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ENZIMI DI RESTRIZIONE Reazione ligasica di frammenti di restrizione.

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Presentazione sul tema: "ENZIMI DI RESTRIZIONE Reazione ligasica di frammenti di restrizione."— Transcript della presentazione:

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2 ENZIMI DI RESTRIZIONE

3 Reazione ligasica di frammenti di restrizione

4 Fig 4.20 separation of poly-A mRNA

5 mRNA Purification 1. Total RNA Purification 2. PolyA + RNA purification using oligo(dT)

6 mRNA primed mRNA mRNA/cDNA hybrid AAAAA n TTTTT AAAAA n TTTTT Anneal oligo dT primer Reverse Transcriptase and dNTPs Gubler Hoffman cDNA Synthesis - 1

7 mRNA/cDNA hybrid nicked RNA AAAAA n TTTTT AAAAA TTTTT RNase H Gubler Hoffman cDNA Synthesis - 2 AAAAA n TTTTT DNA Pol I nicked RNA used as primers by Pol

8 2nd strand cDNA in pieces ds cDNA AAAAA TTTTT cDNA Library Clone into vector E. coli DNA Ligase Gubler Hoffman cDNA Synthesis - 3 AAAAA TTTTT

9 cDNA synthesis TTTTTTTTT First strand Nick translation cDNA library

10 Vettori e clonaggio Vettori Plasmidi Fagi Cosmidi YAC

11 Vettori e clonaggio Plasmide Molecola circolare di DNA a doppio filamento, normalmente presente nella cellula batterica, in grado di replicarsi autonomamente dal cromosoma.

12 VETTORI DI CLONAGGIO

13 Vettori e clonaggio Replicazione di un plasmide

14 INSERIMENTO DI UN TRATTO DI DNA ESOGENO IN UN VETTORE DI CLONAGGIO

15 CLONAGGIO: -TRASFORMAZIONE -SELEZIONE -CRESCITA COLONIE

16 IDENTIFICAZIONE DELLA COLONIA BATTERICA DI INTERESSE

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18 Bromo-chloro-indoyl- -galactopyranosidase or X-Gal (Clear) Bromo-chloro-indoyl (Deep blue insoluble) + galactose -galactosidase

19 Inserting chromosomal DNA into a vector GAATTC CTTAAG GAATTC CTTAAG GAATTC CTTAAG GAATTC CTTAAG GAATTC CTTAAG Vector Chromosome Cut with EcoRI and add DNA ligase Recombinant vector Ampicillin resistant; -galactosidase negative (White on X-Gal) LacZ gene codes for -galactosidase Ampicillin resistance gene

20 Bacteria from ligation plated on ampicillin and X-Gal Contains wild type plasmd Contains recombinant plasmd

21 Vettori e clonaggio

22 Lunghezza massima del DNA clonabile in un plasmide: circa 20 Kb

23 Vettori e clonaggio I virus sono piccoli parassiti non in grado di replicarsi. Dopo aver infettato una cellula-ospite utilizzano i suoi sistemi di replicazione e sintesi delle proteine per riprodursi

24 Vettori e clonaggio I batteriofagi (o fagi) sono virus che infettano i batteri.

25 Vettori e clonaggio Ciclo litico del fago T4

26 Vettori e clonaggio Il fago più utilizzato in biologia molecolare è il fago

27 Vettori e clonaggio Ciclo litico e lisogenico del fago

28 Vettori e clonaggio Assemblaggio di un fago

29 Vettori e clonaggio Mappa del genoma del fago

30 Vettori e clonaggio Clonaggio di frammenti di DNA nel fago

31 Vettori e clonaggio Formazione di cloni fagici

32 Vettori e clonaggio Linfezione dei batteri con il fago è circa 10 3 volte più efficiente della trasformazione con un plasmide

33 Vettori e clonaggio Lunghezza del DNA clonabile in un fago: Kb

34 Vettori e clonaggio Un cosmide è un plasmide contenente la sequenza COS dal fago

35 Vettori e clonaggio

36 Clonaggio di frammenti di DNA in un cosmide

37 Vettori e clonaggio Lunghezza del DNA clonabile in un cosmide: circa 45 Kb

38 EcoR I Genomic Library Infect cells

39 AAAAAA cDNA synthesis Infect cells cDNA library

40 Preparing the insert –Partial digestion preferred Genomic Library Construction

41 Ligation to vector

42 Genomic librarycDNA library Genomic DNAmRNA Source Species or strains Tissues Developmental stages Variation 12k -- 20k0.2k -- 6k Insert size EqualCorrelate with expression level Representation Only oneExpression vs. non expression Type DNADNA or antibody or protein Probe Gene structure Infer protein identity Encoded protein Infer protein identity Purpose

