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BIOTECNOLOGIE FARMACOLOGICHE LEZIONE 7 Proteine terapeutiche CORSO DI LAUREA SPECIALISTICA IN BIOTECNOLOGIE DEL FARMACO Adriana Maggi.

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1 BIOTECNOLOGIE FARMACOLOGICHE LEZIONE 7 Proteine terapeutiche CORSO DI LAUREA SPECIALISTICA IN BIOTECNOLOGIE DEL FARMACO Adriana Maggi

2 Proteine terapeutiche Il numero di proteine terapeutiche attualmente in commercio supera i 250. I farmaci biotecnologici che vengono utilizzati per 384 indicazioni di cui 200 sono nuove terapie Attualmente ci sono più di 400 prodotti terapeutici biotecnologici in trial clinici. I farmaci in studio sono per la terapia di diversi tipi di neoplasie, Alzheimer, malattie cardiovascolari, diabete, sclerosi multipla, AIDS e artrite. Biotechnology Industry Organization (BIO)

3 Proteine terapeutiche Proteine di I generazione identiche alle proteine endogene umane Proteine di II generazione modificate al fine di: -Migliorarne le caratteristiche farmacocinetica (diminuire la biodegradabilità, aumentare la penetrazione cellulare, ecc) -Generare prodotti innvativi con funzioni diverse da quelle originarie -Generare dei prodotti più stabili facilitandone la conservazione Biosimilari

4 Proteine terapeutiche - Svantaggi 1.nuove metodologie di produzione 2.riproducibilità nella produzione 3.purificazione della macromolecola di sintesi 4.contaminanti nella purificazione 5.stabilità del prodotto finito 6.vie di somministrazione e farmacocinetica

5 Proteine terapeutiche – Vantaggi 1.Generalmente esercitano una attività estremamente mirata e specifica 2.Data la loro specificità hanno limitati effetti collaterali indesiderati 3.Data la loro alta specificità ed essendo di origine umana sono generalmente ben tollerati 4.Possono sopperire a un difetto genetico – nuovi bersagli terapeutici 5.Il tempo di approvazione da parte delle autorità regolatorie è significativamente inferiore a quello di molecole di sintesi (1 anno per 33 proteine/ 294 piccole molecole approvate tra 1980 e 2002 ) 6.La protezione brevettuale può essere più lunga di altri composti per le difficoltà di ottenere prodotti biosimilari

6 RICERCA PRECLINICA E FARMACI BIOTEC DRUG DISCOVERY: - scelta del bersaglio biologico - scelta dellorigine della molecola a potenziale attivita farmacologica (lead compound) - identificazione della molecola attiva sul bersaglio mediante opportuno screening FORMULAZIONE FARMACEUTICA FARMACOCINETICA E METABOLISMO FARMACOLOGIA GENERALE TOSSICOLOGIA FORMULAZIONE DEL DOSSIER PER INIZIO SPERIMENTAZIONE CLINICA

7 A fronte di un mercato farmaceutico in crescita del 7% rispetto al 2006, il mercato dei farmaci biotecnologici è cresciuto del 17.9% e oggi è pari a 65 miliardi di dollari (circa il 10% del mercato dei farmaci globale), inoltre due prodotti Biotech, Aranesp e Enbrel, sono state tra i primi dieci farmaci più venduti nel mondo nel Farmaci biotecnologici

8 INSULINA

9 ormone polipeptico prodotto dalle cellule del pancreas

10 PREPROINSULINA aa 51 catena B (30aa) catena A (21aa) RETICOLO ENDOPLASMATICO PROINSULINA GRANULI DI SECREZIONE DEL GOLGI SINTESI E MATURAZIONE DELLINSULINA peptide segnale peptide C

11 PRODUZIONE DI INSULINA PANCREAS DI MAIALE ESTRAZIONE E PURIFICAZIONE insulinaA 8A 10B 30 umanaThrIleThr suinaThrIleAla bovinaAlaValAla 1921-Scoperta dellinsulina (Banting e Best) e sua produzione per estrazione dal pancreas bovino o porcino

12 PRODUZIONE DI INSULINA Zn++ DIMERI DI INSULINA ESAMERO DI INSULINA : Aumento stabilità chimica delle preparazioni di insulina con Zn++ e con formulazioni neutre (in ambiente acido avvengono reazioni di deamidazione) Ottimizzazione tecniche estrattive e di purificazione (cromatografie)

