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BIOTECNOLOGIE FARMACOLOGICHE LEZIONE 16 Acidi nucleici e nuovi farmaci II CORSO DI LAUREA SPECIALISTICA IN BIOTECNOLOGIE DEL FARMACO Adriana Maggi.

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1 BIOTECNOLOGIE FARMACOLOGICHE LEZIONE 16 Acidi nucleici e nuovi farmaci II CORSO DI LAUREA SPECIALISTICA IN BIOTECNOLOGIE DEL FARMACO Adriana Maggi

2 Nuovi target farmacologici: GLI ACIDI NUCLEICI Duplicazione DNA duplicato DNA RNA Trascrizione Maturazione Metabolismo Traduzione PROTEINA FARMACI TRADIZIONALI

3 VANTAGGI NELLUTILIZZO DI FARMACI ANTI-ACIDI NUCLEICI A- BERSAGLIO MOLECOLARE PIU DEFINITO Numero di proteine intracellulari: Numero di RNA: Numero di geni: 1-2 B- SINTESI MIRATA Bersagli possono essere sequenze anche uniche nel genoma C- AZIONE MOLTO SPECIFICA Utilizzando interazioni con altri nucleotidi si possono sfruttare i vantaggi della complementarità tra due catene secondo il modello di Watson e Crick

4 ACIDI NUCLEICI COME TERAPEUTICI 1.ANTISENSO: desossinucleotidi complementari con lm-RNA 2.ANTIGENE: desossinucleotidi complementari al DNA 3.RIBOZIMA: ribonucleotidi catalalitici complementari a RNA 4.APTAMERI: desossi e ribonucleotidi complementari a una sequenza aminoacidica (competono con lRNA nellinterazione tra RNA e proteina) 5.DECOY: DNA complementare a sequenze aminoacidiche (competono con sequenze di DNA nellinterazione DNA- proteina) 6.siRNA: RNA complementari a sequenze specifiche

5 CRONOLOGIA DELLANTISENSO oggi Tripla elica in vitro (cell-free) RNA antisenso in batteri ODN antisenso RNA catalitico (ribozima) Recettore per ODN Tripla elica in vivo (cellule) Farmacotossicologia ODN in animali Terapia dellHBV nellanatra Sperimentazione ODN nelluomo FOMIVIRSEN è il primo ODN approvato per il trattamento della retinite da Citomegalovirus in pazienti con AIDS aODN di seconda generazione

6 GLI OLIGONUCLEOTIDI ANTISENSO (aODN) A C A U C G A U G A G C U G T A G C T A … … … … … … … aODN mRNA LaODN si lega in modo specifico alla sequenza complementare dellmRNA. Il tratto di catena ibrida che così si forma determina per via enzimatica o per impedimento sterico linattivazione dellintero messaggero

7 MECCANISMO DAZIONE DEGLI aODN A- ATTIVAZIONE DA PARTE DELLA RNAsi H: Degrada la componente di RNA delle catene ibride DNA-RNA B- IMPEDIMENTO STERICO: La catena di RNA-DNA impedisce la traduzione sui ribosomi, impedendo la sintesi della proteina aODN A B RNAsi H NO PROTEINA Ribosoma NO PROTEINA

8 REQUISITI PER LATTIVITA DI UNA MOLECOLA ANTISENSO Legarsi a siti accessibili dellmRNA target Stabilità Legame alla cellula ed entrata Accumulo allinterno della cellula Evitare la compartimentalizzazione errata Localizzarsi in siti attivi (nucleo o citoplasma) nucleo DNARNA Essere attivo PROTEINA CELLULA

