configurazione ottica che si ritrova negli odierni microscopi a contrasto interferenziale. Ultramicroscopio (M. a campo oscuro) è un microscopio ottico con un condensatore paraboloide, con pareti a specchio, o comunque munito di uno schermo che ferma i raggi che illuminerebbero direttamante il preparato. Vengono raccolti dall'obiettivo solo i raggi che vengono opportunamente deviati, "diffratti". La diffrazione (deviazione dei fotoni a onde decrescenti rispetto alla traiettoria principale) viene operata da particelle del preparato che abbiano dimensioni comprese fra 0,1 micrometro e 1 nanometro, particelle che appariranno come punti luminosi su sfondo buio, senza dettagli morfologici: effetto Tyndall. Microscopio stereoscopico Mentre il microscopio composto osserva il campione attraverso un'unica direzione, quello stereoscopico lo osserva da due angoli leggermente diversi e ne ottiene le due immagini necessarie per la visione stereoscopica. In questo modo, lo stereomicroscopio fornisce una visione tridimensionale degli oggetti, mentre attraverso quello composto gli oggetti appaiono piatti, senza volume. Il microscopio composto osserva gli oggetti per trasparenza e produce ingrandimenti. Il microscopio stereoscopico, invece, osserva gli oggetti principalmente per mezzo della luce riflessa e il suo ingrandimento, tipicamente compreso fra 8-50 volte, è molto inferiore a quello del microscopio composto. Con il microscopio stereoscopico, non è dunque possibile osservare microbi, ma esiste ugualmente una grande varietà di oggetti naturali che si possono osservare con questo tipo di strumenti

26 Microscopio elettronico a trasmissione (TEM) Il microscopio elettronico a trasmissione fa attraversare un campione molto sottile (da 5 a 500nm) da un fascio di elettroni, quindi con un insieme di magneti (che funzionano come le lenti del microscopio ottico) ingrandisce l'immagine ottenuta che viene infine proiettata su uno schermo fluorescente rendendola visibile. Dà immagini della struttura interna dell'oggetto esaminato, al contrario del SEM che ne dà solo la superficie, ma permette si ottenere solo immagini 2D. Raggiunge i nanometri, permettendo di vedere anche le molecole più piccole.magnetifluorescente Ulteriori miglioramenti hanno prodotto il HRTEM (high resolution trasmition electron microscope), con cui è stato possibile distinguere i singoli atomi di litio in un composto.litio Microscopio elettronico a scansione (SEM) Il microscopio elettronico a scansione, al contrario di quello a trasmissione, ricava l'immagine illuminando con un fascio di elettroni un oggetto anche relativamente grande (un insetto per esempio) e rilevando gli elettroni secondari riflessi, e può quindi fornire immagini 3D. Può analizzare solo oggetti conduttori o semi-conduttori. Gli oggetti organici devono quindi essere prima rivestiti con una sottile lamina metallica. Questo strumento ha la necessità di operare in condizioni di vuoto elevato: per questo è stato sviluppato il microscopio elettronico ambientale a scansione che, libero da questo vincolo, è in grado di analizzare campioni di materiale organico conservandone le condizioni di temperatura, pressione ed umidità.conduttoritemperatura pressioneumidità Microscopio a scansione per effetto tunnel (STM) Questo particolare tipo di microscopio consente di analizzare la superficie di un campione conduttore o semiconduttore drogato utilizzando, come sensore, una punta cresciuta su di un cristallo singolo di tungsteno e rastremata alla sommità fino allo spessore di un singolo atomo: a questa punta, posta ad una distanza molto ravvicinata dal campione, viene applicata una piccola tensione (circa 0.02 V) rispetto al campione. Data la particolare conformazione del sensore, si ha la certezza che gli elettroni fluiranno tutti dalla punta verso il campione per effetto tunnel. Poiché la corrente varia con la distanza della punta del sensore dalla superficie del campione, è possibile tramite un processo di retroazione mantenere costante tale distanza, muovendo la punta sull'asse ortogonale alla superficie del campione con la precisione garantita da un attuatore piezoelettrico. Effettuando quindi una scansione su tutta la superficie del campione e registrando punto per punto i valori della corrente, è possibile ricostruirne un modello tridimensionale. Mediante tale tecnica, si riesce a raggiungere precisioni molto elevate, fino a 4 Å.conduttoresemiconduttoretungstenoeffetto tunnelretroazionepiezoelettrico Microscopio a forza atomica (AFM) Il microscopio a forza atomica permette di effettuare analisi non distruttive di superfici, con una risoluzione inferiore al nanometro (un miliardesimo di metro). Una sonda di dimensioni dell'ordine del micrometro (un milionesimo di metro) esplora la superficie da analizzare, a contatto o a brevissima distanza da essa (circa 10 angstrom). Interagendo con gli atomi del campione, per effetto delle forze di Van der Waals, subisce microscopiche deflessioni che, attraverso un sensibilissimo dispositivo (leva ottica), vengono tradotte nei dettagli di un'immagine topografica della superficie del campione. Rispetto allo Scanning Electron Microscope (SEM) e allo Scanning Tunnelling Microscope (STM), il microscopio a forza atomica ha il vantaggio di consentire analisi non distruttive e di adattarsi anche a campioni di materiale non conduttore. Tipicamente viene impiegato per esaminare wafer semiconduttori, compact disc e altri supporti magneticimicroscopio a forza atomicaforze di Van der Waals

27 I BATTERI Con Pasteur ( ) si chiude la controversia sulla generazione spontanea, radicata fin dallantichità con Aristotele e confutata in un primo tempo nel 1665 da Francesco Redi e in seguito da Lazzaro Spallanzani ( ) Le dimensioni dei batteri sono dellordine di 0,5-2 micron e laspetto morfologico può essere: bastoncellare (bacilli), sferico (cocchi), corto e tozzo (cocco-bacillo), filamentoso (vibrioni e spirilli) I cocchi possono assumere diverse posizioni: diplococchi (a coppia), streptococchi (a catenella), stafilococchi (a grappoli), sarcine(a tetradi o cubi) I batteri vengono classificati con un tipo di classificazione artificiale o fenetica che considera le caratteristiche attuali sia fenotipiche che genotipiche dei batteri espresse in base al livello di somiglianza e di differenza. Un criterio utilizzato in tal senso è la tassonomia numerica o adansoniana per la quale laffinità tra le diverse specie viene valutata matematicamente in base ai rispettivi coefficienti di similitudine, considerando di un congruo numero di microrganismi caratteri, codificati ed analizzati al computer Un altro criterio è quello di determinare la percentuale di G + C del DNA che fornisce il livello di parentela cellulare. La % di G+C si può calcolare conoscendo la temperatura di fusione in cui si ha la separazione dei due filamenti di DNA, caratteristica per ogni specie di acido nucleico. Altre tecniche di indagine si basano sulla struttura antigenica, la composizione biochimica, lomologia del DNA e le correlazioni filogenetiche Lidentificazione batterica non può prescindere dagli aspetti epidemiologici inerenti la conoscenza della sua distribuzione, dalla frequenza della malattia in seno alla popolazione e dalle condizioni ambientali, demografiche e sociali che possono favorire od ostacolare il suo sviluppo nel territorio.