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44 Screening a eukaryotic gene library Homologous gene from other organism –Mammalian genes are very similar –Thus if trying to get human gene screen with the equivalent gene from another organism –Oligonucleotide based on protein sequence or known sequence of homologous gene –Purify protein and determine sequence –Build a nucleotide sequence which codes for protein sequence

45 Amino acid sequence Met-Asn-Lys-Trp-Glu-Met ATG AAT AAA TGG GAA ATG ATG AAT AAA TGG GAG ATG ATG AAT AAG TGG GAA ATG ATG AAT AAG TGG GAG ATG ATG AAC AAA TGG GAA ATG ATG AAC AAA TGG GAG ATG ATG AAC AAG TGG GAA ATG ATG AAC AAG TGG GAG ATG Met = ATG; Asn = AAT or AAC; Lys = AAA or AAG; Trp = TGG; Glu = GAA or GAG How many probes must we make?

46 CLONAGGI MULTIPLI

47 VETTORI DI ESPRESSIONE

48 PROTEINE DI FUSIONE

49 PRODUZIONE DI LIBRERIE

50 Screening the Library ATTAGCGCCTTTACGCA ……………………TAATCGCGGAAATGCGT…………

51 Screening with DNA probe Probe is identified cloned –From other organism –Same organism Looking for variants Chromosome walk

52 Expression vector cDNA library Clone cDNAs Screen for gene of interest based on activity or antibodies

53 Genome Projects Whole genome sequencing Fragment and clone Sequence ALL clones! Computer assembles

54 Genome Projects Bee Cat Chicken Cow Dog Fruit fly Human Malaria parasite Microbial Genomes Mosquito Mouse Nematode Pig Plant Genomes Central Rat Retroviruses Sea urchin Tribolium Sheep Zebrafish Multiple organisms provide suitable systems for experimentation –Zebrafish-development –Rat-physiology –Dog- genetic disease –Fruit fly- behavior Some of practical significance –Mosquito/Malaria parasite

55 Il metodo Sanger (o metodo a terminazione di catena) 1) Il sequenziamento a terminazione di catena coinvolge la sintesi di nuovi filamenti di DNA, complementari ad uno stampo a singolo filamento Per la sintesi del DNA si utilizzano DNA polimerasi caratterizzate da Elevata processività Bassa attività esonucleasica 5-3 Bassa attività esonucleasica 3-5 (es. Klenow, Sequenasi)

56 Denaturazione del vettore Utilizzo di un fago helper Per M13 e produzione della Forma a singolo filamento (1) Produzione dello stampo a filamento singolo Utilizzo della PCR Utilizzo di fagemidi

57 Il metodo Sanger (o metodo a terminazione di catena) 2) un innesco specifico (primer) 3) La marcatura con un dNTP* marcato, di solito con 35 S Nel sequenziamento a terminazione di catena la reazione oltre ad 1) Uno stampo a singola elica ha bisogno di:

58 5-A T C T T T T A G A GT A C C 3-T A G A A A A T C T C A T G G A C T C T C T A C T A T C T A C A T G T A -5 PRIMER DNA Polimerasi 5-A T C T T T T A G A GT A C C T G AG*AGAT GA T AG*A 3-T A G A A A A T C T C A T G G A C T C T C T A C T A T C T A C A T G T A -5 DNA Polimerasi PRIMER (2,3) Sintesi del filamento marcato

59 Il metodo Sanger (o metodo a terminazione di catena) Nel sequenziamento a terminazione di catena la reazione oltre ad 1) Uno stampo a singola elica 2) un innesco specifico (primer) 3) La marcatura con un dNTP* marcato, di solito con 35 S ha bisogno di: 4) una miscela di ddNTP, uno per ogni reazione di sequenza

60 La sintesi del filamento compementare, tuttavia non prosegue indefinitivamente, perché la miscela di reazione contiene, in quattro distinte reazioni piccole quantità di specifici dideossinucleotidi trifosfati, ddATP, ddTTP, ddCTP e ddGTP, che bloccano lallungamento perché posseggono un solo atomo di idrogeno al posto del gruppo -OH in 3 Terminazione della catena

