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INTRODUZIONE Le esostosi multiple ereditarie (HME) rappresentano una malattia automica-dominante caratterizzata dallo sviluppo di tumori benigni delle.

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2 INTRODUZIONE Le esostosi multiple ereditarie (HME) rappresentano una malattia automica-dominante caratterizzata dallo sviluppo di tumori benigni delle ossa, chiamati esostosi o osteocondromi multipli. Essi riguardano soprattutto le metafisi delle ossa lunga. La prevalenza alla nascita è stimata intorno a 1: e la severità della malattia presenta una discreta variabilità interfamiliare e intrafamiliare. Le esostosi possono causare varie complicazioni cliniche (dolori articolari, deformità ossee ed accorciamento delle ossa lunghe, ridotta mobilità articolare e compressioni di nervi e vasi sanguigni). Sul piano clinico la conseguenza piu importante delle esostosi multiple ereditarie è la trasformazione maligna negli adulti (0,5 - 5 % dei casi).

3 FORME DI PRESENTAZIONE CLINICA DELLE ESOSTOSI OSTEOCONDROMA (85% dei casi in forma sporadica) ESOSTOSI MULTIPLE EREDITARIE (HME) (15% dei casi)

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6 GENETICA DELLE ESOSTOSI MULTIPLE EREDITARIE (HME) Le esostosi multiple ereditarie costituiscono un disordine eterogeneo dal punto di vista genetico. Esse sono associate a mutazioni nei geni EXT1 ed EXT2 che sono considerati essere tumour suppressor genes. Tali geni codificano due proteine chiamate esostosina 1 ed esostosina 2. Si tratta di proteine ad attività glicosiltransferasica coinvolte nella biosintesi delleparan-solfato. Molte mutazioni (frameshift o nonsense) in questi due geni causano la produzione di proteine tronche e non funzionanti, mentre le mutazioni missense ( cambio amminoacidico) sono rare e meno deleterie.

7 GENI EXT e LOCALIZZAZIONE CROMOSOMICA Gene EXT1 localizzato sul cromosoma 8q23-q24 Gene EXT2 localizzato sul cromosoma 11p11-p12 Gene EXT3 localizzato sul braccio corto del cromosoma 19. Famiglia di geni EXT-like: EXTL1 ( cromosoma 1p36) EXTL2 ( cromosoma 1p11-p12) EXTL3 ( cromosoma 8p12-p22) Espressione ubiquitaria, alta omologia di sequenza tra di loro nella regione carbossiterminale.

8 Di recente è stato dimostrato che i geni in cui sono localizzate le alterazioni che determinano l'insorgenza dell'EME chiamati EXT1, EXT2 ed EXT3 sono localizzati rispettivamente sui cromosomi 8, 11 e 19. Le mutazioni sono più frequentemente riscontrabili in EXT1 localizzato sul cromosoma 8.

9 EXT1… …ed EXT2

10 …ed EXT3 ? Possibile localizzazione gene EXT3 (Studi di linkage)

11 Struttura del gene EXT1

12 Struttura del gene EXT2

13 - FUNZIONE DEI GENI EXT1 ed EXT2 EXT1 ed EXT2 svolgono un ruolo importante in un complesso enzimatico coinvolto nella biosintesi delleparansolfato (HS),(complesso polisaccaridico lineare composto da acido hexuronico e residui di glucosammina) è un costituente fondamentale della matrice cartilaginea e delle epifisi ossee. Mutazioni in questi due geni portano ad un ridotto contenuto di HS e ad una difettiva polimerizzazione della catena. Tutto ciò si traduce in unalterata espressione del signalling che regola lossificazione endocondrale. Leparansolfato è coinvolto in diverse funzioni: attivazione di fattori di crescita; signalling recettoriale, proliferazione e differenziazione cellulare.

14 ALTERAZIONI DEI GENI EXT1 ed EXT2 ESOSTOSI MULTIPLE EREDITARIE (HME) Forme sporadiche di: OSTEOCONDROMA ESOSTOSI ISOLATE NON FAMILIARI Double somatic inactivation Germline+Somatic inactivation

15 TECNICHE GENETICHE DI STUDIO ESTRAZIONE DNA AMPLIFICAZIONE IN VITRO (PCR) DELLE REGIONI CODIFICANTI DEI GENI EXT1 ED EXT2. SSCP DHPLC FISH SEQUENZIAMENTO MLPA

16 ANALISI MOLECOLARE DEL GENE VHL Processo di analisi molecolare

17 Elettoferogrammi relativi alla identificazione della mutazione S220N riscontrata nellesone 1 del gene EXT1 allo stato eterozigote in un paziente con esostosi multiple a livello dellarticolazione del ginocchio. Nella parte superiore è illustata la sequenza wild-type mentre nella parte inferiore la sequenza mutata. Elettoferogrammi relativi alla identificazione della mutazione R340S riscontrata nellesone 2 del gene EXT1 allo stato eterozigote in un paziente con esostosi multiple a livello del radio e ulna. Nella parte superiore è illustata la sequenza wild-type mentre nella parte inferiore la sequenza mutata.

