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COME RICONOSCERE UNA SEQUENZA REGOLATORIA DI CIRCA 10 NUCLEOTIDI FRA I 3000000000 CHE COMPONGONO IL GENOMA UMANO?

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Presentazione sul tema: "COME RICONOSCERE UNA SEQUENZA REGOLATORIA DI CIRCA 10 NUCLEOTIDI FRA I 3000000000 CHE COMPONGONO IL GENOMA UMANO?"— Transcript della presentazione:

1 COME RICONOSCERE UNA SEQUENZA REGOLATORIA DI CIRCA 10 NUCLEOTIDI FRA I CHE COMPONGONO IL GENOMA UMANO?

2 LE RNA POLIMERASI COME RICONOSCONO I PROMOTORI? Transcribed region Promotore -contiene sequenze Specifiche per il legame della polimerasi

3 FATTORI DI TRASCRIZIONE FATTORI DI TRASCRIZIONE GENERALI (BASALI) - RICONOSCONO ELEMENTI “core promoter” REGOLATORI SPECIFICI - ATTIVATORI - REPRESSORI Transcribed region ELEMENTO ENHANCER ELEMENTO DEL PROMOTORE PROSSIMALE Basal factor binding sites

4 Il legame promotore RNA polimerasi richiede i fattori di trascrizione generali

5 Promotori ~200 bp gene

6 Reporter gene COME IDENTIFICARE ELEMENTI NEL PROMOTORE eg CAT, luciferase ATTIVITA’ 100% Reporter gene 100% Reporter gene 20% Reporter gene 1% Reporter gene 0%

7 Reporter gene eg CAT, luciferase ATTIVITA’ 100% Reporter gene 100% Reporter gene 400% Reporter gene 1% Reporter gene 0% COME IDENTIFICARE ELEMENTI NEL PROMOTORE

8 Livello di trascrizione basale attivato represso

9 Transcribed region Elementi del Core promoter siti di legame per I fattori di trascrizione generali Che supportano un livello di trascrizione basale La regolazione della trascrizione e’ ottenuta dalla Azione di fattori di trascrizione gene-specifici

10 ~24bp TATABRE InrDPE TATA-box 8 bp elemento ricco in AT BRE 6 bp elemento ricco in purine Bound by TFIID Bound by TFIIB InrDPE Bound by TFIID RNAP II

11 TFIIA TFIIE TFIIF TFIIH RNAP II TFIIB TFIID 2-3 subunits 2 subunits 1 subunit 10 subunits 2 subunits 12 subunits 9 subunits ~40 polipeptidi

12 ~24bp TATABRE InrDPE TATA-box 8 bp AT BRE 6 bp lega TFIID lega TFIIB InrDPE lega TFIID RNAP II

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16 ~24bp TATABRE InrDPE TFIIH TFIID TFIIA TFIIB TFIIF RNAP II TFIIE

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18 TFIID contiene la TATA-Box Binding Protein TBP TFIID

19 TFIID e’ composta da vari TBP Associated Factors —TAFs -aiutano il posizionamento di TFIID riconoscendo L’elemento Inr -legano i fattori di trascrizione gene specifici -aiutano a decompattare la cromatina

20 ~24bp TATABRE InrDPE TFIID

21 ~24bp TATABRE InrDPE TFIID TFIIA -aumenta e stabilizza il legame di TBP al DNA -interagisce con vari attivatori gene specifici Aiutandoli a legarsi ai vari TAF TFIIA

22 ~24bp TATABRE InrDPE TFIID TFIIA TFIIB -si lega a TBP e richiama la polimerasi -Partecipa alla selezione del sito d’inizio e Stabilisce la direzione

23 ~24bp TATABRE InrDPE TFIID TFIIA TFIIB TFIIF RNAP II TFIIF Stabilizza il complesso di preinizio e induce Una torsione nel DNA

24 ~24bp TATABRE InrDPE TFIID TFIIA TFIIB TFIIF RNAP II TFIIE Attira una elicasi ed insieme srotolano il Promotore. Stimola l’attivita’ chinasica di TFIIH