28 PARETE CELLULARE Capsula polisaccaridica (glicocalice) con funzione di protezione dallambiente esterno a bassa presssione osmotica Peptidoglicano (detto mureina) costituito da una parte peptidica (costituita da 4 aminoacidi) e da una glicidica caratterizzata da due carboidrati azotati: N-acetilglucosamina e lacido N-acetilmuramico uniti da legame beta glicosidico Nei Gram positivi si trova una maggiore quantità di peptidoglicano rispetto ai Gram negativi. Nello strato di peptidoglicano vi sono inoltre lipidi, proteine, polisaccaridi Nei Gram negativi lo strato di peptidoglicano è ricoperto da una membrana parietale esterna formata da fosfolipidi, lipoproteine, lipopolisaccaridi, proteine Il lipopolisaccaride della membrana parietale, impermeabile per alcuni antibiotici e resistente allazione detergente degli acidi biliari, degli acidi grassi e degli enzimi intestinali, favorisce ladattamento intestinale di alcuni enterobatteri. GENETICA BATTERICA Trasformazione, coniugazione, trasduzione

29 Fotoautotrofi Fonte di energia: Luce Fonte di Carbonio: CO2 atmosferica Fonte elettroni: H 2 O, H 2 S Ossigenici, anossigenici (S 2, SO 4 -- ) Tipo clorofilla: clorofilla a, batterioclorofilla Esempi: Cianobatteri, batteri verdi e purpurei Fotoeterotrofi Fonte di energia: Luce Fonte di Carbonio: Composti organici Fonte elettroni: H2S, S, ecc. Pigmento fotosintetico: batteriorodopsina Esempi: Solforodobatteri,batteri verdi e purpurei non sulfurei (batteri alofili) Chemioautotrofi Fonte di energia: Ossidazione di sostanze inorganiche Fonte di Carbonio: CO2 atmosferica Esempi: Batteri Nitrificanti nitratatori: Ca(NO2)2+O2 >Ca(NO3)2 (=nitriti >nitrati), idrogenobatteri (lidrogeno gassoso viene utilizzato come fonte per la riduzione della CO2 per ottenere CH2O), Solfobatteri: 2H2S+O2 >2H2O + S2 (Thiobacillus nei fondi dacqua stagnante) (= acido solfidrico >acqua e zolfo inorganico)Nitrificanti nitrosatori: (NH4)2CO3+3O2 >2HNO2+CO2+3H2O (= sali dammonio >acido nitroso ovvero nitriti di Ca o Mg), Ferrobatteri: ossidano ioni ferrosi in ioni ferrici (pellicole superficiali argentate o iridate) 2FeCO3 + 3H2O + ½ O2 >2Fe (OH)3 + 2CO2 (Fe bivalente >Fe trivalente; lo stesso tipo di reazione può avvenire col Mn), Solfato-riduttori (da ione solfato ad H2S e da acetato ed altri composti a CO2), Denitrificatori (trasformazione delle sostanze azotate nel terreno.Da anione nitrico ad ammoniaca o N2 ) Chemioeterotrofi Fonte di energia: Ossidazione di sostanze organiche Fonte di Carbonio: Composti organici Esempi: Quasi tutti i batteri patogeni I Procarioti Chemioeterotrofi possono essere: Saprofiti Si nutrono di organismi in decomposizione o di sostanza organica nel suolo Parassiti Si nutrono a carico di Eucarioti (Protisti, Animali, Funghi o Piante) Simbionti Instaurano una simbiosi con Eucarioti (per lo più Piante o Protisti) Azotofissatori (Cianobatteri – es. licheni, Attinomiceti – es. Ontano, Rhizobium – es. leguminose)

30 Tipo Fonte di energia Fonte di carbonio Microrganismi FotoautotrofiLuceCO2 Alghe verdi-blu, batteri fotosintetici FotoeterotrofiLuce Composti organici Batteri rossi, fotosintetici Chemioautotrofi Composti organici CO2 Solfo-, Ferro-, Ammonio-batteri, Batteri metanoproduttori Chemioeterotrofi Composti organici Protozoi, funghi, la maggior parte dei batteri (tutti quelli patogeni) physiological groupenergy sourceoxidized end productorganism hydrogen bacteriaH2H2OAlcaligenes, Pseudomonas methanogensH2H2OMethanobacterium carboxydobacteriaCOCO2Rhodospirillum, Azotobacter nitrifying bacteria*NH3NO2Nitrosomonas nitrifying bacteria*NO2NO3Nitrobacter sulfur oxidizersH2S or SSO4Thiobacillus, Sulfolobus iron bacteriaFe ++Fe+++Gallionella, Thiobacillus Elettroni accettoriProdotto ridotto finaleTipo di processoMicrorganismo O2H2Orespirazione aerobicaEscherichia, Streptomyces NO3NO2, NH3 or N2denitrificazioneBacillus, Pseudomonas SO4S or H2Sriduzione solfatiDesulfovibrio fumaratosuccinatorespirazione anaerobica Escherichia CO2CH4metanogenesiMethanococcus CARATTERISTICHE METABOLICHE E NUTRIZIONALI

31 BATTERI GRAM – POSITIVI 1.Bacillus anthracis 2.B. thurigiensis 3.Clostridium denitrificans 4.C. botulinum 5.C. tetani 6.C. perfrigens (avvelenamento di cibi e gangrena gassosa) 7.Lactobacillus 8.Listeria 9.Staphylococcus aurei (infezioni dellapparato respiratorio) 10.Streptococcus mutans (cavo orale, carie) 11.Streptococcus pneumoniae 12.Mycobacterium tubercolosis 13.Streptomices 14.Micoplasmi BATTERI GRAM – NEGATIVI 1.Beggiatoa (batteri striscianti) 2.Treponema pallidum 3.Campylobacter fetus (infiammazioni intestinali) 4.Rhizobium 5.Nitrobacter 6.Thiobacterium 7.Escherichia coli 8.Yersinia pestis 9.Shigella dysenteriae 10.Vibrio cholerae 11.Salmonella typhimurium 12.Agrobacterium tumefaciens 13.Neisseria gonorrhoeae 14.N. meningitidis 15.Rickettsie 16.Clamidie 17.Cianobatteri

32 COLORAZIONI BATTERICHE Fasi principali delle colorazioni: Distensione Essiccamento Fissazione (anche con liquidi fissatori quali la miscela alcool – etere per 10 ninuti, alcool etilico assoluto per 20 minuti, alcool metilico per 2-3 minuti) Colorazione semplice o monocromatica Colorazione differenziale (con due coloranti) Si usano coloranti basici di anilina per la grande affinità nei confronti degli acidi nucleici (blu di metilene, fucsina basica, violetto di genziana, cristalvioletto, tionina, safranina) Si usano coloranti acidi per laffinità che hanno per il citoplasma (eosina, fucsina acida, nigrosina) Per favorire la penetrazione dei coloranti si usano dei mordenzanti quali il fenolo e la soluzione iodo-iodurata Le soluzioni madri si preparano sciogliendo 10 grammi di colorante in polvere in 100 g di alcool etilico al 95% o assoluto Le soluzioni idroalcoliche per la colorazione si preparano aggiungendo a 10 ml di soluzione madre 90 ml di acqua distillata. Per le soluzioni mordenzate si procede sciogliendo prima lacido fenico nellacqua distillata e aggiungendo poi 10 ml della soluzione madre. La quantità di acido fenico varia da 1 g a 5 g a seconda del tipo di colorazione.

