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ONCOGENI. I prodotti degli oncogeni possono essere classificati in sei gruppi: 1.Fattori di trascrizione 2.Rimodellatori della cromatina 3.Fattori di.

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1 ONCOGENI

2 I prodotti degli oncogeni possono essere classificati in sei gruppi: 1.Fattori di trascrizione 2.Rimodellatori della cromatina 3.Fattori di crescita 4.Recettori dei fattori di crescita 5.Trasduttri del segnale 6.Regolatori dell’apoptosi nabissi 14

3 FATTORI DI TRASCRIZIONE I fattori di trascrizione (TF) sono spesso membri di una famiglia multigenica che mostra dei domini strutturali comuni e molti di questi fattori per funzionare richiedono l’interazione con altre proteine. Il TF regolano positivamente o negativamente l’espressione di determinati geni, legandosi a specifiche sequenze di DNA (promoter, enhancer, silencer). Esempi di TF, codificati anche da retrovirus sono c-myc, fos e jun. nabissi 14

4 c-myc Il gene myc è conservato in tutte le specie animali e fu inizialmente scoperto in diversi retrovirus responsabili nell’induzione di sarcomi, carcinomi e leucemie mieloidi. La proteina codificata da myc è un fattore trascrizionale (p64 myc ) presente nelle cellule in attiva proliferazione anche se myc svolge un ruolo importante anche nell’indurre l’apoptosi. Myc è classificato tra i gene della pronta risposta insieme a fos e jun, indotti da fattori di crescita mitogenici, con il ruolo di indurre la progressione dalla fase G0-G1 alla fase S del ciclo cellulare. nabissi 14

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6 Myc e ciclo cellulare: cicline D, E e A geni che codificano per le CDK2 e CDK4 gene dell’enzima ornitina-decarbossilasi (ODC), essenziale nel metabolismo degli acidi nucleici reprime i geni delle CDKI (inibitori delle CDK) attiva i geni che codificano per E2F reprime il gene dell’inibitore delle CDK (p27 KIP1 ). nabissi 14

7 I LIVELLI ECCESSIVI DI MYC POSSONO INDURRE LA CELLULA AD ATTIVARE IL PROCESSO DI APOPTOSI. nabissi 14

8 fos e jun Il fattore di trascrizione fos (p55) dimerizza con il fattore di trascrizione jun (p39) per formare il fattore di trascrizione AP-1, il quale aumenta l’espressione di diversi geni che controllano la divisione cellulare. L’attività di AP-1 è indotta da fattori di crescita, citochine, ormoni polipetidici, neurotrasmettitori, interazione cellula-matrice, infezioni virali e batteriche e da diversi stress fisici e chimici. nabissi 14

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10 AP-1 è un dimero composto da proteine della famiglia Jun (c-jun, JunB, JunD), Fos (c-Fos, FosB, Fra-1, Fra-2). Riconosce sequenze del DNA TGAG/CTCA o CRE (TGACGTCA) nabissi 14

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12 Stimoli attivano la cascata delle MAPK (mitogen activated protein kinase) che inducono l’attività di AP-1 attraverso la fosforilazione delle chinasi ERK (extracellular-signal-regulated kinase), le quali traslocano nel nucleo e fosforilano fattori di trascrizione che attivano fos che si lega al fattore jun, formando AP-1. AP-1 attivazione trascrizionale nabissi 14 AP-1

13 FATTORI DI CRESCITA I fattori di crescita (GF) sono proteine di piccole dimensioni che stimolano la proliferazione, il differenziamento, la sopravvivenza e la motilità cellulare. La maggior parte dei GF hanno effetto positivo su questi fenomeni, anche se alcuni come il TGF-  (trasforming growth factor beta) agiscono come segnale inibitorio. Nell’ambito delle patologie tumorali molti geni che codifica per GF, si comportano da oncogeni, in quanto subiscono mutazioni tali da indurre la cellula ad una sovra-produzione del GF con conseguente attivazione di uno stimolo proliferativo autocrino o paracrino. nabissi 14

