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Malattie da espansione di repeats instabili fenomeno scoperto nel 1991 (FraX, SBMA) inizialmente noto come espansione di triplette poi tetra- penta-nucleotidi:

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1 Malattie da espansione di repeats instabili fenomeno scoperto nel 1991 (FraX, SBMA) inizialmente noto come espansione di triplette poi tetra- penta-nucleotidi: repeats instabili Caratteristica comune: fenomeno dellanticipazione Effetto biologico: 1.perdita di funzione della proteina 2.guadagno di funzione (CAG) 3.effetto tossico dellmRNA

2 Malattie da espansione di repeats instabili: perdita della proteina Sindrome dellX fragile E: CCGs del 5UTR con iper-metilazione e silenziamento del gene. Proteina ricca in serine e proline, possibile fattore trascrizionale Atassia di Friedreich: GAAs nel primo introne con ridotta espressione e inibizione dellelongazione. Proteina fratassina possibile trasporto del Ferro nei mitocondri con riduzione delle ferro-proteine.

3 Sindrome dell X fragile ripetizioni CGG nel 5UTR > CGG con AGG ogni 9-10 triplette da 54 – 58 fino a kb in Xq27.3

4 Sindrome dellX fragile Caratteristiche cliniche ritardo mentale - moderato nei maschi - lieve nelle femmine altri segni - macrocefalia, faccia allungata - oriecchie sborgenti e basse - lassità articolare - macro-orchidismo Biologia molecolare 99% dei casi: CGG >200 1% dei casi: delezioni, mut puntiformi Prevalenza su maschi

5 Sindrome dell X fragile

6 Maschi e femmine possono trasmettere la pre-mutazione Durante la meiosi materna la pre-mutazione può espandersi a mutazione

7 90 CGG CGG CGG

8 Sindrome dell X fragile: portatori di pre-mutazione (1:300) Sindrome FXTAS (maschi) -progressiva atassia cerebellare e tremore intenzionale -perdita della memoria a breve termine, declino cognitivo -parkinsonismo, neuropatia periferica -disfunzione autonomica -debolezza muscolare dei cingoli (arti inf.) Penetranza: 17% a 60 aa38% a 70 aa 47% a 80 aa 75% oltre gli 80 aa 2.2% delle atassie delletà adulta 4.4% delle atassie ad esordio > 50 aa POF (femmine) - menopausa < 40aa nel 21% circa delle portatrici

9 Mutazioni dominanti effetto tossico dellRNA messaggero Gene FMR1 CGG: POF - FXTAS CGG > FMR

10 Sindrome dell X fragile: Analisi in PCR Amplificazione della regione 5UTR del gene FMR1

11 Sindrome dell X fragile: Analisi in PCR Maschio normale 29 CGGs Femmina normale CGGs Femmina pre-M CGGs Femmina pre-M CGGs Femmina affetta 28 CGGs In caso di full-mutation, lallele espanso NON è amplificabile

12 Sindrome dell X fragile: Analisi in Southern blotting EcoRI EagI 2.8 kb X attiva 5.2 kb X inattiva EcoRI EagI Allele pre-mutato > 2.8 kb X attiva > 5.2 kb X inattiva EcoRI Allele mutato >> 5.2 kb EcoRI EagI EcoRI

13 Endonucleasi di restrizione Enzimi che tagliano il DNA a doppia elica in siti specifici Blunt Ends = estremità prive di estensione

14 L ibridazione del DNA DNA a doppia elica denaturazione (soluzioni saline e/o calore) DNA a singolo filamento Singolo filamento complementare marcatura radioattiva o fluorescente SONDA

15 Southern Blotting (DNA)

16 Trasferimento di acidi nucleici su filtro, ibridizzazione e auto-radiografia.

17 Diagnosi mediante Southern blotting di delezioni genomiche digestione del DNA genomico separazione in gel di agarosio trasferimento su nitrocellulosa ibridazione con sonda di cDNA analisi dei frammenti riconosciuti dalla sonda Conclusione: il gene testato (X linked) è assente nel figlio maschio la madre ha solo una copia del gene (lintensità delle bande è simile a quella della padre).

18 Diagnosi mediante Southern blotting di delezioni genomiche. Perdita di un sito di restrizione -> banda di giunzione sonda (eterozigote) mut WT mut

19 Sindrome dell X fragile: Analisi in Southern blotting

20 RITARDO MENTALE Ritardo mentale di varia entità colpisce il 3% della popolazione (si definiscono con R.M. pazienti con Q.I. inferiore a 70) le cause eziologiche sono identificate in meno del 50% dei casi cause esogene sono responsabili dal 18,6% al 44% dei casi di R.M. cause genetiche sono responsabili dal 17% al 47,1% dei casi di R.M. –FRAX-A, FRX-E, anomalie cromosomiche queste variazioni nelle percentuali possono essere dovute: –al grado di R.M. –al criterio di selezione dei pazienti esaminati –alla definizione delle diagnosi

21 Delezioni sub-telomeriche

22 Inclusioni citoplasmatiche, nucleari o entrambe. Malattie da espansione di repeats instabili: guadagno di funzione

23 Corea di Huntington difetti di coordinazione motoria movimenti involontari coreici (arti, faccia, tronco) difficoltà nella programmazione delle attività depressione, irritabilità e demenza difficoltà nei movimenti volontari disartria e disfagia bradicinesia, rigidità e distonia tentativi di suicidio (28%) infezioni polmonari e urinarie, insufficienza cardiaca atrofia del caudato e putamen alla TC o RMN Esordio : anni (raramente infantile-senile) Decorso : anni (progressivo)

24 Gene HD 4p esoni – mRNA di basi – 3141 aa (350kD)

25 5 UTR Esone 1 21 CAG (10-26) Esone 2 Esone 3….. Trascritto gene HD

26 Letà di insorgenza correla con lentità dellespansione Le triplette CAG si espandono preferibilmente alla meiosi paterna Range Normale: Intermedio: Patologico: > 36

27 Proteina Huntingtina proteina espressa nei neuroni di diverse aree del SNC (citoplasmatica e nucleare) perdita di funzione della proteina mutata ? tossicità della proteina mutata ? –proteolisi –rilascio di un frammento N-term con poli-Glu –formazione di aggregati citoplasmatici e nucleari –sequestro di altre proteine e fattori di trascrizione prococe difetto del trasporto assonale segnale pro-apoptotico e morte cellulare

28

29 Malattie da espansione di repeats instabili: alterata funzione dellRNA ….ed effetto biologico sconosciuto !

30 (1: )

31 Il fenomeno dellanticipazione nella distrofia miotonica Da una generazione allaltra letà di insorgenza diminuisce e la gravità della malattia aumenta

32 Distrofia Miotonica: correlazione tra fenotipo e lunghezza del CTG repeat

33 3UTR introne 1


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