33 REGOLA DELLE MISCELE COLORAZIONE DI GRAM Si basa sulla facoltà di alcuni coloranti, quali il violetto di genziana, il cristalvioletto, ecc. di reagire con lo iodio di una soluzione iodo-iodurata, per dare composti resistenti alla colorazione con alcool. Mentre i batteri Gram positivi non si scolorano con alcool e appaiono colorati in viola-blu al microscopio, i Gram negativi acquisiscono una colorazione rosa-rosso del secondo colorante (fucsina, safranina, ecc.). Ciò è dovuto al fatto che i Gram negativi hanno un contenuto in lipidi più alto, lipidi che vengono rimossi con il lavaggio con alcool con conseguente aumento della permeabilità della parete. TECNICA: 1.Stemperare una goccia di brodocoltura, o una colonia cresciuta in piastra,in una goccia di acqua sterile depositata su un vetrino portaoggetti 2.Distendere per strisciamento con lansa 3.Lasciare asciugare e fissare 4.Colorare per 1 minuto il preparato con violetto di genziana fenicato di Nicolle al 2% (o di cristalvioletto) 5.Allontanare leccessso di colore e, senza lavare, coprire con liquido di Lugol facendo agire per 1 minuto 6.Lavare con acqua e versare gocce di alcool sul vetrino finchè il preparato non cede più colorante 7.Colorare per 10 secondi con soluzione di safranina allo 0,25%, o con fucsina diluita 1:10 per 30 secondi 8.Lavare e asciugare

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35 Colorazione di Ziehl-Neelsen Viene effettuata per la ricerca del bacillo tubercolare e di altri micobatteri. I microrganismi acido resistenti si colorano con difficoltà per la presenza di un involucro ricco di cere e di grassi che riveste la cellula batterica. A differenza degli altri batteri gli acido-resistenti una volta colorati resistono alla decolorazione di una soluzione alcool-acido. TECNICA 1.Far agire sullo striscio fissato alla fiamma la fucsina basica fenicata a caldo (sciogliere 3 g di fucsina basica in 10 ml di etanolo al 95% ed aggiungere 90 ml di una soluzione acquosa di fenolo al 5%), in modo da far svolgere i vapori senza far bollire 2.Lavare con acqua e decolorare per 2 minuti con soluzione di acido solforico al 20% o ac. Cloridrico al 3% o ac. Nitrico al 33% fino a che il preparato non diventa giallo 3.Lavare e far agire ripetutamente con etanolo al 95% per 5 minuti finchè il preparato non cede più colore 4.Lavare con acqua e colorare per 1 minuto con soluzione idroalcolica di blu di metilene: 0,5 g di blu di metilene, ml di acqua distillata 5.Lavare con acqua e asciugare

36 COLORAZIONE DELLA CAPSULA La capsula è una formazione non essenziale, composta in genere di polimeri di carboidrati, la quale conferisce ai batteri proprietà peculiari quali la virulenza, lattività antifagocitaria, la protezione fisico-chimica dallambiente esterno, la resistenza allessiccamento, ecc. La capsula dei batteri non ha per i coloranti la stessa affinità degli altri componenti cellulari e quindi rende necessario luso di particolari procedimenti di colorazione. Linchiostro di china e la nigrosina mettono in evidenza la capsula per mezzo di una colorazione negativa. Colorazione con eosina: 1. fissare lo striscio alla fiamma 2.Colorare per 2-3 minuti con violetto di genziana fenicato 3.Decolorare per qualche secondo con una soluzione alcool-acetone 4.Lavare e colorare per pochi secondi con una soluzione alcolica di eosina allo 0,5% I batteri appaiono colorati in violetto, le capsule in rosa-rosso Colorazione con nigrosina: 1.Stemperare su un vetrino portaoggetti una goccia di campione in una goccia di nigrosina 2.Stendere uniformemente con un altro vetrino, fino a formare una sottile pellicola 3.Asciugare allaria e osservare con lobiettivo ad immersione Le cellule appaiono incolori su sfondo scuro

37 COLORAZIONE DELLE SPORE Gli involucri di rivestimento rendono le spore pressochè impermeabili ai comuni coloranti; una volta colorate si decolorano con difficoltà. Sono sporigeni i batteri del genere Bacillus e Clostridium Colorazione di Schaeffer-Fulton 1.Ricoprire lo striscio con soluzione verde malachite e mantenerlo sopra la fiamma per 30 secondi fino allo sviluppo dei primi vapori 2.Lavare con acqua 3.Colorare con safranina per 30 secondi 4.Lavare, asciugare ed esaminare Colorazione di Moller 1.Immergere lo striscio in una soluzione acquosa di acido cromico al 5% per 2 minuti 2.Lavare in acqua corrente 3.Colorare per un minuto con fucsina fenicata 4.Passare velocemente in acido solforico al 5% fino a scomparsa del colore rosso 5.Lavare con acqua corrente 6.Colorare con soluzione acquosa di blu di metilene 7.Lavare con acqua e asciugare 8.Montaggio in balsamo Le spore appaiono colorate in rosso su sfondo azzuro

38 TERRENI DI COLTURA La semina in un terreno di coltura persegue due obiettivi 1.Determinare la carica microbica in una unità di campione (1 g o un ml) 2.Identificare la presenza/assenza di microrganismi patogeni 3.Coltivare microrganismi per produzione industriale 4.Verificare lefficienza di prodotti farmaceutici 5.Verificare la sensibilità ad agenti antimicrobici mediante lantibiogramma 6.Controllare la sterilità di materiali e attrezzature Allisolamento dei microrganismi in terreni selettivi e differenziali, segue lidentificazione mediante: 1.Colorazioni, per individuare laspetto morfologico 2.Microscopio ottico 3.Prove di identificazione biochimica 4.Tipizzazione sierologica I terreni possono essere liquidi, semisolidi (0,3-0,5% di agar), solidi con aggiunta di agar (1-2%) o con la coagulazione al calore (se a base di siero e di uova) Lagar è un composto mucopolisaccaridico (galattosio + ac. galatturonico) estratto da alghe marine. Solidifica a 38 °C e fonde a 84 °C