14 Attivazione della trascrizione di geni bersaglio che inducono proliferazione cellulare e disassociazione delle E-caderine con conseguente perdita dei legami cellula/cellula e stimolo della mobilità cellulare. WNT SIGNALING

15 Insulin Growth Factor (IGF) Fra i vari fattori di crescita che giocano un ruolo determinante nei vari processi che inducono proliferazione cellulare, sopravvivenza cellulare e resistenza ai chemioterapici e radioterapia c’è il sistema IGF (insulin growth factor). Il sistema IGF consiste di due ligandi, IGF-I e IGF-II, tre recettori di membrana (IGF-IR, IGF- IIR) e recettore dell’insulina (IR) e sei proteine di legame ad alta affinità (IGFBP 1- 6). I recettori IGF-IR una volta tradotti vengono glicosilati, dimerizzano e processati in due subunità  e  che attraverso ponti disolfuro vanno a formare il tetramero funzionante (  ) che viene trasportato in membrana. Attraverso la subunità  che è extracellulare si ha il legame del IGF, con conseguente trasduzione del segnale a livello intracellulare che consiste nella fosforilazione di residui di tirosina in domini di tirosin chinasi. nabissi 14

16 La cascata di attivazione comporta, principalmente, tre tipi si segnali: 1.attivazione del pathways del fosfatidilinositolo 3- chinasi (PI-3K), Akt, mTOR che attiva la sintesi proteica e i meccanismi antiapoptotici mediante inattivazione (fosforilazione) di Bad 2.attivazione del pathway di Ras/Raf1/MEK/ERK che induce proliferazione cellulare 3.attivazione di altri meccanismi cellulari che inducono l’espressione di fattori di crescita, citochine e integrine nabissi 14

17 Inoltre il IGF-IR svolge un ruolo nel facilitare : 1.il passaggio dalle fase G0 a G1 mediante attivazione della p70 S6K, che fosforila la proteina ribosomiale S6 che stimola l’insieme di proteine ribosomiali necessarie a entrare nel ciclo cellulare. 2.Inoltre promuove anche il passaggio dalla fase G1 a S mediante l’induzione dell’espressione della ciclina D1 e della CDK4, comportando fosforilazione del fattore Rb. nabissi 14

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19 RECETTORI PER I FATTORI DI CRESCITA L’eccessiva stimolazione della proliferazione cellulare, nei tumori, dipende anche dall’amplificazione o dalle mutazioni dei geni codificanti per i recettori dei fattori di crescita, con conseguente aumento dell’espressione dei recettori o la sintesi di recettori strutturalmente e funzionalmente modificati, con conseguente alterazione del segnale e guadagno di funzione. Tali recettori possono essere suddivisi in base ai residui presenti nella regione citoplasmatica in: tirosinchinasici e serin/treoninchinasici Nell’ambito dei tumori, i recettori tirosinchinasici (RTK) sono quelli maggiormente mutati nei tumori e sono tra i geni codificati dagli oncogeni virali. nabissi 14

20 I RTK si possono suddividere in: tirosinchinasi citoplasmatiche recettori con attività tirosinchinasica I RTK sono suddivisi in diverse famiglie che si caratterizzano principalmente per la porzione aminoacidica extracellulare in: porzione ricca di cisteine come EGFR, IR, IGFR domini simili a quelli delle Ig (Ig like motif), come PDGFR e FGFR domini con sequenze di fibronectina combinate a sequenze Ig-like, come efrinaAR, efrinaBR, angiotensina.1R domini che reagiscono con le caderine in presenza di Ca 2+ nabissi 14

21 Attivazione dei recettori RTK: Il sito catalitico, in posizione C-terminale ha attività proteinchinasica, ed è costituito da tre regioni: 1) legante ATP, 2) attività fosfotransferasica, 3) contenente una proteinchinasi attivata da fosforilazione dopo legame del ligando al recettore. Gli RTK sono presenti in stato inattivo come monomeri e dimerizzano dopo interazione con il ligando. La dimerizzazione induce un cambiamento conformazionale che attiva il sito catalitico con attività tirosinchinasica, che induce fosforilazione nei siti catalitici che in altri residui. nabissi 14