9 DISEGNO DI UN ODN 1. Uso di programmi (es. MFOLD) che predicono il folding dellRNA per identificare siti di ibridazione accessibili 2. Gene walking: si genera una serie di ODNs contro lmRNA target e si valuta lattivita di ciascuno in cellule o in vivo 3. RNAsi H mapping: si basa sul fatto che tale enzima riconosce e degrada selettivamente la catena di RNA in eteroduplex RNA-DNA. Si combina lmRNA target con una libreria di ODNs random in presenza di RNAsi H, lanalisi dei frammenti tagliati permette di individuare i siti accessibili 4. ODN scanning arrays: Si costruisce un array sintetizzando ODN che coprono ogni sito dellRNA bersaglio, si ibrida dunque con lRNA target radiomarcato. Questa metodologia permette di individuare la sequenza di possibili ODN

10 MODIFICA CHIMICA DEGLI ODN PERCHE ? 1- per migliorare luptake cellulare 2- per aumentare la stabilità alle nucleasi COME ? A- apportando modifiche ai gruppi ossidrili del fosforo B- allossidrile 3 del ribosio C- alle basi

11 MODIFICHE UTILIZZATE SU ODN YW M X Z O O Base - OO P O O GRUPPO FOSFATO ZUCCHERO Base OR O OAlch 2-O-Alchil-RNA MWXYZ POOOOfosfodiestere PO alch OOOfosfotriestere PMeMe OOO metilfosfonato PSOOOfosforotioato PSOSO fosforoditioato PONHOO3-fosforammidato POOONH5-fosforammidato CHOHOformacetale SOOOCH 2 solfonato OR Base O HO arabinonucleoside Base OR O Alfa-nucleoside O Base OR Omo-DNA Base OR O

12 ALCUNI aODN MODIFICATI FOSFOROTIOATI: Sono analoghi degli aODN naturali in cui uno degli ossigeni non a ponte del legame fosfodiesterico è stato sostituito con un atomo di zolfo. VANTAGGI: - stabili alle nucleasi - facile sintesi - attivazione dellRNAsi H SVANTAGGI: - poco assorbiti - modesta tossicità METILFOSFONATI: Un ossigeno non a ponte del legame fosfodiesterico è sostituito con un gruppo metilico. VANTAGGI: - minore solubilità quindi maggiore concentrazione intracellulare SVANTAGGI: - non attivano lRNAsi H O P O S O Base O O O P O CH 3 O Base O O

13 PNA ( Peptide Nucleic Acids ) Uno scheletro di tipo peptidico mima la struttura del DNA Le basi mantengono tra loro la distanza che avevano nel DNA e quindi possono riconoscere le basi complementari La sintesi segue schemi identici a quella per i peptidi La struttura risultante è di natura non ionica, stabile alle nucleasi, proteasi e peptidasi

14 VANTAGGI: - facilità di sintesi - modulabilità delle proprietà chimico-fisiche (il gruppo ammidico può essere opportunamente funzionalizzato) - grande stabilità del complesso PNA-DNA grazie alla mancanza della carica degli oligomeri di PNA - sono più resistenti allattacco di proteasi e nucleasi SVANTAGGI: - non sono attaccati da RNAsi - non penetrano la membrana cellulare - possono non essere selettivi PNA: VANTAGGI E SVANTAGGI

15 CONFRONTO STRUTTURA CHIMICA TRA DNA E PNA O OO P O Base O O O OR - DNA NH 2 N Base O O NH N Base O O OH PNA

16 Nel 1992 fu pubblicato il primo studio sullapplicazione di PNA: PNA microiniettati (1 M) nei nuclei di cellule in coltura hanno bloccato la sintesi della proteina T Ag di SV40. Diversi gruppi hanno studiato leffetto antisenso dei PNA in vitro su estratti nucleari di epatociti di ratto e hanno riportato uninibizione della traduzione dellmRNA che codifica per il recettore a dellIL-2, la cloramfenicolo acetiltrasferasi, liNOS… Nel 1998 si hanno i primi risultati in vivo. PNA contro la neurotensina e il recettore degli oppioidi sono stati iniettati in ratti e hanno ridotto drasticamente la risposta alla neurotensina e alla morfina. Gli effetti sono reversibili e le risposte tornano normali dopo 5-14 giorni dalliniezione Sono stati studiati PNA che bloccano specificamente linterazione del fattore di trascrizione NF-kB con il suo sito di legame nel promotore di IL2-R PNA contro lmRNA della prepro-ossitocina riducono la quantità dellmRNA per lossitocina in modo tempo e dose dipendente APPLICAZIONI DI PNA