39 Un terreno può contenere: Sostanze nutrienti (proteine, peptidi, aminoacidi, infuso di carne, triptoni, caseina) ed energetiche (zuccheri) Metalli e minerali essenziali (sodio, potassio, calcio, ferro, magnesio, cloro, fosforo,zolfo) Sostanze tamponanti a valori specifici di pH (fosfati mono e di-sodico e di K, acetati…) Indicatori per evidenziare la fermentazione dei carboidrati o dei composti azotati, i quali cambiano colore ad un determinato pH (rosso fenolo, porpora di bromo-cresolo, fucsina, rosso neutro) Indicatori di ossido-riduzione quali il blu di metilene e la resazurina, che virano in presenza di ossigeno Fattori di crescita quali sangue, siero, estratti di lievito Agenti selettivi antimicrobici (antibiotici quali neomicina, cloramfenicolo, vancomicina) e prodotti chimici quali Sali biliari, i coloranti di anilina (eosina, verde brillante…), il selenio, il tetrationato, il tellurito, lazide sodica, per inibire la crescita dei microrganismi indesiderati a vantaggio di quelli che si vogliono isolare Gelificanti quali lagar La bile, gli acidi e i Sali biliari, non inibiscono gli enterobatteri patogeni (Salmonelle e Shigelle) e, in genere, i Gram negativi, mentre hanno attività batteriostatica o battericida su alcuni enterobatteri saprofiti e sui Gram positivi Il cloruro di sodio a concentrazioni 10 volte superiori non inibisce lo sviluppo degli stafilococchi e di altri batteri alofili Certi coloranti ottenuti dal trifenilmetano quali il cristalvioletto, la fucsina basica, il verde brillante, il verde malachite, inibiscono i Gram positivi (in particolare gli streptococchi fecali) a concentrazioni minori rispetto a quelle necessarie per i Gram negativi Lazide sodica allo 0,2 g/l permette lo sviluppo degli enterococchi (streptococchi fecali) mentre inibisce quello dei microrganismi Gram negativi associati

40 PREPARAZIONE DI UN TERRENO Molte ditte hanno in catalogo terreni in polvere disidratati, da ricostituire secondo le istruzioni, o terreni pronti alluso in capsule Petri, in provetta, in flaconi. Pratici e facili da usare sono i cartoni nutrienti impregnati con mezzi di coltura liquidi essiccati e sterilizzati. Sono pronti alluso previa reidratazione con pochi ml di acqua distillata Pesati i prodotti, seguendo le indicazioni riportate sulla confezione, le polveri vanno sciolte in beuta o altro recipiente di volume adeguato mediante ebollizione, avendo cura di agitare continuamente per evitare che il terreno posto sul fondo si bruci. Raffreddare a circa 50 °C, mescolare e distribuire nei contenitori finali: tubi, provette inclinate a becco di clarino (slant), capsule petri, beute. Verificare sulla confezione se il terreno va autoclavato e a quale temperatura. Quando il contenitore è provvisto di tappi a vite questi vanno allentati per favorire la fuoriuscita dellaria durante il riscaldamento in autoclave. Finita la sterilizzazione, prima di estrare i contenitori, attendere che la temperatura sia scesa sotto gli 80 °C. Controllare il pH finale ed aggiungere, se necessario, HCl o NaOH Per accertare lavvenuta sterilizzazione vi sono indicatori biologici sotto forma di strisce contenenti spore di Bacillus stearothermophilus e B. subtilis. Le strisce in substrato liquido, dopo la sterilizzazione, vanno incubate per 48 ore a 55 °C. Se la sterilizzazione è avvenuta non si verificano cambiamenti di torbidità Conservazione dei terreni I terreni andrebbero utilizzati freschi, entro 2-3 ore.I terreni liquidi o agarizzati contenuti in bottiglie con tappo a vite, si conservano fino a 6 mesi al riparo della luce a °C Al bisogno, i terreni solidi vengono ridisciolti in bagnomaria bollente o in un forno a microonde per pochi minuti

41 IDENTIFICAZIONE DEI BATTERI RACCOLTA DEL CAMPIONE Il campione non deve subire modifiche durante il trasporto e la conservazione, e dovrebbe ospitare al momento dellanalisiuna flora microbica qualitativamente e quantitativamente uguale a quella presente durante il prelievo Per il trasporto si utilizzano bauletti termostatati, con piastre termiche congelanti in grado di mantenere una temperatura di 2-4 °C In genere si prelevano non meno di 5 unità campionarie PREPARAZIONE DEL CAMPIONE Lunità di volume (ml) o di peso (g) del campione viene seminata per inclusione in un terreno idoneo. Le cellule si dividono ogni 20 minuti. Dopo ore si formano colonie visibili ad occhio nudo costituite da un minimo di 106 cellule Il conteggio viene esspresso in U.F.C. (unità formanti colonie) per ml o grammo. Laspetto delle colonie può essere liscio S (smooth) di consistenza cremosa, rugosa a margini frastagliati o mucoso, tipico dei batteri capsulati OMOGENEIZZAZIONE Se il campione si trova allo stato solido (es. buro, formaggio, ecc.) si portano 30 grammi dello stesso in una quantità nove volte di diluente in modo da ottenere una diluizione di 1:10. Campione e diluente vengono omogeneizzati in un miscelatore-omogeneizzatore

42 DILUIZIONE Requisito indispensabile del diluente è lisotonicità con le cellule microbiche. Dallomogenato diluito si pipetta 1 ml(pari a 0,1 ml o gr di campione) che viene inoculato in 10 ml di terreno liquido (brodo) posto in provetta oppure in piastra Petri. Per ogni diluizione si seminano due piastre.Se il numero di UFC supera le 300 unità è necessario effettuare ulteriori diluizioni sempre 1:10. Il conteggio delle UFC deve essere riferito a ml o a gr.Tenendo conto che 1 ml della prima diluizione corrisponde a 0,1 gr o ml se la diluizione utilizzata fosse ad es ed il numero di UFC pari a 200 allora il numero di UFC / ml (o gr) sarà 200 X 1000 = Es. diluente: Cloruro di sodio 2,5 g/l Cloruro di potassio 0,105 g/l Cloruro di calcio 6H2O 0,12 g/l Bicarbonato di sodio 0,05 g/l Acqua 1000 ml

43 SEMINA La coltivazione dei microrganismi in substrati artificiali ha lo scopo di quantificare il numero di germi nellunità di peso (gr) o di volume (ml), oppure di verificare lassenza in quantità definite di campione dei microrganismi patogeni. Nel primo caso deve essere seminato un volume notodel materiale in esame. Lentità del campione dipende dal microrganismo cercato e dallalimento Semina in provetta 1.Per infissione centrale con lago 2.In superficie e in profondità mantenendo inclinata la provetta di circa 30° Semina in piastra per inclusione 1.Deporre 1 ml di campione opportunamente diluito 2.Versare ca. 15 ml di terreno liquido a ca. 46 °C 3.Lasciare raffreddare le piastre con il coperchio semiaperto per 10 minuti, vicino alla fiamma di un bunsen per ridurre la formazione di condensa 4.Incubare le piastre capovolte in termostato a temperatura, in genere, di 37 °C per 24 ore Semina in piastra per strisciamento Lo scopo è quello di distribuire linoculo in modo da assicurare lo sviluppo di colonie isolate. La tecnica consiste nellinoculare unansata di campione sulla superficie di un terreno solidificato, vicino ai bordi della piastra Petri, e distribuirlo con lanse su tutta la superficie.