13 PRODUZIONE DI INSULINA catena B Prodotto di digestione + SEFADEX Digestione con tripsina pH7.5 Gly23 e Arg22 Octapeptide C- terminale insulina umana sintetizzato chimicamente Conversione enzimatica insulina SUINA in UMANA da 10g di insulina suina ne vengono prodotti 7 di umana

14 PRODUZIONE DI INSULINA GENE INSULINA UMANA PLASMIDE DESPRESSIONE E.COLI ESTRAZIONE E PURIFICAZIONE 1982 DNA RICOMBINANTE VANTAGGI REAZIONI IMMUNITARIE ELIMINAZIONE USO ANIMALI

15 PRODUZIONE DI INSULINA GENENTECH GENENTECH: produzione in E.Coli di catene A e B separate e poi incubate in ambiente ossidativo per formare i ponti disolfuro E.COLI A B

16 PRODUZIONE DI INSULINA ELYLILLY FERMENTAZIONE PROINSULINA CRUDA PROINSULINA PARZIALMENTE PURIFICATA INSULINA CRUDA INSULINA PURIFICATA INSULINA ALTAMENTE PURIFICATA recupero delle cellule cristallizzazione proteolisi enzimatica colonne di scambio ionico gel filtrazione RP-HPLC

17 MODIFICAZIONI DELL INSULINA linserzione di un aa carico promuove la repulsione fra monomeri (fast acting insulin aspart) la conversione di HisB10 in Glu aumenta lattività di 5 volte Residui aa che interagiscono con il recettore e importanti per la dimerizzazione: A1,A4,A5,A19,A21 B12,B16,B23,B24,B25,B26

18 STRATEGIE INNOVATIVE DELLINSULINA INSULINA GLARGINA Laumento del punto isoelettrico dellinsulina da 5.4 verso la neutralità (due arginine vengono aggiunte allN-term. di B), causando la precipitazione nel sito diniezione, provoca un ritardo nellassorbimento ed un prolungamento delleffetto INSULINA DETEMIR Lacilazione covalente della LysB29 promuove il legame reversibile dellinsulina allalbumina ritardandone la distribuzione e il trasporto transendoteliale

19 TISSUE PLASMINOGEN ACTIVATOR: t-PA

20 Di solito linfarto e dovuto ad occlusione di arterie coronarie causata dalla formazione di un trombo di una placca aterosclerotica. Studi clinici hanno dimostrato che la lisi dei trombi con attivatori del plasminogeno diminuisce la mortalita. FARMACI USATI PER AMI: STREPTOCHINASI ANISTREPLASI UROCHINASI T-PA LINFARTO ACUTO AL MIOCARDIO (AMI) E LA PIU COMUNE CAUSA DI MORTE NEGLI STATI UNITI lume placca

21 FARMACI TROMBOLITICI La terapia con farmaci trombolitici tende a dissolvere i trombi e i depositi di fibrina nei siti dove è avvenuto un danno vascolare. Ovviamente tutti questi farmaci sono altamente tossici perché provocano emorragie.

22 NONOSTANTE LIMPIEGO DEGLI AGENTI TROMBOLITICI ATTUALMENTE DISPONIBILI IL 45% DEI PAZIENTI NON PRESENTA DOPO 90 UN RIPRISTINO COMPLETO DEL FLUSSO CORONARICO A CAUSA: COMPLESSITA STRUTTURALE DELLA PLACCA ATEROSCLEROTICA SU CUI SI FORMA IL TROMBO CORONARICO OCCLUDENTE REGIME TERAPEUTICO LIMITI DEL TRATTAMENTO INCAPACITA DI LISARE UNA SIGNIFICATIVA PROPORZIONE DI TROMBI CORONARICI COMPLICANZE EMORRAGICHE

23 LA COAGULAZIONE

24 PLASMINOGENO (proenzima) PLASMINA (enzima fibrinolitico) FIBRINAPRODOTTI DEGRADATI t-PA LA FIBRINOLISI PAI-1 E PAI-2 2-ANTIPLASMINA

25 trombo Cellule endoteliali Plasminogeno legato alla fibrina Plasmina legata alla fibrina Degradazione fibrina t-PA Il t-PA viene prodotto dalle cellule endoteliali e attiva il plasminogeno con taglio enzimatico allArg560

26 STRUTTURA t-PA SERIN PROTEASI aa 527 (64kD) 17 PONTI DISOLFURO 4 N-GLICOSILAZIONI 2 FORME (CON/SENZA GLICOSILAZIONE ASP184)