22 Il primo segnale dell’attivazione del recettore, mediata dal ligando, e’ la fosforilazione nel dominio citoplasmatico del recettore stesso, mediata dalla dimerizzazione del recettore. nabissi 14 receptor-directed protein-tyrosine phosphatases (PTPs)

23 L’autofosforilazione dei recettori genera siti di fosforilazione i quali diventano siti recettivi per proteine SH2 che includono fosfolipasi C o GRB (growth factor receptor bound). I domini SH3 agiscono poi come domini di legame per domini ricchi in prolina presenti in molecole effettrici che agiscono come percorsi molecolari a valle. Il legame ligando-recettore recluta proteine adattatrici contenenti SH2 domain nabissi 14

24 Trasduzione del segnale La posizione specifica delle tirosine presenti nei RTK è quella che rende che condiziona le interazioni con specifiche proteine citoplasmatiche da fosforilare. In particolare i domini SH2 presenti su specifiche proteine (proteine con attività enzimatica) vengono fosforilate dai TRK o mediante proteine adattatrici che facilitano il contatto con le proteine che sono substrato delle proteinchinasi. I residui carichi positivamente, presenti nelle regioni SH2 reagiscono con i gruppi fosfato (carichi negativamente) presenti sulle TK e permettono la formazione di un complesso che attiva la proteina contenente il dominio SH2. Altri domini proteici che interagiscono con le tirosine fosforilate sono i SH3 e PTB (phosphotyrosin binding). nabissi 14

25 RAS è un oncogene coinvolto nella proliferazione cellulare ed è composto da tre membri (H, K, N)-RAS. Sono proteine legate nel lato citoplasmatico della cellula ed il loro ruolo è quello di legate, nello stato inattivo GDP. Mutazioni puntiformi del gene Ras sono l’anomalia singola piu’comune di oncogeni trasmesse come carattere autosomico dominante. RAS nabissi 14

26 Queste proteine sono attivate dai RTK e passano continuamente da una forma inattiva legante il GDP ad una forma attiva legante il GTP. Le proteine ras sono state scoperte nei virus oncogeni : K-ras-A, K-ras.B : sarcoma murino, il proto oncogene umano nel cromosoma 12 H-ras: sarcoma murino, il proto oncogene umano nel cromosoma 11 N-ras: neuroblastoma e carcinomi umani, presente nel cromosoma 1 Il prodotto di questi geni distinti è molto simile e viene denominato p21 ras nabissi 14

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28 Mutazioni nei geni ras hanno come conseguenza quella di ridurre l’attività GTPasica, con conseguente mantenimento del GTP e quindi prodotto attivo o mutazioni che facilitano il distacco del GDP e conseguentemente ras attivo. Il risultato finale è che ras rimane piu’ a lungo o costitutivamente attivo, stimolando la proliferazione cellulare delle cellule tumorali. nabissi 14

29 MUTAZIONE DI KRAS Inactive KRAS active KRAS Inactive KRAS GDP GTP GDP GAP Downstream signal transduction cascade + Mutant KRAS active + GTP GAP nabissi 14

30 mutazioni attivanti RAS mutationi RAS si riscontrano nel 30% dei tumori HRAS1 KRAS2 NRAS Ras-mut = GAP- refractory GTPase Un’alta incidenza di mutazioni di K-RAS si riscontrano nei tumori al pancreas (70 –100%) R-RAS nabissi 14

31 Meccanismo di trasduzione di ras Nel citoplasma delle cellule è presente una proteina denominato GRB-2 con domini SH2/3 che gli permettono di formare un complesso con una proteina denominata SOS (che è un fattore di scambio di nucleotidi guanidilici). Quando la cellula riceve un segnale da un fattore di crescita che lega RTK, il complesso GRB-2 SOS interagisce mediante i domini SH2/3 o PTB (phosphotyrosin binding) ai residui fosforilati del RTK. Questo contatto permette il reclutamento da parte di SOS della proteina ras (che lega il GDP), questo permette lo scambio con il GTP e ras si attiva. nabissi 14

