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ENZIMI DI RESTRIZIONE. Reazione ligasica di frammenti di restrizione.

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Presentazione sul tema: "ENZIMI DI RESTRIZIONE. Reazione ligasica di frammenti di restrizione."— Transcript della presentazione:

1 ENZIMI DI RESTRIZIONE

2 Reazione ligasica di frammenti di restrizione

3 DNA RICOMBINANTE: DUE MOLECOLE DI DNA VENGONO UNITE IN PROVETTA SFRUTTANDO LE PROPRIETA’ DI ENDONUCLEASI DI RESTRIZIONE DI TIPO II E DELLA DNA LIGASI CLONAGGIO -IN BIOLOGIA CLONARE UN ORGANISMO SIGNIFICA OTTENERE UN INDIVIDUO UNA POPOLAZIONE DI ORGANISMI CHE SONO GENETICAMENTE IDENTICI -IN BIOLOGIA MOLECOLARE CLONARE UN TRATTO DI DNA SIGNIFICA OTTENERE UNA POPOLAZIONE DI DNA IDENTICHE ALLA MOLECOLA DI PARTENZA

4 Vettori e clonaggio Vettori Plasmidi Fagi Cosmidi YAC

5 Vettori e clonaggio Plasmide Molecola circolare di DNA a doppio filamento, normalmente presente nella cellula batterica, in grado di replicarsi autonomamente dal cromosoma.

6 VETTORI DI CLONAGGIO

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8 Bromo-chloro-indoyl-  -galactopyranosidase or X-Gal (Clear) Bromo-chloro-indoyl (Deep blue insoluble) + galactose  -galactosidase

9 Bacteria from ligation plated on ampicillin and X-Gal Contains wild type plasmd Contains recombinant plasmd

10 Vettori e clonaggio Lunghezza massima del DNA clonabile in un plasmide: circa 20 Kb

11 Vettori e clonaggio I virus sono piccoli parassiti non in grado di replicarsi. Dopo aver infettato una cellula-ospite utilizzano i suoi sistemi di replicazione e sintesi delle proteine per riprodursi

12 Vettori e clonaggio I batteriofagi (o fagi) sono virus che infettano i batteri.

13 Vettori e clonaggio Il fago più utilizzato in biologia molecolare è il fago

14 Vettori e clonaggio Assemblaggio di un fago

15 Vettori e clonaggio Mappa del genoma del fago

16 Vettori e clonaggio Clonaggio di frammenti di DNA nel fago

17 Vettori e clonaggio Formazione di cloni fagici

18 Vettori e clonaggio L’infezione dei batteri con il fago è circa 10 3 volte più efficiente della trasformazione con un plasmide

19 Vettori e clonaggio Lunghezza del DNA clonabile in un fago: Kb

20 Vettori e clonaggio Un cosmide è un plasmide contenente la sequenza COS dal fago

21 Vettori e clonaggio

22 Clonaggio di frammenti di DNA in un cosmide

23 Vettori e clonaggio Lunghezza del DNA clonabile in un cosmide: circa 45 Kb

24 EcoR I Genomic Library Infect cells

25 AAAAAA cDNA synthesis Infect cells cDNA library

26 Preparing the insert –Partial digestion preferred Genomic Library Construction

27 Genomic librarycDNA library Genomic DNAmRNA Source Species or strains Tissues Developmental stages Variation 12k -- 20k0.2k -- 6k Insert size EqualCorrelate with expression level Representation Only oneExpression vs. non expression Type DNADNA or antibody or protein Probe Gene structure Infer protein identity Encoded protein Infer protein identity Purpose

28 Screening with DNA probe Probe is identified cloned –From other organism –Same organism Looking for variants Chromosome walk

29 Genome Projects Whole genome sequencing Fragment and clone Sequence ALL clones! Computer assembles

30 Genome Projects Bee Cat Chicken Cow Dog Fruit fly Human Malaria parasite Microbial Genomes Mosquito Mouse Nematode Pig Plant Genomes Central Rat Retroviruses Sea urchin Tribolium Sheep Zebrafish Multiple organisms provide suitable systems for experimentation –Zebrafish-development –Rat-physiology –Dog- genetic disease –Fruit fly- behavior Some of practical significance –Mosquito/Malaria parasite