27 Viene scisso legame Arg275-Ile276 catena pesante N-terminale responsabile del legame alla fibrina DOMINIO FINGER DOMINIO EGF-LIKE DUE KRINGLE catena leggera C-terminale responabile dellattività catalitica DOMINIO SERIN PROTEASI His-Asp-Ser che taglia il plasminogeno Nel corso della fibrinolisi la FIBRINA depositata nel coagulo lega il t-PA e lo attiva FINGER KRINGLE SERINPROTEASE TAGLIO

28 NomeAlteplaseAlteplaseReteplaseTenecteplase NomeCommercialeActivaseCatfhloActivaseRatavaseTNKase CasaProduttriceGenentechGenentechBoehringerMannheimGenentech UsoterapeuticoInfarto acuto del miocardio (AMI) Ripristino della funzionalità cateteri vascolari Infarto acuto del miocardio (AMI) con aumento della funzione ventricolare in seguito allevento Riduzione della mortalità associata allinfarto del miocardio acuto(AMI) PRODOTTI COMMERCIALIZZATI

29 ALTEPLASE IDENTICO ALLENDOGENO t-PA UMANO PRODOTTO A UNA O DUE CATENE IN CHO EMIVITA <5MIN LA CLEARANCE EPATICA E RECETTORE MEDIATA: LE CELLULE DEL KUPPFER E ENDOTELIALI ATTRAVERSO IL RECETTORE DEL MANNOSIO, GLI EPATOCITI CON UN RECETTORE CARBOIDRATO INDIPENDENTE SOMMINISTRAZIONE I.V. DOSE RACCOMANDATA: 0.9 mg/kg PER INFUSIONE DI 60, IL 10% DI FARMACO DEVE ESSERE INIETTATO IN BOLO IN 1

30 RETEPLASE (2 a generazione) MUTANTE DI DELEZIONE (MANCA KRINGLE 1, FINGER E EGFLIKE DOMAINS) NON GLICOSILATO AUMENTA LEMIVITA (15 MIN) DIMINUISCE IL LEGAME CON LA FIBRINA PRODOTTO IN E.COLI

31 SOSTITUZIONI AMINOACIDICHE IN DUE PUNTI DEL KRINGLE 1 AUMENTANO LA SPECIFICITA CON LA FIBRINA E DIMINUISCONO LA CLEARANCE PLASMATICA PROLUNGANDO LEMIVITA (17 min) GLY PER ASN 117 ASN PER THR A 103 ALA-ALA-ALA-ALA PER LYS-HIS-ARG-ARG A TENECTEPLASE QUATTRO SOSTITUZIONI AMINOACIDICHE NEL SITO CATALITICO AUMENTANO RESISTENZA AL PAI-1 E AUMENTANO LA SPECIFICITA CON LA FIBRINA

32 NUOVE PROSPETTIVE: LANOTEPLASE PRODOTTO IN CHO MUTANTE DI DELEZIONE DEL t-PA NATIVO (MANCA DEL FINGER E EGF LIKE DOMAIN)+MUTAZIONE PUNTIFORME DA ASN117 A GLN QUESTA MODIFICAZIONE EVITA LA CLEARANCE DA PARTE DEI REC PER IL MANNOSIO EPATICI PROLUNGANDO LEMIVITA A 10

33 Proteine terapeutiche di I e II generazione: una nuova classificazione funzionale Leader et al. Nature Reviews Drug Discovery 7: 21-35, 2008

34 PROTEINE TERAPEUTICHE –classificazione funzionale Gruppo I: proteine terapeutiche con attività enzimatica o regolatoria 1a che rimpiazzano una proteina deficiente o anormale 1b che aumentano attività esistenti 1c che danno nuove funzioni/attività Gruppo II: proteine terapeutiche con bersagli mirati 2a che interferiscono con lattività fisio-patologiche 2b che rilasciano un composto terapeutico in un distretto specifico Gruppo III: vaccini proteici 3a che proteggono nei confronti di microorganismi esterni 3b per il trattamento di malattie autoimmuni 3c per la terapia anti-neoplastica Gruppo IV proteine con attività diagnostica

35 Gruppo I proteine terapeutiche con attività enzimatica o regolatoria 1a che rimpiazzano una proteina deficiente o anormale 1b che aumentano attività esistenti 1c che danno nuove funzioni/attività

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39 Gruppo II proteine terapeutiche con bersagli mirati 2a che interferiscono con lattività fisio- patologiche 2b che rilasciano un composto terapeutico in un distretto specifico

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41 Da Abbas, Lichtman & Pober: Cellular and Molecular Immunology. W.B. Saunders, 1999 STRUTTURA DELLE IMMUNOGLOBULINE Reclutamento di funzioni effettrici Regione cerniera Riconoscimento antigene Stabilità Legame al recettore di riciclo Frammento Fc Riconoscimento antigene