17 FARMACOCINETICA CELLULARE DI ODN In vitro gli ODN attraversano la membrana cellulare con un processo di pinocitosi ed endocitosi mediata da recettore. La concentrazione intracellulare è 1-3% di quella extracellulare, se veicolati da agenti lipofili arriva a 10-20% La lunghezza delloligo è inversamente proporzionale alluptake cellulare Non tutto lODN internalizzato esercita un effetto poiche gran parte e sequestrato nei compartimenti endosomiali o lisosomiali. Studi in vitro dimostrano una compartimentalizzazione di ODN anche allinterno di altri organelli citoplasmatici, questo non sembra vero in vivo Lemivita intracellulare degli oligo naturali è di 2-4 ore. Tale emivita è decisamente influenzata dalla natura chimica dellODN

18 FARMACOCINETICA-2 Somministrazione per via endovenosa, peritoneale, topica, oftalmica, inalatoria e orale. La via orale dà buoni livelli circolanti però lassorbimento è irregolare Lemivita plasmatica degli ODN naturali è assai breve, dovuta alla degradazione da parte delle nucleasi sieriche e alla captazione dai tessuti periferici (ridistribuzione). Piu somministrazioni sono in genere richieste per avere una certa efficacia, questo e particolarmente importante se il target ha un basso turnover. Esempio PERIFERINA= proteina dei filamenti intermedi tipica dei neuroni, half life=7 giorni circa, la somministrazione ripetuta di ODN per piu di 40 giorni porta alla riduzione del 90% di livelli di periferina Sono disponibili sistemi impiantabili a base di polimeri biodegradabili in grado di rilasciare il composto attivo per piu di un mese (il rilascio e in funzione della chimica e lunghezza dellODN)

19 FARMACOCINETICA DEI FOSFOROTIOATI I FOSFOROTIOATI, somministrati per via sistemica, si distribuiscono rapidamente in tutti gli organi tranne il SNC. Lassorbimento determina una rapida diminuzione dei livelli plasmatici e lequilibrio si stabilisce entro minuti dalla somministrazione. La concentrazione che si ottiene è sufficiente per lazione farmacologica. Lemivita è di ore. Leliminazione è degradativa (20-30% nelle urine dopo 24 ore). Non si è osservata eliminazione fecale. Si suggerisce per terapia sistemica mg/kg.

20 Dopo somministrazione intravenosa gli oligo possono essere rintracciati in una varietà di tessuti con la percentuale più alta di accumulazione nel rene (cellule dei tubuli prossimali) e nel fegato (cellule endoteliali) seguiti da milza e midollo osseo e in minime quantità nelle cellule ematiche mononucleari periferiche (PBMCs). DISTRIBUZIONE ED ELIMINAZIONE DI aODN

21 VEICOLAZIONE DI ODN PER USO TERAPEUTICO-1 Data la veloce eliminazione degli ODN plasmatici liberi è necessario che essi siano specificamente veicolati verso le cellule del tessuto bersaglio. Le strategie di trasferimento degli ODN sono diverse e tutte implicano il processo di adesione alla membrana e il successivo rilascio allinterno della cellula con inclusa efficienza, stabilità ed assenza di effetti citotossici.