25 ~24bp TATABRE InrDPE TFIIH TFIID TFIIA TFIIB TFIIF RNAP II TFIIE TFIIH Fosforila una delle subunita’ della polimerasi dando l’avvio alla trascrizione

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27 — REGOLATORI GENE SPECIFICI Transcribed region SI LEGANO A SEQUENZE REGOLATORIE

28 Regolatori gene specifici hanno una struttura modulare contengono un dominio che lega il DNA contengono uno o piu’ domini di attivazione trascrizionale qualche volta contengono uno o piu’ domini di repressione qualche volta contengono un dominio di dimerizzazione

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33 (MADS box)

34 N H H OC Donatore Accettore

35 A D A M A A D M A D A D A A A A A D A

36 Transcribed region Regolatori gene specifici 1)Contengono un dominio che lega il DNA 2)E un dominio di attivazione trascrizionale

37 Gli Attivatori come influenzano la trascrizione di un gene distante molte migliaia di nucleotidi? DNA loop

38 Enhancers- stimolano la trascrizione 1.Attivatori si legano ad un sito specifico 2.Il DNA si ripiega

39 Enhancers- stimolano la trascrizione Attivatori si legano ad un sito specifico Il DNA si ripiega Si forma il complesso nel promotore

40 Enhancers- stimolano la trascrizione Attivatori si legano ad un sito specifico Il DNA si ripiega Si forma il complesso nel promotore Si lega la RNA polimerasi Inizio della trascrizione

41 Controllo combinatoriale dell’espressione genica

42 Con poche proteine regolatorie si possono controllare un elevato numero di geni Diverse combinazioni producono fenotipi differenti

43 Heterodimerization of DNA binding proteins can alter their sequence specificity

44 Enhancer e Repressori gene promotore enhancer repressore 10-50,000 bp repressore previene il legame dell’enhancer RNAP enhancer interagiscono con RNAP trascrizione

45 Con poche proteine regolatorie si possono controllare un elevato numero di geni Diverse combinazioni producono fenotipi differenti

46 Recettori nucleari Fattori di trascrizione regolati da molecole idrofobiche Cambio dell’attivita’ Cambio della localizzazione cellulare

47 Recettori nucleari RGRACANNNTGTYCY TBP TAF RNA pol II Il legame del ligando causa cambiamenti conformazionali

48 Nuclear Receptors GR hsp90 GR Legame dell’ormone Dissociazione da hsp90 dimerizzazione GR Migrazione nel nucleo GR Legame al DNA TATA

49 Regolazione mediante fosforilazione Ormoni attivano una chinasi La chinasi fosforila un fattore di trascrizione Il fattore e’ attivato

50 Cascata delle chinasi GF si lega al recettore - protein tyrosine kinase Il recettore dimerizza Il complesso fosforila MEKK – (MAP kinase kinase kinase) MEKK fosforila SEK – una MAP kinase kinase SEK fosforila JNK – una MAP kinase MEKK P P SEK P JNK P

51 Cascata delle chinasi JNK attivata migra nel nucleo e fosforila il fattore di trascrizione C-JUN C-JUN dimerizza with C-FOS per formare AP-1 AP-1 attiva la trascrizione legandosi a – TGA(C/G)TCA- e interagendo con I fattori di trascrizione generali JNK P nucleo C-JUN TRE C-JUN P RNA pol II C-FOS P

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53 Metilazione del DNA La citosina puo’ essere metilata: La metilazione del DNA e’ coinvolta nell’inattivazione del cromosoma X Risulta in una maggiore condensazione della cromatina

54 Trascrizione e struttura della cromatina Il DNA nella cromatina condensata non e’ accessibile La cromatina condensata (eterocromatina) e’ trascrizionalmente silente La condensazione della cromatina dipende ANCHE dalla acetilazione degli istoni