42 LE IMMUNOGLOBULINE SONO NATURALMENTE SUDDIVISE IN DOMINI FUNZIONALI Da Abbas, Lichtman & Pober: Cellular and Molecular Immunology. W.B. Saunders, 1999

43 PRINCIPALI AVANZAMENTI BIOTECNOLOGICI CHE HANNO CONSENTITO LO SVILUPPO DELLA IMMUNOTERAPIA CON ANTICORPI 1975George Kohler and Cesar Milstein (Nobel 1984) sviluppano la tecnologia di ibridazione somatica per la produzione di anticorpi monoclonali PRINCIPALI VANTAGGI: OMOGENEITA DELLE PREPARAZIONI SEMPLICITA DI PREPARAZIONE Anticorpi Monoclonali MURINI in vivo:

44 Murino Umanizzato Chimerico Umano

45 X X Cellula ES Inattivazione dei geni endogeni IgH murinaIgk murina IgH umanaIgk umana Linea trasgenica producente anticorpi umani Inserimento dei geni esogeni Fusione sferoplasti contenenti cloni YAC Linea trasgenica producente anticorpi murini e umani Linea trasgenica incapace di produrre anticorpi murini A B C

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47 Rituximab Il rituximab si lega a CD20, che si trova sulla superficie di uno dei tipi principali di globuli bianchi normali (linfociti B). Questa proteina si trova anche sulla superficie della maggior parte dei linfociti B che causano alcune forme di linfoma non Hodgkin. Il rituximab agisce attaccando sia i linfociti B maligni sia quelli normali; tuttavia, lorganismo è in grado di sostituire rapidamente eventuali globuli bianchi normali danneggiati, riducendo in tal modo sensibilmente il rischio di effetti collaterali. Quando lanticorpo monoclonale riconosce la proteina, LA LEGA e in questo modo stimola il sistema immunitario dellorganismo ad aggredire le cellule neoplastiche e può anche indurre le cellule a distruggere se stesse.

48 Primo anticorpo per terapia oncologica Il trattamento con rituximab da solo o in combinazione con chemioterapia e in grado di dare una significativa risposta clinica (40% vs 10% ) ed un significativo prolungamento di tempo alla ricaduta (27 mesi vs 7 mesi) > pazienti trattati >80 trial clinici in corso (www.clinical trials.gov) Rituximab: alcuni dati!!

49 NOME GENERICO / NOME COMMERCIALE TIPO DI ANTICORPO BERSAGLIO APPROVAZIONE FDA Trastuzumab /Herceptin Umanizzato Her2R1998 Bevacizumab /Avastin VEGF2004 Cetuximab /Erbitux Chimerico EGFR2004

50 Blocco del segnale di crescita HER2/EGFR Altri meccanismi immunologici Transtuzumab e Cetuximab meccanismo dazione

51 Primo anticorpo approvato per terapia tumori solidi Il trattamento con trastuzumab da solo come prima linea nei tumori metastatici ha dato 26% di risposta ed in combinazione con chemioterapici da un significativo prolungamento di tempo medio di risposta > pazienti trattati Trastuzumab: alcuni dati!!

52 Herceptin (trastuzumab) the first protein kinase inhibitor to be approved, back in 1998, remains by far the most effective kinase inhibitor for treating any of the common cancers. Nature Biotechnology, 2006 Gli anticorpi possono agire in vivo meglio di piccole molecole di sintesi?

53 Trastuzumab Il trastuzumab (Herceptin() è un anticorpo monoclonale ricombinante umanizzato, con elevata affinità di legame per la proteina Her-2/neu e in grado di inibirne gli effetti sulla trasformazione cellulare maligna a livello dei tessuti epiteliali. HER-2/neu è una proteina di 185 kd, codificata dal gene c-erbB2 appartenente alla famiglia dell'epidermal growth factor receptor ad attività tirosin kinasica di tipo I. Questo recettore, attraverso il legame con il ligando (Heregulin) e processi di fosforilazione, stimola la proliferazione e il differenziamento cellulare. HER-2/neu è espresso in molti tessuti normali ma è la iperespressione di questo recettore, che consegue a meccanismi del tipo amplificazione genica, ad avere un ruolo determinante nella patogenesi molecolare di alcune neoplasie epiteliali e, in particolare, del cancro mammario. L'iperespressione di HER-2/neu è stata rilevata in circa il 30% dei pazienti con carcinoma mammario metastatico e sembra costituire un fattore prognostico negativo