22 I liposomi incapsulano gli ODN nel centro acquoso. I lipidi cationici dotati di carica positiva facilitano la incorporazione di DNA (a carica negativa) e il trasporto nella cellula mediante fusione con le membrane cellulari o endocitosi mediata da recettori. Per facilitare il rilascio dallendosoma o liposoma si puo incorporare un lipide helper = DOPE (dioleil fosfatidiletanol amina) che distrugge la parete endosomiale. Unaltra strategia consiste nellutilizzare liposomi pH sensibili: a PH acido il liposoma collassa e cio determina la fusione con la membrana endosomiale e il rilascio del contenuto nel citoplasma. VEICOLAZIONE DI ODN PER USO TERAPEUTICO-2 1. LIPOSOMI CON LIPIDI CATIONICI

23 2. NANOPARTICELLE E MICROSFERE: Le NANOPARTICELLE sono veicolanti colloidali di dimensioni nanometriche. Sono costituite da polialchil-ciano-acrilati (PACA), molto biodegradabili e a basso costo. Poiche hanno superficie carica negativamente si utilizzano copolimeri cationici o detergenti idrofobi cationici per facilitare il legame dellODN che rimane adsorbito alla superficie carica Le MICROSFERE hanno dimensioni comprese tra 1 e 100 m, sono a base di zuccheri biodegradabili che consentono il rilascio ritardato di acidi nucleici. P(LA-GA) sono le piu usate VEICOLAZIONE DI ODN PER USO TERAPEUTICO-3

24 3. RILASCIO MEDIATO DA UN PEPTIDE CARRIER: Una delle più potenti strategie per il rilascio allinterno delle cellule di ODN è basata sulluso di un breve peptide chiamato MPG (27 residui). MPG contiene un dominio idrofobico derivato dalla fusione di sequenze gp41 dellHIV ed un dominio idrofilico derivato dalla sequenza dellantigene T dellSV40. MPG ha unalta affinità per il DNA sia a singola elica che a doppia elica. I legami principali tra MPG e lODN avvengono attraverso interazioni elettrostatiche che coinvolgono residui basici del peptide vettore. Il rapporto MPG/ODN deve essere molto elevato (dellordine di 20/1). Questa nuova strategia offre diversi vantaggi rispetto agli altri approcci comunemente in uso, aumentando la stabilità degli ODN nei confronti delle nucleasi e facilitando lattraversamento della membrana plasmatica. VEICOLAZIONE DI ODN PER USO TERAPEUTICO-4

25 VEICOLAZIONE DI ODN PER USO TERAPEUTICO-5 5. CONIUGAZIONE: Composti coniugati con oligonucleotidi: LIGANDI (ferritina, porfirina, EGF, anticorpi): potenziano luptake cellulare per endocitosi e per via recettoriale LIPIDI (colesterolo, PEG, poli L-lisina): aumentano il passaggio passivo attraverso le membrane e incrementano la stabilità INTERCALANTI (psoralene, acridina, antracicline): accrescono la stabilità della doppia elica MARCANTI (biotina, fluoresceina) 4. VIRUS: Durante lassemblaggio del capside lODN terapeutico viene incorporato nello spazio intravirale sostituendo il contenuto nucleico originale.

26 TOSSICOLOGIA CELLULARE DEGLI ODN Solo per concentrazioni superiori a 100 M Possono causare 10-20% di inbizione della proliferazione cellulare forse per ibridazioni parziali aspecifiche Non sono state mai descritte mutazioni permanenti per inserimento degli oligo nel DNA Non sono state mai descritte trasformazioni neoplastiche

27 TOSSICOLOGIA IN VIVO TOPO DL/ mg/kg I.V e I.P. RATTO DL/ mg/kg/giorno/3 mesi Sofferenza epatica solo in caso di somministrazione di tioati. Non ci sono effetti teratogeni

28 aODN:SETTORI DI UTILIZZO TERAPEUTICO-1 1. CONTROLLO DELLA CRESCITA NEOPLASTICA: PRIMA GENERAZIONE: aODN contro mRNA importanti nel ciclo mitotico (subunità polimerasi, myc..) SECONDA GENERAZIONE: aODN contro le traslocazioni cromosomiche di linfomi e leucemie 2. TERAPIA ANTIVIRALE: HIV: SIDA blocco delle proteine essenziali per il ciclo riproduttivo (TAT,REF) Herpes Simplex: impiego clinico per cheratite erpetica Virus influenzali