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62 ddCTP 5-A T C T T T T A G A GT A C C T G AG*AGAT GA T AG*A 3-T A G A A A A T C T C A T G G A C T C T C T A C T A T C T A C A T G T A -5 DNA Polimerasi PRIMER + ddNTP ( per es. ddCTP) 5-A T C T T T T A G A GT A C C T G AG*AGAT GA T AG*AT G T A dd C 3-T A G A A A A T C T C A T G G A C T C T C T A C T A T C T A C A T G T A -5 STOP Il risultato è una serie di frammenti interrotti ciascuno in corrispondenza di ogni dCTP

63 DNA stampo a singola elica 3-GGCTAAC 53 Ibridazione con Il primer + [ 35 S]dATP+dCTP,dGTP,dTT (dNTP) +Sequenasi ddATP, dNTP ddCTP, dNTP ddGTP, dNTP ddTTP, dNTP -CCG ddA -ddC -C ddC -CC ddG -CCGATT ddG -CCGA ddT -CCGAT ddT Sequenza: 5-CCGATTG A C G T -CCGATT ddG -CCGAT ddT -CCGA ddT -CCG ddA -CC ddG -C ddC -ddC GTGT T A G C C Schema di sequenziamento a terminazione di catena Direzione di lettura

64 Nuovi metodi di sequenziamento Il sequenziamento a ciclo termico ( PCR asimettrica) Il sequenziamento automatizzato con marcatori fluorescenti

65 Il sequenziamento a ciclo termico ( PCR asimettrica) Vengono effettuate 4 rezioni di PCR, ognuna contiene un solo primer e uno dei 4 dideossi nucleotidi trifosfati. Si generano le consuete famiglie di filamenti a catena terminata che vengono risolti per elettroforesi su gel di poliacrilammide DNA stampo ddATP PCR con un solo primer ddA

66 Il sequenziamento automatizzato con marcatori fluorescenti Coniugando a ciascun ddNTP un diverso marcatore fluorescente, è possibile effettuare le quattro reazioni di sequenziamento in un unico tubo da saggio e caricare il tutto in solo pozzetto di gel ddA ddC ddT ddG

67 Le emissioni fluorescenti vengono captate da un rilevatore e le informazioni vengono integrate e trasformate in picchi di colore diverso, con aree proporzionali allintensità di emissione.

68 Fluorescent DNA Sequencing A G T A C T G G G A T C Gel Electrophoresis

69 Detection of Fluorescently Tagged DNA DNA Fragments Separated by Electrophoresis Output to Computer Scanning Laser Excites Fluorescent Dyes Optical Detection System

70 Fluorescent DNA Sequencing Data

71 Fluorescent DNA Sequence Trace

72 Size of gene library N = ln(1-P) ln (1-A/B) N = Number of clones P = 95 % probability of finding gene A = Average size of DNA fragments B = Total size of genome E. coli has genome of 4,800,000 nucleotides Average size of insert is 10,000 nucleotides Number of clones for 95 % probability is 1700

73 Size of gene library If genome is large e.g. human genome (3 x 10 9 ) then number of clones to make library becomes unrealistic ( ) if using a plasmid vector (accepts only 10 kb as larger DNA cant be transformed) Therefore need to use vectors that can accept larger pieces of DNA –I.e. if each vector contains a large piece of DNA you dont need so many clones to make a gene library

74 What vectors for what libraries? Human library requires YAC clones Human library requires >1,000,000 plasmid clones

75 Vettori e clonaggio YAC=yeast artificial chromosome

76 Vettori e clonaggio Dimostrazione sperimentale degli elementi funzionali di un cromosoma

77 Vettori e clonaggio Vettore YAC: sequenze ARS CEN TEL

78 Vettori e clonaggio

79 Lunghezza del DNA clonabile in uno YAC: fino a 1000 Kb

80 Vettori e clonaggio Approximate Maximum Length of DNA That Can Be Cloned in Vectors Vector Type Cloned DNA (kb) Plasmid λ phage Cosmid P1 phage BAC (bacterial artificial chromosome) YAC (yeast artificial chromosome)

81 Whole Genome Shotgun Celera Genomics Fragment and sequence entire genome Each fragment is sequenced completely and then these pieces are aligned to one another by a computer, based on overlapping sequence between fragments.

82 Overview of Facts Asserted 2.91 billion base pairs (bp) 1.1% exons, 24% introns, 75% intergenic DNA 2.1 million single nucleotide polymorphisms (SNPs) less than 1% of all SNPs reflected changes in proteins

83 Structure of the genome

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