44 INCUBAZIONE Si utilizzano termostati ad aria o bagnimaria termostatati. Le piastre vanno capovolte per evitare il rapido essiccamento e la formazione sul coperchi di gocce di condensa che potrebbero compromettere la crescita microbica Per lincubazione in anaerobiosi si possono usare terreni contenenti sostanze riducenti ATTIVITA METABOLICHE DEI BATTERI Lo studio delle caratteristiche biochimiche sono alla base del riconoscimento di molti microrganismi. Esse rappresentano una sorta di impronta digitale, la prova del nove per la determinazione della specie 1.Produzione di catalasi: è possibile differenziare gli stafilococchi (catalasi positivi) dagli streptococchi (catalasi negativi).La catalasi si può dimostrare stemperando unansata della colonia batterica in una goccia di acqua ossigenata al 3% 2.Produzione di coagulasi: è un enzima liberato da alcuni batteri (stafilococchi patogeni, ecc.) in grado di coagulare il plasmadi coniglio 3.Le Enterobacteriaceae si caratterizzano per le seguenti attività metaboliche: 1- utilizzazione del glucosio per via fermentativa,2 - assenza di attività citocromo ossidasica, 3- riduzione dei nitriti a nitrati, 4-idrolisi della gelatina, 5-produzione di acido solfidrico, 6-produzione di indolo, 7-produzione di ureasi, 8-prova dellONPG, 9-prova della decarbossilasi, 10-prova dellutilizzazione del citrato

45 REQUISITI DI QUALITA DELLE ACQUE DESTINATE AL CONSUMO UMANO La legge 236/88 tra i requisiti di qualità da prendere in considerazione per le analisi delle acque destinate al consumo umano impone parametri organolettici (colore, torbidità, odore, sapore), fisico-chimici e microbiologici Oltre a tali parametri, a giudizio dellautorità sanitaria competente potrà essere effettuata la ricerca concernente i seguenti parametri accessori: 1.Alghe 2.Batteriofagi anti Escherichia coli 3.Elminti 4.Enterobatteri patogeni 5.Enterovirus 6.Funghi 7.Protozoi 8.Pseudomonas aeruginosa 9.Stafilococchi patogeni Il DPR 236/88 prevede tra i parametri microbiologici tre controlli di routine (C1, C2, C3) ed un controllo occasionale C4

46 TECNICHE PER QUANTIFICARE I PARAMETRI MICROBIOLOGICI Colimetria: principali tecniche per quantificare i coliformi 1.Conta diretta su piastre Petri 2.Metodo statistico o MPN (Most Probable Number) 3.Filtrazione su membrana (MF) La conta diretta fa riferimento a volumi piastrabili non superiori a 1ml, quantità insufficiente per accertare lassenza di coliformi quali indicatori di inquinamento fecale Tecnica MPN: si basa sullelaborazione statistica dei risultati positivi o negativi di diverse serie (3 o 5) di tubi contenenti un brodo in cui i coliformi (in diluizioni successive 1:10) fermantano il lattosio con produzione di acidi e di gas. La densità batterica (MPN/100 ml) è funzione esponenziale del numero di provette positive Tcnica MF: Si basa sulla filtrazione sottovuoto di 100 ml o più di acqua su membrane di acetato di cellulosa con porosità 0,45 micron. La filtrazione avviene con pompa ad acqua unita ad un comune rubinetto. La membrana viene quindi trasferita su un terreno selettivo in capsula Petri Di fatto non sono disponibili metodi di sicura affidabilità che permettano la determinazione del numero totale di microrganismi vitali contenuti in acqua. Le metodiche di uso comune presentano sempre sostanziali differenze tra i conteggi nei terreni di coltura in piastra e i conteggi totali diretti al microscopio. Inoltre il numero di batteri capaci di formare colonie su terreno agarizzato è palesemente inferiore rispetto alla concentrazione reale nelle acque e nel suolo

47 RICERCA DEI COLIFORMI TOTALI E DEI COLIFORMI FECALI I coliformi sono batteri Gram negativi, a morfologia bastoncellare, aerobi-anaerobi facoltativi, non sporigeni, in grado di fermentare il lattosio con produzione di acido e di gas entro 48 ore dallincubazione a °C (coli totali), a 44,5 °C (coli fecali). Comprendono i generi Escherichia, Klebsiella, Enterobacter e Citrobacter. Coliformi totali Sono batteri diffusi nel suolo, nelle materie prime di origine animale e vegetale, nelle acque e negli ambienti in generale. Con la loro presenza nelle acque i coliformi si comportano come indicatori di inquinamento fecale, segnalando il rischio potenziale della contemporanea presenza di enterobatteri patogeni a localizzazione intestinale (salmonelle e Shigelle) La ricerca può effettuarsi con il metodo MF o col metodo MPN Metodo MF: Composizione terreno per il conteggio dei coliformi in g/l: Estratto di lievito 1,2 Triptone 3,7 Peptone P 3,7 Triptosio 7,5 Lattosio 9,4 Potassio fosfato monoacido 3,3 Potassio fosfato biacido 1,0 Sodio cloruro 3,7 Sodio laurilsolfato 0,05 Sodio solfito 1,6 Agar 10 pH finale 7,2 Tutti i microrganismi che producono colonie rosso scuro con riflessi metallici verdi dorati sono da considerarsi possibili coliformi

48 Metodo MPN: Prova presuntiva Composizione in g/l del brodo lattosato: Estratto di carne 3 Peptone 5 Lattosio 5 Acqua distillata 1000 pH finale dopo sterilizzazione 6,9 Mescolare e distribuire 50 ml di brodo doppio concentrato in matracci e 10 ml in provette munite campanella di Durham. Sterilizzare in autoclave a 121 °C per 15 minuti. Conservare il terreno a temperatura ambiente. Per la semina aggiungere in ciascuno dei due matracci 50 ml di campione (acqua). Aggiungere in due serie di 5 provette contenenti 10 ml di LB 10 ml di campione. Incubare a 36°C per 48 ore Sono positivi i contenitori in cui si è avuta entro 48 ore la fermentazione del lattosio con produzione di gas La prova con LB è da considerarsi presuntiva. Prova di conferma I tubi positivi (presenza di gas) devono essere sottoposti a conferma in brodo-lattosio-bile-verde brillante a 36°C per 48 ore. La bile e il verde brillante inibiscono la crescita dei batteri Gram-positivi, mentre i coliformi si manifestano fermentando il lattosio con liberazione di gas. Sulla base della positività su tale terreno riportare il valore come MPN/100 ml di campione. Composizione del BGBB in g/l: Peptone 10 Lattosio 10 Bile di bue 20 Verde brillante 0,0133 Acqua distillata 1000 pH finale 7,4

49 Tabella per il calcolo del numero più probabile MPN Quantità di acqua seminata per ogni beuta e per tubo Numero più probabile/100 ml di campione Quantità di acqua seminata per ogni beuta e per tubo Numero più probabile/1 00 ml di campione Numero di tubi positivi ml 50ml Numero di tubi positivi ml 50ml oltre

50 Coliformi fecali Comprendono i batteri termoresistenti (44°C) il cui habitat naturale è lintestino umano o Animale. La specie più rappresentativa è Escherichia coli. Poiché E.coli è un ospite normale predominante della popolazione batterica aerobia-anaerobia facoltativa residente nellintestino crasso, la sua presenza in un dato materiale (acqua, alimenti, ecc.) viene considerata un indizio sicuro di contaminazione fecale. Metodo MF Terreno per il conteggio dei coliformi fecali mediante MF: Triptosio 10 Peptone proteasi 5 Estratto di lievito 3 Sodio cloruro 5 Lattosio 12,5 Sali biliari 1,5 Blu di anilina 0,1 Agar 15 Acqua distillata 1000 pH finale 7,4 Aggiungere 10 ml di una soluzione di acido rosolico (1% di NaOH 0,2N) Non autoclavare Lacido rosolico ( (C 6 H 4 OH)2 CC 6 H 4 O ) sopprime la flora microbica non coliforme