32 Questa attivazione comporta la fosforilazione della serina/treonina chinasi raf-1 che a sua volta fosforila una MAPKK (MEK) (Mitogen Activated Protein Kinase Kinase) che a sua volta fosforila una MAPK (ERK1/2) che trasloca nel nucleo, fosforila fattori di trascrizione, come c- fos, myc e attiva la proteina ribosomiale S6, che attivano la trascrizione di geni coinvolti nell’indurre la proliferazione cellulare o contribuiscono alla crescita cellulare. Quando ras lega il GTP assume un cambiamento conformazionale che comporta anche il reclutamento delle GTP-asi activating protein (GAPs) come la p120 GAP e la neurofibromina1 (NF1) che riportano ras nella forma legante il GDP. nabissi 14 NF-1

33 nabissi 14

34 PI3-K pathways nabissi 14

35 I pathways RAS, PI(3)K e mTOR formano una rete biochimica intersecata che, quando mutata, guida la crescita cellulare in maniera indipendente dall’ambiente circostante. Questi pathways guidano la tumorigenesi attraverso la fosforilazione coordinata di proteine che attivano la progressione del ciclo cellulare, la regolazione della sintesi di proteine e di fattori trascrizionali che regolano l’espressione di geni coinvolti in questi processi. nabissi 14

36 Il pathway PI(3)-chinasi. PI(3)K è attivato sia da RAS che da RTK e di seguito attiva diversi pathways a valle attraverso la generazione del secondo messaggero lipidico fosfatidil-inositol-3,4,5-trifosfato (PtdIns(3,4,5)P3. In particolare la famiglia di chinasi serina-treonina AKT è considerata come il principale bersaglio di PI(3)K nei tumori. Esistono tre classi di PI(3)Ks, ma sembra che solo il sottogruppo IA-PI(3)K sia coinvolto nei tumori. IA-PI(3)K sono eterodimeri composti da una famiglia di subunità regolatorie (p85) e di subunità catalitiche (p110). nabissi 14

37 Sono capaci di fosforilate l’anello inositolico del lipide di membrana fosfatidil- inositolo 4,5 bifosfato per generare il secondo messaggero PtdIns(3, 4, 5)P3. Inoltre le subunità p85 contengono dei domini che legano specifici residui nella regione citoplasmatica dei RTKs, questo legame permette di generare un pool locale di PtdIns(3, 4, 5)P3. Le subunità p110 possono legarsi direttamente ed attivare RAS. Una delle famiglie maggiormente attivate da PtdIns(3, 4, 5)P3 sono le serine/treonine chinasi AKT. AKT controlla il ciclo cellulare, la sopravvivenza e la crescita cellulare attraverso la fosforilazione di diversi substrati. nabissi 14

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41 Regolazione del pathway PI3K

42 Per i tumori con lesioni genetiche definite, l’abilità di superare un dato bersaglio terapeutico è data dalla capacità di acquisire altre mutazioni che superano l’effetto del farmaco o effettori biochimici del pathway mutato o di up-regolare il pathway disregolato. a) l’attivazione del fattore IF4E e HIF, inizialmente determinato dal pathway Ras/Akt e bloccata con Rapamicina risulta inefficiente causa attivazione di pathways alternativi. nabissi 14

43 b) In tumori con lesioni iniziali in PI(3)K o altri regolatori di mTOR non hanno vie alternative per attivare IF4E and HIF. Questi tumori rispondono a Rapamicina nabissi 14

44 c) In tumori che esprimono EGFR e ERBB3 inibitori dell’eterodimero bloccano la via delle IP3K. d) Nei tumori dove ERBB3 non è espresso la via IP3K è regolata da altre vie e gli inibitori non funzionano nabissi 14

