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Scopi della analisi molecolare Conferma della diagnosi clinica nei pazienti affetti Ricerca dei portatori sani Diagnosi prenatale.

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Presentazione sul tema: "Scopi della analisi molecolare Conferma della diagnosi clinica nei pazienti affetti Ricerca dei portatori sani Diagnosi prenatale."— Transcript della presentazione:

1 Scopi della analisi molecolare Conferma della diagnosi clinica nei pazienti affetti Ricerca dei portatori sani Diagnosi prenatale

2 Patologia Genetica Patologia Monogenica: – malattie dovute a mutazioni di un singolo gene Patologia Poligenica: – malattie dovute a mutazioni di più geni, generalmente con presenza di una componente ambientale Patologia Cromosomica: – malattie dovute ad alterazioni numeriche o strutturali del cariotipo

3 Il cariotipo: una sola analisi per diverse patologie

4 Analisi molecolare: una analisi specifica per una specifica patologia

5 Tutto inizia dal DNA Molecola depositaria del patrimonio genetico Trasporta l' informazione genetica necessaria alla trasmissione dei caratteri ereditari

6 Campioni da cui si può estrarre DNA Una goccia di sangue Saliva presente su una sigaretta o su un chewing-gum Tracce di sperma Urine e feci Un capello Fossili Mummie

7 Estrazione di DNA Varie metodiche per estrazione DNA Estrazione manuale: vari kit in commercio ( spin basket, biglie magnetiche) Estrattori automatici

8 Estrazione Dna da sangue mediante Kit commerciali  Campione di sangue in EDTA  Aliquotare 200μl di Binding Buffer  Aggiungere 40 μl di proteinasi K  Vortexare ed incubare per 10 min a 72° C in termoblocco  Spinnare  Aggiungere 100μl di isopropanolo  Assemblare il filtro High Pure con una provetta relativa  Pipettare il campione nel serbatoio superiore e centrifugare per 1 min  Successivi lavaggi con Inibitor Remaval e con Wash Buffer  Aggiungere 200μl di Elution Buffer  Centrifugare per 1 min e raccogliere il DNA

9 Reazione a catena della polimerasi (PCR) Mezzo rapido ed economico per ottenere grandi quantità (amplificazione) di una specifica sequenza di DNA o RNA Sfrutta la capacità della polimerasi di catalizzare la sintesi di acidi nucleici a partire da un filamento stampo

10 PCR: 3 Fasi Denaturazione : apertura doppia elica Annealing : attacco dei primers Extension : copiatura da parte della Taq polimerasi

11 Reazione di Polimerizzazione a Catena (PCR)

12 Reagenti necessari per la PCR DNA Primers Oligonucleotidi Taq polimerasi Baffer e Magnesio H2O Ciclo standard di PCR 94°C 10 m 1 ciclo 35 cicli 72°C 10 m 1 ciclo 94°C 30s 58°C 30s 72°C 30s

13 Preparazione di una PCR

14 Verifica prodotti di PCR mediante elettroforesi di acidi nucleici Migrazione di ioni o molecole sottoposte ad un campo elettrico applicato Permette di separare i frammenti amplificati mediante PCR

15 Elettroforesi su gel Si preparano i gel di agarosio che costituiscono una “matrice a setaccio” Ad un’estremità del gel vengono “caricati” i campioni da analizzare e viene applicato un campo elettrico La direzione di migrazione dipende dalla carica delle molecole: gli acidi nucleici, carichi negativamente, migreranno verso il polo positivo La velocità di migrazione dipende dalla dimensione del frammento di acido nucleico Si ottiene quindi la separazione dei frammenti di DNA o RNA esclusivamente sulla base delle loro dimensioni (peso molecolare)

16 Sequenziamento diretto del DNA Metodo accurato per ottenere informazioni precise e definitive su un gene Metodo ideale per la rilevazione di mutazioni difficilmente evidenziabili e di mutazioni puntiformi

17 Sequenza di DNA

18 Mutazione in eterozigosi

19 MUTAZIONE IN OMOZIGOSI

20 Analisi di frammenti Riconoscimento di paternità Identificazione di autori di reati Identificazione di vittime di reati o sinistri


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