51 Metodo MPN Composizione in g/l del terreno liquido di conferma indicato per la ricerca dei coliformi fecali (EC Medium) Triptone 20 Lattosio 5 Sali biliari n° 3 1,5 Potassio fosfato monoacido 4 Potassio fosfato biacido 1,5 Cloruro di sodio 5 pH finale 6,9 Procedura Prova presuntiva Prima di procedere allinoculo di aliquote scalari del campione nei tubi del brodo per la prova presuntiva, agitare vigorosamente il campione per assicurare una distribuzione omogenea dei microrganismi sospesi nellacqua. Dopo linoculo agitare leggermente i tubi e procedere allincubazione in termostato entro 30 minuti. Incubare a 36±1°C. Dopo 24±2 ore agitare ciascun tubo per verificare la formazione di gas nella campanella ed eventualmente reincubare per altre 24 ore. Alla fine del periodo di incubazione registrare i risultati in base alla disposizione dei tubi che presentano produzione di gas ed intorbidimento del brodo. La produzione di gas entro le 48±3 ore costituisce una reazione positiva presuntiva, sottoporre alla prova di conferma i tubi risultati positivi. Prova di conferma Prelevare, sterilmente, 1 mL di brodocoltura dai tubi positivi del brodo per la prova presuntiva (formazione di gas entro le 48 ore) ed inoculare nei corrispondenti tubi contenenti il brodo per la prova di conferma. Incubare i tubi a 44±1°C per 24±2ore. Alla fine del periodo di incubazione, la formazione di gas nelle campanelle costituisce una reazione positiva per i coliformi fecali. Annotare i risultati ottenuti indicando il numero di tubi positivi e negativi e, sulla base delle combinazioni ottenute, consultando la Tab. 1, calcolare, considerando leventuale diluizione, il valore dellindice MPN. La formazione di gas nella campanella di Durham indica la presenza di E. coli senza escludere la presenza di coliformi. La presenza di gas solo a 37 °C segnala la presenza di coliformi ed esclude quella di E. coli. Escherichia coli si distingue dagli altri coliformi lattoso-fermentanti per la capacità di produrre indolo in acqua triptonata in 24 ore a 44 °C. Un terreno idoneo per la conferma di E. coli da tubi presuntivi è il Brodo Triptone Mannitolo Ricinoleato (BTMR)

52 IL LATTE Se non altrimenti specificato, il latte destinato al consumo umano è quello ottenuto dalla mungitura regolare, ininterotta e completa della mammella di mucche in buono stato di salute e di nutrizione La direttiva CEE n° 46/92 stabilisce la seguente nomenclatura:

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55 MICROFLORA DEL LATTE Prelevato in condizioni igieniche ottimali in una vaccina sana, il latte contiene in media alla mungitura circa 5000 microrganismi e meno di 1 coliforme/ml. Si tratta in genere di micrococchi, streptococchi lattici e lattobacilli saprofiti presenti nei canali galattofori della mammella. Le sorgenti di origine endogena sono influenzate dalle condizioni sanitarie della lattifera che può essere affetta da mastiti, e altre malattie infettive quali la brucellosi, lafta epizootica, il carbonchio ematico, il vaiolo, la tubercolosi, la febbre Q (causata da Coxiella burnetii), ecc. La contaminazione esogena dipende dalligiene della mungitura, dalle condizioni igieniche della stalla e dellanimale, dal trasporto e dalla conservazione del latte. Il latte crudo, prima dei trattamenti termici, può subire la contaminazione di una variegata microflora batterica. Molti germi psicrotrofi sono in grado di moltiplicarsi anche a temperature di refrigerazione sotto i 7°C. I principali sono: Acinetobacter, Alcaligenes, Flavobacterium, Pseudomonas, ed alcuni sporigeni dei generi Bacillus e Clostridium. Il latte può essere inquinato anche da lieviti (Saccharomyces cerevisiae, Candida Kefyr, Debaryomyces hansenii, ecc.). La bovina malata può trasmettere alluomo con il latte patogeni quali: Mycobacterium bovis, M. tubercolosis, Brucella abortus, B. melitensis, B. suis, Salmonella, Leptospira, Listeria monocytogenes, Bacillus cereus, Pasteurella multocida, Clostridium perfrigens, Coxiella burnettii, Campylobacter, Yersinia enterocolica, ecc.

56 BATTERI LATTICI I batteri lattici sono bacilli Gram positivi, immobili, asporigeni, anaerobi microaerofili (crescono anche in presenza di esigue quantità di ossigeno). Metabolizzano gli zuccheri con produzione di acido lattico. La percentuale di acido lattico prodotto è variabile con la specie di bacillo. La produzione di acido lattico può determinare la coagulazione del latte per la precipitazione della caseina. La dimunuzione di pH favorisce lo sviluppo di batteri acidofili e dei miceti che preparano lambiente per altri microrganismi in grado di decomporre ciò che resta delle sostanze organiche, accelerando i processi putrefattivi. Le capacità fermentative variano da specie a specie e sono più elevate nei batteri lattici termofili. I generi principali di batteri lattici sono: Lactobacillus, Streptococcus, Lactococcus, Leuconostoc, Pediococcus