29 aODN:SETTORI DI UTILIZZO TERAPEUTICO-2 4. CARDIOLOGIA: Ipertensione: aODN contro geni che sintetizzano per molecole vasoattive (renina-angiotensina, recettore adrenergico, endotelina e neuropeptide Y, callicreina,peptide natriuretico atriale, NO, calcitonina) Ischemia miocardica Nel controllo della ristenosi sono utilizzati per inibire la proliferazione endotelio-intima muscolare delle arterie coronariche dopo stress meccanico (azione sullm-RNA che codifica per il PDGF)

30 AODN IN VIROLOGIA 1. esperimenti su animali da laboratorio hanno evidenziato un effetto anti-HIV di un ODN di 28 mer complementare al gene tat dellHIV. In pazienti con AIDS conclamata, utilizzato alla concentrazione di 3,6 mg/kg per via endovenosa, non ha dato effetti positivi. Attualmente la Hybridon sta studiando una sequenza (GEM 91) che sembra bloccarenon solo la replicazione dellHIV ma anche inibire il suo legame alle cellule. 2. ODN contro Citomegalovirus = FOMIVIRSEN (Vitravene TM ), responsabile della cecità registrata in alcuni pazienti affetti da AIDS. Somministrazione topica per via intra-oculare. Approvato nel 1998 per il commercio in USA e nel 1999 per lEuropa 3. ODN anti influenzale. Blocca lespressione del gene ICAM 1 che funge da recettore per il passaggio del virus allinterno della cellula 4. ODN contro Papillomavirus (HPV) probabilmente responsabile del tumore della cervice uterina. Somministrazione intra-papilloma o per pomata

31 aODN IN ONCOLOGIA I GENERAZIONE Studi di somministrazione topica di DNA associato a nanoparticelle che ha come bersaglio il gene Ras, somministrato a pazienti con carcinoma alla vescica II GENERAZIONE Tumori sistemici (leucemie e linfomi): ODN diretti ad ibridizzare le sequenze originate dalla traslocazione cromosomica 8:14 nel linfoma di Burkitt, 9:21 (cromosoma Filadelfia) nella leucemia mieloide cronica, 14:18 nella leucemia B umana.

32 LEUCEMIA B UMANA Traslocazione cromosomica 14:18. A) La doppia rottura del cromosoma 18 nel gene bcl-2 e del cromosoma 14 nel locus della catena pesante delle immunoglobuline (IgH) determina (B) la formazione del gene ibrido bcl-2-IgH formando una sequenza nucleotidica specifica nel punto di giunzione (C). Ch.18 bcl-2 VD Ch.14 JEIgH bcl-2 J6J6 EIgH N 5 TGCAGTGGTGCT CCCTGGTTCCCCGAA TACTACTACCTA 3 bcl-2 sequenza specifica IgH A) B) C)

33 aODN CONTRO GENI CANCRO-CORRELATI-1 C-myc: Inibizione della proliferazione sia nei linfociti T sia delle cellule HL60, le quali sono indotte ad un differenziamento spontaneo; inibizione della crescita di una linea tumorale derivata da un linfoma di Burkitt C-myb:Inibizione dellattività proliferativa delle cellule mieloidi in coltura, dei precursori emopoietici mieloidi nrmali e dei T- linfociti PHA stimolati C-abl: Parziale inibizione della capacità proliferativa e della formazione di colonie mieloidi Cdc2: Inibizione della proliferazione dei linfociti T PHA stimolati Bcl-2: Inibizione della proliferazione di cellule leucemiche con massiva morte cellulare

34 CSF-1: Prevenzione della senescenza di cellule endoteliali umane, aumento della capacità proliferativa BCR/ABL: Soppressione della formazione di colonie di cellule di leucemia mieloide cronica P53: Soppressione della formazione di colonie di cellule di leucemia mieloide acuta Protimosina : Inibizione della proliferazione delle cellule mielomatose Butirrilcolinesterasi:Inibizione selettiva della megacariocitopoiesi aODN CONTRO GENI CANCRO-CORRELATI-2