18 c.1244_1247delATTT Q406X L562P W184Y c.362_363delTC Sequenze pz esostosi

19 frameshift mutationEXT11c. 678 del. C frameshift mutationEXT11c. 1146_ 1153 del. CAGTTGTC frameshift mutationEXT110c. 1940_1967del.28 ins CC frameshift mutationEXT11c.1163_1164 del.AG missense mutationEXT11S220N frameshift mutationEXT11c.362 del. TC missense mutationEXT11W184Y nonsense mutationEXT11Y117X frameshift mutationEXT12c.968_974 del.7 missense mutationEXT26C339Y nonsense mutationEXT14Q406X missense mutationEXT26C339T missense mutationEXT12R340C frameshift mutationEXT11c.369_370 del. AG missense mutationEXT12R340S frameshift mutationEXT11c.546 del. C frameshift mutationEXT14c.1244_1247del ATTT frameshift mutationEXT25C.913 del.G nonsense mutationEXT110Y629X missense mutationEXT18L562P nonsense mutationEXT111Q700X TIPO DI MUTAZIONEGENE ESONE MUTAZIONE

20 RISULTATI DELLO STUDIO GENETICO SULLE HME (SAN GIOVANNI ROTONDO) Famiglie studiate: 30 Mutazioni identificate: 21 (70%) 17 Mutazioni in EXT1 + 4 Mutazioni in EXT2 12 mutazioni già conosciute 9 mutazioni nuove 67% mutazioni frameshift o nonsense 33% mutazioni missense Tecniche utilizzate: PCR e Sequenziamento DNA

21 I:1 I:2 II:1 III:1 II:1 I:1 II:2II:3II:4 I:2 III:2 Caso clinico di esostosi multiple in una famiglia in cui viene ereditata la mutazione L562P comparsa in forma de novo nellesone 8 del gene EXT1 Caso clinico di Esostosi Multiple in una famiglia in cui è possibile osservare la segregazione della mutazione C339T in maniera autosomica dominante in tre generazioni successive.

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24 METODICA MPLA PER ANALISI DELEZIONI GENI EXT! ED EXT" ; METODICA MLPA PER RILEVARE DELEZIONI GENI EXT1 ed EXT2

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26 Nuovo protocollo di DHPLC

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31 DATI EPIDEMIOLOGICI-GENETICI DELLE HME Mutazioni del gene EXT1 sono più frequenti nei pazienti europei o nord-Americani di origine Caucasica, mentre pazienti cinesi o di origine orientale presentano mutazioni più frequenti in EXT2. Pazienti con mutazioni del gene EXT1 tendono ad essere colpiti più severamente rispetto a pazienti con mutazioni in EXT2 (altezza, numero di esostosi e ridotta mobilità). La possibilità di trasformazione maligna dellesostosi (sarcoma) sembra essere più alta nelle famiglie con mutazioni in EXT1 rispetto a quelle con mutazioni in EXT2. Pazienti con mutazioni in EXT2 presentano un fenotipo clinico moderato.

32 CONSULENZA GENETICA I La diagnosi di HME è basata su dati clinici e/o radiografici che evidenziano esostosi multiple in uno o più membri della famiglia. Nei bambini e negli adulti affetti è previsto un protocollo clinico annuale di sorveglianza dei siti assiali delle esostosi. Negli individui adulti è importante il monitoraggio delle dimensioni delle esostosi ed i vari segni di sofferenza articolare o di mobilità ossea. Questo aspetto è da tenere in particolare considerazione per il rischio del 0,5-5 % di sviluppare osteocondrosarcomi.

33 CONSULENZA GENETICA II. Lanalisi molecolare dei geni EXT1 ed EXT2 è possibile nei casi di HME dignosticata a livello clinico o radiografico. Lattendibilità del test genetico dipende dalle metodiche utilizzate. (SSCP, DHPLC, Sequenziamento, MLPA, FISH ) Un individuo affetto ha una probabilità del 50% di trasmettere la malattia alla discendenza. Sono descritti casi di HME insorti de novo. La diagnosi prenatale è possibile solo nel caso di mutazione nota nella famiglia e va discussa dal punto di vista etico con il genetista.

34 DIAGNOSI PRENATALE VILLOCENTESI (11 a settimana di gestazione) AMNIOCENTESI (16 a -18 a settimana di gestazione)

35 DIAGNOSI DIFFERENZIALE CON ALTRE CONDIZIONI CLINICHE METACONDROMATOSI. Malattia autosomica dominante. Le eostosi colpiscono le articolazioni e frequentemente regrediscono spontaneamente. Esse non provocano riduzione delle ossa lunghe o produzione di materiale osseo, deformità alle articolazioni o sublussazione come nelle HME. SINDROME DI LANGER-GIEDION. Sindrome da geni contigui: EXT1 e TRPS1 ( s.tricorinofalangeale). Individui affetti presentano esostosi, ritardo mentale, anomalie craniofacciali e digitali. SINDROME DI POTOCKI-SHAFFER. Sindrome da geni contigui: EXT2 e ALX4. Pazienti affetti hanno esostosi, un difetto di ossificazione delle ossa del cranio, disostosi craniofacciali e ritardo mentale.

36 PROSPETTIVE FUTURE Identificazione del terzo gene malattia nelle famiglie senza mutazioni nei geni EXT1 ed EXT2 (20 % dei casi familiari non risolti). Studio funzionale di mutazioni nei geni EXT1 ed EXT2 per comprendere i meccanismi molecolari alla base del difetto. Migliore comprensione dei processi della crescita ossea: differenziazione prematura dei condrociti che porta alla formazione delle esostosi. Sviluppo di modelli animali al fine di studiare le possibili correlazioni genotipo-fenotipo.

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40 GRAZIE PER LATTENZIONE


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