55 Acetilazione degli Istoni E’ una modificazione post-traduzionale Gruppi acetilici (CH 3 COO – ) legati covalentemente a aminoacidi basici Neutralizzano le cariche positive Eliminano le interazioni ioniche con il DNA Diminuiscono la condensazione Associati con una attiva trascrizione

56 –Acetilazione/Deacetilazione

57 Attivatori: acetilazione degli Istoni Alcuni attivatori attirano delle acetilasi Il macchinario di trascrizione puo’ accedere al DNA meno condensato

58 Alcune Istone Acetilasi (HAT) p300/CBP TAF II 250 Ambedue sono dei co-attivatori SAGA e’ a ponte tra un Fattore di Trascrizione e la TBP

59 Repressori: deacetilazione degli Istoni Alcuni repressori attirano delle deacetilasi Prevengono l’accesso del macchinario di trascrizione al DNA

60 –Acetilazione/Deacetilazione

61 SWI/SNF in Lievito SWI/SNF sono regolatori positivi del gene HO (accoppiamento) e del gene SUC2 (utilizzo del saccarosio). Queste proteine catalizzano il rimodellamento ATP-dipendente del DNA

62 Macchinari di Rimodellamento Tutti contengono subunita’ simili a swi- 2/snf NTP-binding proteins

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65 himica/deposito/ Lez8-10.ppt Lez15-10.ppt Lez22-10.ppt Lez29-10.ppt (ancora da aggiungere)

66 Regolazione dell’Espressione Genica Puo’ essere regolata in una delle seguenti sei fasi: DNA RNA transcript mRNA inactive mRNA protein inactive protein NUCLEUSCYTOSOL trascrizioneMaturazionetrasporto traduzione degradazione controllo dell’attivita’

67 Controllo della Traduzione 1. Repressione - es. Iron Response Element della ferritina 2. Stabilizzazione- es. IRE del recettore della transferrina Ferritina - Lega il Ferro e lo conserva Recettore della Transferrina (TFR)- trasporta il ferro nella cellula Se il Ferro e’ nella cellula - Si Ferritina, No TFR Se non c’e’ Ferro - Si TFR, No Ferritina Come viene regolato tutto questo?

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69 M Coding region AUG Fe m7Gm7G Iron Response Element IRE-BP (cytosolic aconitase) Fe M Ferritin mRNA Coding region AUG 1. Repressione :-Ferro, ferritina NO 2. Attivazione:+ Ferro, ferritina SI M

70 Coding region AUG m7Gm7G Iron Response Element IRE-BP (cytosolic aconitase) Fe M TFR mRNA Coding region AUG 1. Stabilizzazione:- Ferro, TFR SI 2. Degradazione:+ Ferro, TFR NO

71 Coding region AUG m7Gm7G Iron Response Element IRE-BP (cytosolic aconitase) TFR mRNA Coding region AUG 1. Stabilizzazione:- Ferro, TFR SI 2. Degradazione:+ Ferro, TFR NO Fe RNAse

72 Controllo dello Splicing: espressione di Fibronectine tessuto-specifiche Figure 11-24

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74 Lo Splicing puo’ produrre anticorpi solubili o legati alla membrana dallo stesso gene Lo splicing alternativo puo’ produrre due tipi di anticorpo diversi con la stessa specificita’ Quando attivati dall’antigene i linfociti B cominciano a produrre anticorpi solubili Le forme secrete mancano degli esoni 7 e 8 che codificano per domini idrofobici

75 Trasporto segnale-mediato attraverso il poro nucleare (NPC) Figure The nuclear pore complex

76 La proteina HIV Rev regola il trasporto dell’RNA virale non ancora maturo Figure 11-38

77 L’RNA Editing altera le sequenze dei pre- mRNA Figure 11-39

78 mRNA editing Nell’intestino La deaminasi e’ presente solo nell’intestino Nel fegato

79 GDP No Aminoacidi eIF2 Gcn2p kinase eIF2 eIF2B GTP No tRNA amino-acetilati P S51 Translation competent eIF2 GDP 


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