54 Il primo agente anti-angiogenico in grado di prolungare la sopravvivenza Il trattamento con bevacizumab da solo o in combinazione con chemioterapia e in grado di dare una significativa risposta clinica in ca. renale (45% vs 35% ) e ca. colon >> trial clinici in corso (www.clinical trials.gov) Bevacizumab: alcuni dati!! Umanizzato

55 Studi in avanzato stato di sviluppo Attualmente in corso negli USA con anticorpi monoclonali 84 trial clinici di fase III (www.clinical trials.gov) 35/84 sono per tumori solidi: 3 transtuzumab + chemio 13 bevacizumab + chemio 14 cetuximab + chemio 2 bevacizumab + cetuximab + chemio 5 altri

56 Panitumomab: alcuni dati!! Umano anticorpo anti EGFR da topo trasgenico (IgG2) Studio di fase III randomizzato in 443 pt con ca. Colon metastatico in ripresa di malattia: il trattamento con panitumomab in combinazione con chemio vs chemio e in grado di dare una significativo prolungamento del tempo alla progressione (49% vivi vs 30% dopo 32 settimane) Le risposte correlano con la tossicità cutanea Si prevede lapprovazione FDA a breve

57 Ipilimumab: alcuni dati anticorpo anti CTLA-4 da topo trasgenico (successivamente ingegnerizzato a IgG4 per evitare reclutamento C o FcR) Studi di fase I/II nel melanoma e nel ca. ovarico Incidenza di autoimmunità (grado III-IV) nel 15-25% dei casi Meccanismo: modulazione dellinibizione, adiuvante in vaccinologia, altro (sviluppo di anticorpi anti MICA) AACR, April 2006: Umano

58 TNF, tumor necrosis factor, produced by immuno competent cells, binds to TNF receptors (TNFR) and induces pro-inflammatory cytokine secretion (the NFkB pathway can be involved), increased cell migration to epidermis, activation of keratinocytes

59 TNF alpha antagonists Infliximab is a monoclonal antibody. It binds to TNF, and inhibits binding of TNF to cell surface TNF receptors Etanercept is a fusion protein consisting of an extracellular part of a TNFR linked to the Fc portion of IgG1. Etanercept binds TNF & blocks its interaction with cell surface TNF receptorsFc portion of IgG1

60 Mechanism of action of TNF-α antagonists. The monoclonal antibody (infliximab, adalimumab) and the receptor analog (etanercept) bind to circulating TNF-α and block its interaction with membrane receptor. ANTAGONISTI DI TNFalfa

61 Abatacept ( Orencia ) è il capostipite di una nuova classe di farmaci denominati modulatori selettivi della costimolazione delle cellule T. Abatacept inibisce la funzione delle cellule T, ma non produce deplezione di queste cellule. Le cellule T attivate sono coinvolte nella cascata infiammatoria, con conseguente infiammazione a livello delle articolazioni e danno strutturale irreversibile. Abatacept è indicato nella riduzione dei segni e dei sintomi dellartrite reumatoide in forma moderato-grave nei pazienti adulti, con inadeguata risposta ad almeno un farmaco modificante la malattia ( DMARD ).

62 Abatacept: proteina di fusione tra il dominio extracellulare di CTLA4 e la porzione Fc modificata dellIG umana G1; inibisce le cellule T legando CD80 e CD86 bloccandone la interazione con CD28 e quindi bloccando la attivazione autoiimune delle cellule T

63 ENFUVIRTIVE: peptide di 36 aa che blocca lentrata del virus HIV nella cellula ospite legando la proteina di superficie del virus gp120/gp41

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65 Analoghi del GH : Pegvisomant Analogo ricombinante di hGH - lys 120 sostituita con una gly previene la dimerizzazione funzionale del recettore qualsiasi aminoacido tranne lys o ala in questa posizione: Promotore della crescita Þ antagonista GH - Pegilazione – coniugazione via i gruppi aminici a catene di polietilen-glicole Aumento di T1/2 (SC) a circa 6 giorni Picco plasmatico ore Ridotta immunogenicità la pegilazione maschera i determinanti antigenici Ridotta affinità di legame altri otto aminoacidi sostituiti

66 pegvisomant

67 Gruppo II proteine terapeutiche con bersagli mirati 2a che interferiscono con lattività fisio- patologiche 2b che rilasciano un composto terapeutico in un distretto specifico

68 TOSITUMOMAB lega lantigene di superficie CD20 e stimola apoptosi; puo essere accoppiato con Iodio radionmarcato per svolgere una attività radiotossica

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