45 PTEN è una fosfatasi che lega e distrugge PIP3 convertendolo in PI(4,5)P 2 o PI(3,4)P 2 nabissi 14

46 mutazioni PTEN Prostatic carcinomas – PTEN mutato negli stadi avanzati. Le cellule PTEN-negative cells diventano andrigeni resistenti E tendono a metastiizzare carcinoma mammario: inattivato 15-30% GLIOMA: mutazioni di PTEN sono indice di aggressività Carcinoma follicolare della tiroide (25%), nabissi 14

47 EGF RECEPTOR nabissi 14

48 EGF-R EGF-R ha un ruolo importante nell’ambito di diverse patologie tumorali in quanto la sua attivazione costitutiva lo rende responsabile dell’attivazione di meccanismi di proliferazione cellulare. L’omologo del protoncogene EGF-R è stato scoperto nel virus dell’eritroblastosi aviaria e denominato v-erb. L’analisi della sequenza aminoacidica di v-erb ha dimostrato che questo oncogene virale codifica per una proteina (gp65) che è simile ad una parte del EGFR, quindi è un recettore troncato della porzione extracellulare responsabile del legame a EGF, ma contenente la porzione citoplasmatica con attività tirosinchinasica che è costitutivamente attiva. I pathways principalmente attivati dall’attivazione di EGF-R sono quello di Ras/MAPchinasi e PI3 chinasi/AKT, che agiscono entrambi nella mitogenesi e sopravvivenza cellulare. nabissi 14

49 ATTIVAZIONE DEI SEGNALI INTRACELLULARI EGFR-DIPENDENTI 1)Legame del ligando specifico nella porzione extracellulare del EGFR 2)Formazione dell’omodimero o eterodimero che causa la fosforilazione ATP-dipendente di specifici residui di tirosina nel dominio intracellulare di EGFR 3)Attivazione dei pathways intracellulari: 1)Ras-Raf-MEK-MAPK che controllano la progressione della fase G1/S 2)PI3K-Akt che attiva una cascata antiapoptotica e di sopravvivenza nabissi 14

50 EGFR è un recettore appartenente ad una famiglia di quattro recettori. nabissi 14

51 Tre diverse strategie terapeutiche per interagire con tale sistema e inibire la trasduzione dei segnali proliferativi : Uso di anticorpi monoclonali antirecettore che si legano alla porzione extracellulare della molecola recettoriale e impediscono il legame con il ligando Uso di farmaci inibitori selettivi della tirosinchinasi associata al recettore Uso di farmaci che agiscono sulle fasi piu’ avanzata della cascata della trasduzione del segnale come i farmaci che interagiscono con le proteine della famiglia RAS (inibitori della farnesiltrasferasi) nabissi 14

52 Meccanismo d’azione dei farmaci Anti-EGFR Le conseguenze sono: - Arresto delle cellule in fase G1 con incremento di p27 (inibizione delle CDK) -Inibizione dell’angiogenesi tramite il blocco della sintesi di TGFa, VEGF, IL-8, FGF. -inibizione dell’invasività e delle metastasi nabissi 14

53 Meccanismo dei Anti-EGFR Monoclonal Antibodies. L’anti-EGFR cetuximab, che è una immunoglobulina IgG1 induce immunorisposta anticorpo dipendente, citotossicità cellulo-mediata (Panello A). Inoltre gli anticorpi anti-EGFR inducono internalizzazione del recettore e down-regolazione incrementando la sua degradazione (Panello B). nabissi 14

54 Nella FISH il centromero del cromosoma 17 e' marcato con un segnale fluorescente verde e il gene HER-2 con un segnale fluorescente arancio. In breve si contano circa 60 nuclei cellulari e in ognuno di essi si fa il rapporto tra segnale verde e segnale arancio.Il tumore e'definito "positivo" per l'amplificazione genica quando il rapporto gene/cromosoma e'>2 nabissi 14

55 Tipo di Neoplasia% espressione EGFR Vescica31-48% Mammella14-91% Utero90% Colon25-77% Esofago43-88% Stomaco4-33% Glioma40-63% Testa-collo80-100% Ovaio35-70% Pancreas30-89% Prostata40-85% Rene50-90% Polmone40-80% Percentuali di tumori EGFR+ nabissi 14


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