ENZIMI DI RESTRIZIONE.

Presentazione sul tema: "ENZIMI DI RESTRIZIONE."— Transcript della presentazione:

1 ENZIMI DI RESTRIZIONE

2 Reazione ligasica di frammenti di restrizione

3 CLONAGGIO DNA RICOMBINANTE: DUE MOLECOLE DI DNA VENGONO
UNITE IN PROVETTA SFRUTTANDO LE PROPRIETA’ DI ENDONUCLEASI DI RESTRIZIONE DI TIPO II E DELLA DNA LIGASI CLONAGGIO -IN BIOLOGIA CLONARE UN ORGANISMO SIGNIFICA OTTENERE UN INDIVIDUO UNA POPOLAZIONE DI ORGANISMI CHE SONO GENETICAMENTE IDENTICI -IN BIOLOGIA MOLECOLARE CLONARE UN TRATTO DI DNA SIGNIFICA OTTENERE UNA POPOLAZIONE DI DNA IDENTICHE ALLA MOLECOLA DI PARTENZA

4 Vettori e clonaggio Vettori Plasmidi Fagi Cosmidi YAC

5 Molecola circolare di DNA a doppio filamento, normalmente presente
Vettori e clonaggio Plasmide Molecola circolare di DNA a doppio filamento, normalmente presente nella cellula batterica, in grado di replicarsi autonomamente dal cromosoma.

6 VETTORI DI CLONAGGIO

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8 Bromo-chloro-indoyl--galactopyranosidase or X-Gal (Clear)
-galactosidase Bromo-chloro-indoyl (Deep blue insoluble) + galactose

9 Bacteria from ligation plated on ampicillin and X-Gal
Contains wild type plasmd Contains recombinant plasmd

10 DNA clonabile in un plasmide:
Vettori e clonaggio Lunghezza massima del DNA clonabile in un plasmide: circa 20 Kb

11 I virus sono piccoli parassiti non in grado di replicarsi.
Vettori e clonaggio I virus sono piccoli parassiti non in grado di replicarsi. Dopo aver infettato una cellula-ospite utilizzano i suoi sistemi di replicazione e sintesi delle proteine per riprodursi

12 I batteriofagi (o fagi) sono virus che infettano i batteri.
Vettori e clonaggio I batteriofagi (o fagi) sono virus che infettano i batteri.

13 Il fago più utilizzato in biologia
Vettori e clonaggio Il fago più utilizzato in biologia molecolare è il fago 

14 Vettori e clonaggio Assemblaggio di un fago 

15 Mappa del genoma del fago 
Vettori e clonaggio Mappa del genoma del fago 

16 Vettori e clonaggio Clonaggio di frammenti di DNA nel fago 

17 Formazione di cloni fagici
Vettori e clonaggio Formazione di cloni fagici

18 L’infezione dei batteri con il fago  è circa 103 volte più efficiente
Vettori e clonaggio L’infezione dei batteri con il fago  è circa 103 volte più efficiente della trasformazione con un plasmide

19 Lunghezza del DNA clonabile in un fago: 20-25 Kb
Vettori e clonaggio Lunghezza del DNA clonabile in un fago: 20-25 Kb

20 Un cosmide è un plasmide contenente la sequenza COS
Vettori e clonaggio Un cosmide è un plasmide contenente la sequenza COS dal fago 

21 Vettori e clonaggio

22 Vettori e clonaggio Clonaggio di frammenti di DNA in un cosmide

23 clonabile in un cosmide:
Vettori e clonaggio Lunghezza del DNA clonabile in un cosmide: circa 45 Kb

24 EcoR I Genomic Library Infect cells

25 AAAAAA cDNA synthesis cDNA library Infect cells

26 Genomic Library Construction
Preparing the insert Partial digestion preferred

27 Genomic library cDNA library Source Variation Insert size
Genomic DNA mRNA Source Species or strains Tissues Developmental stages Variation 12k -- 20k 0.2k -- 6k Insert size Equal Correlate with expression level Representation Only one Expression vs. non expression Type DNA DNA or antibody or protein Probe Gene structure Infer protein identity Encoded protein Purpose

28 Screening with DNA probe
Probe is identified cloned From other organism Same organism Looking for variants Chromosome walk Chromosome walk

29 Genome Projects Whole genome sequencing Fragment and clone
Sequence ALL clones! Computer assembles

30    Bee             Cat             Chicken             Cow             Dog             Fruit fly    Human    Malaria parasite    Microbial Genomes    Mosquito     Mouse    Nematode    Pig              Plant Genomes Central    Rat    Retroviruses     Sea urchin Tribolium            Sheep             Zebrafish Genome Projects Multiple organisms provide suitable systems for experimentation Zebrafish-development Rat-physiology Dog- genetic disease Fruit fly- behavior Some of practical significance Mosquito/Malaria parasite