31 Il metodo Sanger (o metodo a terminazione di catena) Nel sequenziamento a terminazione di catena la reazione oltre ad 1) Uno stampo a singola elica 2) un innesco specifico (primer) 3) La marcatura con un dNTP* marcato, di solito con 35 S ha bisogno di: 4) una miscela di ddNTP, uno per ogni reazione di sequenza

32 La sintesi del filamento compementare, tuttavia non prosegue indefinitivamente, perché la miscela di reazione contiene, in quattro distinte reazioni piccole quantità di specifici dideossinucleotidi trifosfati, ddATP, ddTTP, ddCTP e ddGTP, che bloccano l’allungamento perché posseggono un solo atomo di idrogeno al posto del gruppo -OH in 3’ Terminazione della catena

33 DNA stampo a singola elica 3’-GGCTAAC 5’3’ Ibridazione con Il primer + [ 35 S]dATP+dCTP,dGTP,dTT (dNTP) +Sequenasi ddATP, dNTP ddCTP, dNTP ddGTP, dNTP ddTTP, dNTP -CCG ddA -ddC -C ddC -CC ddG -CCGATT ddG -CCGA ddT -CCGAT ddT Sequenza: 5’-CCGATTG A C G T -CCGATT ddG -CCGAT ddT -CCGA ddT -CCG ddA -CC ddG -C ddC -ddC GTGT T A G C C Schema di sequenziamento a terminazione di catena Direzione di lettura

34 Il sequenziamento automatizzato con marcatori fluorescenti Coniugando a ciascun ddNTP un diverso marcatore fluorescente, è possibile effettuare le quattro reazioni di sequenziamento in un unico tubo da saggio e caricare il tutto in solo pozzetto di gel ddA ddC ddT ddG

35 Le emissioni fluorescenti vengono captate da un rilevatore e le informazioni vengono integrate e trasformate in picchi di colore diverso, con aree proporzionali all’intensità di emissione.

36 Fluorescent DNA Sequencing A G T A C T G G G A T C Gel Electrophoresis

37 Detection of Fluorescently Tagged DNA DNA Fragments Separated by Electrophoresis Output to Computer Scanning Laser Excites Fluorescent Dyes Optical Detection System

38 Fluorescent DNA Sequencing Data

39 Fluorescent DNA Sequence Trace

40 Size of gene library N = ln(1-P) ln (1-A/B) N = Number of clones P = 95 % probability of finding gene A = Average size of DNA fragments B = Total size of genome E. coli has genome of 4,800,000 nucleotides Average size of insert is 10,000 nucleotides Number of clones for 95 % probability is 1700

41 Size of gene library If genome is large e.g. human genome (3 x 10 9 ) then number of clones to make library becomes unrealistic ( ) if using a plasmid vector (accepts only 10 kb as larger DNA can’t be transformed) Therefore need to use vectors that can accept larger pieces of DNA –I.e. if each vector contains a large piece of DNA you don’t need so many clones to make a gene library

42 What vectors for what libraries? Human library requires YAC clones Human library requires >1,000,000 plasmid clones

43 Vettori e clonaggio YAC=yeast artificial chromosome

44 Vettori e clonaggio

45 Lunghezza del DNA clonabile in uno YAC: fino a 1000 Kb

46 Vettori e clonaggio Approximate Maximum Length of DNA That Can Be Cloned in Vectors Vector Type Cloned DNA (kb) Plasmid λ phage Cosmid P1 phage BAC (bacterial artificial chromosome) YAC (yeast artificial chromosome)

47 Whole Genome Shotgun Celera Genomics Fragment and sequence entire genome Each fragment is sequenced completely and then these pieces are aligned to one another by a computer, based on overlapping sequence between fragments.

48 Overview of Facts Asserted 2.91 billion base pairs (bp) 1.1% exons, 24% introns, 75% intergenic DNA 2.1 million single nucleotide polymorphisms (SNP’s) less than 1% of all SNP’s reflected changes in proteins

49 Structure of the genome

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