57 TRATTAMENTI TERMICI PER IL LATTE ALIMENTARE PASTORIZZAZIONE 1.In flusso continuo: si realizza a temperature comprese fra 61 e 65°C per almeno 30 minuti in modo da assicurare la completa distruzione di tutti i microrganismi patogeni (in particolare il bacillo di Koch) 2.Rapida: (H.T.S.T) si esegue a °C per secondi e rapido raffreddamento a 2-4 °C Diversi sono i batteri che possono sopravvivere a queste temperature: (Streptococcus termophilus, micrococchi, Clostridium, ecc.) Si distinguono i seguenti tipi di latte pastorizzato: 1.Latte pastorizzato ottenuto da latte già pastorizzato: deve presentare al consumo a) la prova della fosfatasi alcalina negativa; b) un contenuto in sieroproteine solubili non denaturate non inferiore all11% delle proteine totali 2.Latte fresco pastorizzato ottenuto da latte crudo trattato entro 48 ore dalla mungitura: a) fosfatasi alcalina negativa; b) sieroproteine > 14%; c) positivo alla prova della perossidasi. In relazione al contenuto dei grassi il latte pastorizzato può essere: - intero, con valori non inferiori al 3,5%; - parzialmente scremato, con valori inferiori all1,8%; - scremato, con valori inferiori all1% 3.Latte fresco pastorizzato di alta qualità ottenuto da latte crudo di elevate caratteristiche qualitative: è un latte con particolari caratteristiche igieniche e di composizione stabilite con riferimento al contenuto di proteine, di grasso, di carica batterica totale. Tale latte proviene da bestiame selezionato, allevato in fattorie modello, con tutte le caratteristiche di igiene e di genuinità imposte dalla legge 169/1989 e dal decreto 185 del 975/1991 STERILIZZAZIONE La sterilizzazione deve assicurare la distruzione di tutti i microrganismi o impedirne definitivamente la proliferazione. Di fatto un pur minimo rischio microbiologico rimane Le modificazioni sul valore biologico del latte sterilizzato riguardano in particolare la riduzione della componente proteica e vitaminica (vitamine C, B1, B12, E) Linterazione del lattosio con le proteine può creare imbrunimento ed accentuare il sapore di cotto o di caramello. Il latte sterilizzato viene definito: a)Latte sterilizzato a lunga conservazione: quando ha subito un trattamento termico finale di sterilizzazione in contenitore sigillato a temperatura di 118 – 120 °C per minuti. La data di scadenza non deve superare i 180 giorni dal confezionamento. b)Latte UHT (Ultra High Temperature): quando il trattamento termico viene applicato in ununica volta a °C per 2 secondi ed è seguito dal confezionamento asettico in un recipiente opaco. La scadenza non deve superare i 90 giorni dal confezionamento. Può avvenire per scambio di calore o per uperizzazione. LATTE A RIDOTTO CONTENUTO DI UMIDITA a)Latte evaporato: sterilizzato a °C per 15 minuticon un contenuto in acqua dal 66 al 68,5%. Grasso dal 10% allo 0,5% b)Latte condensato: con aggiunta di zucchero sotto forma di sciroppo, con il 26% di acqua e il 9% di grasso c)Latte in polvere: essiccato a °C contiene il 4-5% di acqua e grasso dal 26% all1,5%

58 RICERCA DEI PARAMETRI MICROBIOLOGICI Il percorso che in genere si segue è caratterizzato da 4 fasi: 1.Campionamento 2.Preparazione del campione 3.Semina in terreni colturali 4.Identificazione biochimica Le prove principali riguardano: Reduttasi Carica microbica totale Enterobatteri totali Coliformi Salmonelle Staphylococcus aureus Listeria monocytogenes Mastite

59 PROVA DELLA REDUTTASI Introdurre in una provetta 10 ml di latte crudo e 1 ml di blu di metilene. Tappare, agitare ed incubare a 40°C CARICA MICROBICA TOTALE Il D.M. del 26/3/92 impone la numerazione dei germi in piastra a 30°C, a 21°C e la numerazione dei coliformi a 30°C. Il metodo si applica al latte crudo, al latte pastorizzato, nonché a quello uperizzato e sterilizzato dopo preincubazione a 30°C per 15 gg. La tecnica consiste nel seminare il campione in un terreno di coltura, incubare in termostato a 30 °C per 72 ore per la carica mesofila e a 21°C per 25 ore per quella psicrotrofa e contare le colonie. Si calcola il numero dei germi per 1 ml nel caso del latte crudo o pastorizzato e per 0,1 ml nel caso del latte uperizzato o sterilizzato.Diluizioni: a) latte crudo: diluire da 1:1000 a 1:100000; b) latte pastorizzato: diluire da 1:10 a 1:1000. Conteggio: Contare con il contacolonie le coppie di piastre nelle quali sono visibili colonie in numero né troppo basso (ca.30), né troppo alto(non superiore a 300). Calcolare la media dei due conteggi e moltiplicare per il reciproco della diluizione. Il risultato corrisponde al numero delle U.F.C per unità di peso o di volume. Terreno di coltura: () Agar ContaLatte agarizzato Estratto di carne 3 g/lEstratto di lievito 2,5 g/l Triptone 5 g/lTriptone 5,0 g/ Destrosio 1 g/lDestrosio 1 g/l Agar 15 g/l Latte scremato in polv. 1 g/l Diluente: Agar 15 g/l Peptone 1 gAcqua 1000 ml Cloruro di sodio 8,5 g Acqua 1000 g

60 SAGGIO ALLA RESAZURINA Permette di valutare lo stato microbico del latte. Più sono i germi e più veloce è leffetto riducente della resazurina e quindi la decolorazione del latte da azzurrato al colore originario. In una provetta a 10 ml di campione si aggiunge 1 ml di resazurina. Si chiude con tappo sterile, si agita e si pone a bagnomaria a 37-40°C per 10 minuti. Tanto più la carica microbica del latte è alta tanto più rapidamente si avrà la decolorazione. ENTEROBACTERIACEAE La famiglia delle Enterobacteriacae raggruppa batteri bacillari e coccobacillari a prevalente habitat intestinale, Gram negativi, aerobi-anaerobi facoltativi con metabolismo sia respiratorio sia fermentativo degli zuccheri con produzione di acidi e di gas.. Sono catalasi positivi e privi dellenzima ossidasi. Gli enterobatteri sono accomunati da caratteri biochimici e sierologici che rappresentano uno dei criteri di classificazione. A livello colturale, gli enterobatteri mostrano rispetto ai Gram positivi, una minore sensibilità nei confronti di acidi, Sali biliari e coloranti (cristalvioletto…). Crescono bene in terreno contenente rosso neutro dove producono colonie rosse. I generi più comuni sono: Citrobacter, Edwardsiella, Enterobacter, Erwinia, Escherichia, Klebsiella, Morganella, Proteus, Providencia, Salmonella, Serratia, Shigella, Yersinia Enterobacteriaceae totali: metodo di inclusione in piastra Incubare a 37°C per 24 ore su Violet Red Bile Glucose Agar (VRBGA) Peptone 7 g/l Estratto di lievito 3 g/l Glucosio 10 g/l NaCl 5 g/l Sali biliari 1,5 g/l Rosso neutro 0,03 g/l Cristalvioletto 0,002 g/l Aga g/l Acqua 1000 ml Prova dellossidasi Si porta unansata stemperata di patina batterica su un dischetto o allestremità di uno stick impregnata con una soluzione di N,N-dimetil-p-fenilendiammina ossalato (Oxoid, ecc.), acido ascorbico e alfa naftolo. Lo sviluppo dopo 30 secondi di un colore blu-porpora è indicativo di reazione positiva. Le enterobacteriaceae sono ossidasi negative.