31 (o metodo a terminazione di catena)
Il metodo Sanger (o metodo a terminazione di catena) Nel sequenziamento a terminazione di catena la reazione oltre ad 1) Uno stampo a singola elica 2) un innesco specifico (primer) 3) La marcatura con un dNTP* marcato, di solito con 35S ha bisogno di: 4) una miscela di ddNTP, uno per ogni reazione di sequenza

32 Terminazione della catena
La sintesi del filamento compementare, tuttavia non prosegue indefinitivamente, perché la miscela di reazione contiene, in quattro distinte reazioni piccole quantità di specifici dideossinucleotidi trifosfati, ddATP, ddTTP, ddCTP e ddGTP, che bloccano l’allungamento perché posseggono un solo atomo di idrogeno al posto del gruppo -OH in 3’

33 Schema di sequenziamento a terminazione di catena
DNA stampo a singola elica 3’-GGCTAAC Ibridazione con Il primer 5’ 3’ 3’-GGCTAAC + [35S]dATP+dCTP,dGTP,dTT (dNTP) +Sequenasi ddATP, dNTP ddCTP, dNTP ddGTP, dNTP ddTTP, dNTP -CCG ddA -ddC -CC ddG -CCGA ddT -C ddC -CCGATT ddG -CCGAT ddT A C G T -CCGATT ddG -CCGAT ddT -CCGA ddT -CCG ddA -CC ddG -C ddC -ddC G T T A G C C Direzione di lettura Sequenza: 5’-CCGATTG

34 Il sequenziamento automatizzato con marcatori fluorescenti
Coniugando a ciascun ddNTP un diverso marcatore fluorescente, è possibile effettuare le quattro reazioni di sequenziamento in un unico tubo da saggio e caricare il tutto in solo pozzetto di gel ddA ddT ddC ddG

35 Le emissioni fluorescenti vengono captate da un rilevatore e le
informazioni vengono integrate e trasformate in picchi di colore diverso, con aree proporzionali all’intensità di emissione.

36 Fluorescent DNA Sequencing
A G T A C T G G G A T C Gel Electrophoresis

37 Detection of Fluorescently Tagged DNA
DNA Fragments Separated by Electrophoresis Optical Detection System Scanning Laser Excites Fluorescent Dyes Output to Computer

38 Fluorescent DNA Sequencing Data

39 Fluorescent DNA Sequence Trace

40 Size of gene library N = ln(1-P) ln (1-A/B) N = Number of clones
P = 95 % probability of finding gene A = Average size of DNA fragments B = Total size of genome E. coli has genome of 4,800,000 nucleotides Average size of insert is 10,000 nucleotides Number of clones for 95 % probability is 1700

41 Size of gene library If genome is large e.g. human genome (3 x 109) then number of clones to make library becomes unrealistic ( ) if using a plasmid vector (accepts only 10 kb as larger DNA can’t be transformed) Therefore need to use vectors that can accept larger pieces of DNA I.e. if each vector contains a large piece of DNA you don’t need so many clones to make a gene library

42 What vectors for what libraries?
Human library requires >1,000,000 plasmid clones Human library requires YAC clones

43 YAC=yeast artificial chromosome
Vettori e clonaggio YAC=yeast artificial chromosome

44 Vettori e clonaggio

45 Lunghezza del DNA clonabile in uno YAC: fino a 1000 Kb
Vettori e clonaggio Lunghezza del DNA clonabile in uno YAC: fino a 1000 Kb

46 Approximate Maximum Length of DNA That Can Be Cloned in Vectors
Vettori e clonaggio Approximate Maximum Length of DNA That Can Be Cloned in Vectors Vector Type Cloned DNA (kb) Plasmid 20 λ phage 25 Cosmid 45 P1 phage 100 BAC (bacterial artificial chromosome) 300 YAC (yeast artificial chromosome) 1000

47 Whole Genome Shotgun Celera Genomics
Fragment and sequence entire genome The entire genome is fragmented into small pieces, with no prior knowledge regarding the order or relationship of the clones to on another prior to sequencing. Assembly of these pieces is done by a computer, by searching for overlapping sequences. Each fragment is sequenced completely and then these pieces are aligned to one another by a computer, based on overlapping sequence between fragments.

48 Overview of Facts Asserted
2.91 billion base pairs (bp) 1.1% exons, 24% introns, 75% intergenic DNA 2.1 million single nucleotide polymorphisms (SNP’s) less than 1% of all SNP’s reflected changes in proteins

49 Structure of the genome

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