35 EFFETTO ANTITUMORALE DI aODN ANTI-MYB aODN anti-myb Non trattati ODN controllo

36 ODN IN ALTRE PATOLOGIE PSORIASI: ODN per diminuire la velocità di proliferazione delle cell della pelle o contro un difetto del sist imm. RETINITE indotta da infezione da citomegalovirus: Vitravene TRATTAMENTO DELLASMA: LHybridon ha messo a punto un antisenso in grado di inibire le espressioni delle interleuchine durante la risposta immunitaria. MORBO DI CROHN: ISIS 2302 e in fase II, esso inibisce la sintesi di una proteina di adesione cellulare che favorisce il passaggio delle cellule infiammatorie attraverso i vasi sanguigni SCLEROSI MULTIPLA: la ISIS ha cercato di mettere a punto un ODN contro il recettore VLA4 sulla superficie dei linfociti per bloccare linappropriata migrazione di linfociti nel SNC che contribuisce alla patogenesi della malattia DISTROFIA MUSCOLARE DI DUCHENNE: effetto positivo di rattamenti intramuscolari

37 Dystrophin is a rod-shaped cytoplasmic protein, and a vital part of a protein complex that connects the cytoskeleton of a muscle fiber to the surrounding extracellular matrix through the cell membranes. This complex is variously known as the costamere or the dystrophin- associated protein complex. Many muscle proteins, such as α-dystrobrevin, syncoilin, synein, sarcoglycan, dystroglycan, and sarcospan, colocalize with dystrophin at the costamere. As of 2007, dystrophin is the longest gene known, covering 2.4 megabases (0.08% of the human genome) at locus Xp21. Theprimary trancript measures about 2,400 kilobases and takes 16 hours to transcribe, the mature mRNA measures 14.0 kilobases. The 79 exons code for a protein of over 3500 amino acid residues.

38 Exon skipping: una nuova applicazione per oligonucleotidi Antisenso: lesempio della patologia di Duchenne 1.

39 Exon skipping: una nuova applicazione per oligonucleotidi Antisenso: lesempio della patologia di Duchenne 2.

40 Utilizzodi acidi nucleici per alterare la maturazione di RNA: -Blocco sito di splicing criptico - esclusione di esoni - inclusione di esoni

41 PROBLEMATICHE RIGUARDANTI GLI ANTISENSO IN TERAPIA 1. Scarsa riproducibilità negli esperimenti in colture cellulari 2. Uso fosforotioati 3. Variabilità del grado di purezza delle diverse preparazioni 4. Uptake cellulare ancora poco definito 5. Costo

42 ODN DI SECONDA GENERAZIONE-1 Proprietà biologiche Affinità Substrato dellRnasi H Farmacocinetica cellulare Proprietà farmacocinetiche Stabilità in vivo Rilascio sito specifico Emivita plasmatica

43 Il modello di oligonucleotide deputato ad assolvere tutte queste funzioni e a mostrare tutte queste proprietà sembra rappresentato dalla classe degli MBO (mixed backbone oligonucleotides). Un ODN chimerico ultimamente approntato possiede una breve sequenza di DNA fosforotioato (3-9 basi) usata per attivare lRnasi H e un braccio ibridizzante fornito di nucleotidi modificati che non formano substrati per lRnasi H. Nucleotidi 2-O-Metil o 2-fluoro modificati sono stati usati per i bracci ibridizzanti. Il gruppo 2- O-metile incrementa laffinità delloligomero per lRNA target e ne aumenta lattività in coltura. Gli MBO mostrano una elevata stabilità in vivo che potrebbe consentire somministrazioni meno frequenti nonché meno gravi effetti locali legati alla natura polianionica e alla risposta immunitaria. Questo è dovuto al ridotto numero di legami fosforotioati contigui oltre che alla posizione centrale dei segmenti modificati. ODN DI SECONDA GENERAZIONE-2


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