61 Metodo dellimpedenza Anche basse densità di batteri alterano limpedenza propria del latte Numerazione dei coliformi I coliformi sono batteri ad habitat intestinale, generalmente non patogeni, che a 30 °C fermentano il lattosio con produzione di gas. La loro presenza negli alimenti è indice di inquinamento fecale. I più comuni sono Escherichia coli, Klebsiella, Citrobacter, Serratia ed Hafnia. Principio: Mescolare un volume definito di campione di latte con il terreno di coltura in piastre Petri del diametro di circa 100 mm. Incubare a 30 °C per 24 ore. Contare le colonie caratteristiche confermando, se necessario, lidentità di quelle dubbie con la fermentazione del lattosio. Calcolare il numero di coliformi per 1 ml di latte pastorizzato considerando i fattori di diluizione. Diluizioni suggerite: 1:10, 1:100, 1:1000 Terreni di coltura. 1.Violet Red Bile Lactose Agar (VRBLA) (come il VRBGA con il lattosio al posto del glucosio) 2.Brodo Bile Verde Brillante (BGB) (terreno colturale di conferma) Peptone 10 g/l Lattosio 10 g/l Bile di bue 20 g/l Verde brillante 0,0133 g/l Acqua 1000 ml

62 Determinazione dei coliformi totali col metodo MPN Il metodo MPN è applicabile quando si desideri campionare quantità elevate ed escludere, ad esempio, la presenza di coliformi in 1 g di prodotto. Per il calcolo dellindice MPN si utilizzano le tavole probabilistiche. Si sfrutta la capacità dei coliformi di metabolizzare il lattosio per via fermentativa con produzione di gas che si accumula nella campanella di Durham posta in brodo bile verde brillante Procedimento: Preparare tre diluizioni del campione di latte omogenato 0,1; 0,01; 0,001. Si dispongono tre serie di tre tubi contenenti 10 ml di BGB 2%. -Nei tre tubi della prima fila, contenenti brodo doppiamente concentrato, si inoculano 10 ml di omogenato, equivalenti a 1 g di campione -Nei tre tubi della seconda fila si inocula 1 ml di omogenato, equivalente a 0,1 g di campione per tubo -Nei tre tubi della terza fila si inocula 1 ml di omogenato diluito 1:10, equivalente allinoculo di 0,01 g di campione per tubo Incubare a 32°C per 24 ore. La presenza di coliformi resistenti ai Sali biliari e al verde brillante è testimoniata dalla produzione di gas che si accumula nella campanella di Durham. Prova di conferma Da ciascuna provetta positiva si semina unansata in VRBA. I microrganismi fermentanti il lattosio formano colonie rotonde del diametro < 0,5-2 mm di colore rosso porpora. Interpretazione dei risultati: -Risultato positivo se si ha sviluppo di gas in due tubi su tre della prima fila -Risultato positivo se si ha sviluppo di gas in un tubo su tre della seconda fila -Nessun risultato positivo se non si ha sviluppo di gas nei tre tubi della terza fila. A ciascun risultato si attribuisce un valore pari al numero delle provette positive. Tramite le apposite tabelle di conversione MPN specifiche per varie serie di inoculi di diluizioni, il risultato codificato viene espresso in numero più probabile.

63 Confrma di Escherichia coli La presenza di Escherichia coli insieme a Enterobacter aerogenes in un campione è indice di contaminazione fecale e fa sospettare, per comunanza di nicchia ecologica, la presenza di microrganismi patogeni intestinali quali salmonelle, virus gastroenterici, ecc. E. coli, abituale commensale intestinale, può causare in situazioni particolari serie affezioni diarroiche a carico di ceppi enteropatogeni, enterotossigenici, enteroinvasivi e enteroemorragici Lattività tossica si manifesta quando la carica batterica è compresa tra 100 milioni e 10 miliardi di cellule. E. coli è anche lagente più comune di infezioni urinarie. Gli stipidi enterotossigenici producono due tipi di tossine, una termolabile e una termoresistente, responsabili dei sintomi diarroici. PROCEDIMENTO Inoculare unansata di brodocoltura BGB 2% positiva ai coliformi, in una provetta contenente brodo BGB2% e in una provetta di acqua peptonata (Peptone 10 g/l, Sodio cloruro 5 g/l). Incubare a 44°C per 48 ore. In caso di risultato positivo si ha lo sviluppo di gas nella campanella del tubo con BGB2% Aggiungere, nella provetta contenente acqua peptonata, 1 ml di reattivo di Kovacs (Paradimetilaminobenzaldeide 5 g, Alcool isoamilico 75 ml, Acido cloridrico conc. 25 ml). La prova è positiva quando in presenza di indolo, formato da E. coli per la deaminazione del triptofano, in pochi minuti il reattivo si colora di riosa-rosso. Partendo dagli inoculi positivi a E. coli si può calcolare il MPN come visto per i coliformi totali. Con il materiale della provetta con BGB 2% si può procedere ad altre reazioni ed accertamenti Si inocula in VRBA unansata da BGB2% positiva dopo 48 ore di incubazione a 44°C Da ogni piastra si trapiantano 4-5 colonie in Agar Conta. Dopo incubazione le nuove colonie si seminano: 1.Sulla superficie a becco di clarino del terreno di Simmons (Ammonio fosfato biacido 1 g/l; Fosfato bipotassico 1 g/l; Cloruro di sodio 5 g/l; Citrato di sodio 2 g/l; Magnesio solfato 0,2 g/l; Blu di bromotimolo 0,08 g/l; Agar 15 g/l; Acqua 1000 g/l). Dopo 48 ore di incubazione, in caso di positività si ha crescita e viraggio dal verde al blu scuro.(E. coli non si sviluppa su questo substrato a differenza di Aerobacter aerogenes). 2.In una provetta contenente Brodo Rosso Metile e Voges Proskauer.Si incuba a 37°C per 48 ore. Quindi si trapianta 1 ml di brodocoltura in una provetta e si aggiungono i reattivi di Barritt: 0,6 ml di una soluzione al 5% di alfa-naftolo in alcool etilico assoluto e 0,2 ml di soluzione acquosa al 40% di KOH; agitare in presenza di ossigeno e attendere 15 minuti. Dopo un minuto in caso di positività si ha colore rosso per la presenza di acetoina prodotta dal gruppo Enterobacter-Serratia-Hafnia-Klebsiella ma non da E. coli.

64 CONTROLLO DI QUALITA DEGLI ALIMENTI Gli alimenti o le materie prime utilizzate possono essere vettori di microrganismi patogeni e di tossine preformate. Durante la preparazione, il prodotto può subire ulteriori inquinamenti causati dallambiente di trasformazione, dagli operatori e dalle attrezzature adottate. Determinante il periodo stagionale, con prevedibile peggioramento delle risposte favorevoli nel periodo estivo. PROCEDURE ANALITICHE A 25 g di campione si aggiungono in sacchetto sterile 225 ml di acqua peptonata tamponata (pH 7,0). Si tratta per 1 in Stomacher e si lascia a riposo lomogenato per circa 10. La soluzione, diluita 1:10, viene utilizzata per le successive diluizioni di lavoro e per il pre arricchimento nella ricerca di salmonella. Carica batterica mesofila: 37°C per 48 ore seminando in superficie su Agar Gelisato il campione opportunamente diluito Coliformi totali: 37°C per 48 ore col metodo MPN in Brodo lattosato con Bile, Verde Brillante e campanella di Durham Coliformi fecali: come sopra a 44°C per 48 ore Escherichia coli: conferma dai tubi positivi per coliformi fecali con trapianto in provette di Acqua Triptonata ed incubazione a 44°C per 24 ore per accertare la produzione di indolo e calcolo dellMPN/g Staphylococcus aureus: semina in superficie di 0,1 ml ed 1 ml dellomogenato su agar di Baird-Parker; incubazione a 37°C per 48 ore, conteggio delle colonie sospette e loro identificazione Salmonella spp.: pre-arricchimento a 37°C per 24 ore dellomogenato in acqua peptonata tamponata, arricchimento di 1 ml in 100 ml di Rapport-Vassiliandis a 43°C per 18 ore, isolamento in XLD e prove di conferma


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