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Processo di Valutazione del Rischio di una sostanza.

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Presentazione sul tema: "Processo di Valutazione del Rischio di una sostanza."— Transcript della presentazione:

1 Processo di Valutazione del Rischio di una sostanza

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5 FARMACI (SPECIALITA MEDICINALI) 1) Studi pre-registrativi Per lautorizzazione allimmissione in commercio (registrazione) sono richiesti studi tossicologici sperimentali. Il tipo di studi da effettuare e le modalità con cui vanno eseguiti sono definiti da apposite Linee Guida, in base alle modalità di utilizzo previste (durata, via di somministrazione, popolazione trattata) ed alla natura del farmaco (attività farmacologica, struttura chimica). Negli studi clinici pre-registrativi (fase I-III) si possono identificare gli effetti tossici più frequenti.

6 2) Studi post-marketing Dopo limmissione in commercio la tossicità nelluomo nellintera popolazione trattata e nelle condizioni di utilizzo reale viene monitorata tramite la farmacovigilanza.

7 La valutazione del rischio associato ad una sostanza, e le relative decisioni normative, dipendono da: quantità e qualità degli studi effettuati approccio allinterpretazione e valutazione dei dati degli studi; dipende da fattori socio-culturali ed economici.

8 Studi tossicologici Sperimentali. Si somministra la sostanza con precise modalità (dose, tempo, via ecc.) e se ne studiano gli effetti tossici. Si effettuano su animali, colture cellulari, microrganismi. Epidemiologici. Si studiano gli effetti di una sostanza su popolazioni umane che sono comunque esposte alla sostanza, presente nellambiente o somministrata a scopo terapeutico (farmaci, vaccini).

9 Intossicazione umana accidentale. Deve essere possibile attribuire con certezza gli effetti osservati allesposizione (imputabilità)

10 Studi sperimentali vs. studi epidemiologici Studi sperimentali. Lesposizione alla sostanza è strettamente controllata. Lesposizione ad altre sostanze è eliminata o comunque controllata (gruppi di controllo). Studi epidemiologici. Lesposizione non può essere controllata (tranne che per i farmaci). Gli individui sono contemporaneamente esposti a molte altre sostanze o condizioni che possono influenzare leffetto tossico.

11 STUDI TOSSICOLOGICI SPERIMENTALI Studi descrittivi. Osservazione e descrizione degli effetti tossici di una sostanza in animali, tessuti, cellule isolate, batteri. Servono per caratterizzare la tossicità di una sostanza (dose tossica, organi bersaglio ecc.), soprattutto al fine della stima del rischio. Sono necessari per ottenere lautorizzazione allimmissione in commercio.

12 Studi meccanicistici. Sono gli studi che cercano di chiarire il meccanismo con cui una sostanza produce un effetto tossico (es. inibizione enzimatica, agonismo recettoriale, formazioni di composti elettrofili ecc.). Non sono richiesti ai fini regolatori ma possono essere utili per stabilire se un effetto tossico osservato nellanimale si manifesterà o meno anche nelluomo (es. pesticidi organofosforici, saccarina). Utili anche per il drug design di antidoti (es. pralidossima) o sostanze alternative più sicure. Studi teorici: relazione struttura-attività. Sono studi volti ad identificare, allinterno di una serie di molecole, i gruppi responsabili delleffetto tossico. Per alcune classi di composti, sono molto utili per prevedere la tossicità di una molecola.

13 STUDI DESCRITTIVI: STUDI ANIMALI Lo scopo è definire il profilo tossicologico valutazione del rischio nelluomo. La possibilità di utilizzare modelli animali per predire la tossicità nelluomo si basa su due principi teorici.

14 Principio 1. Gli effetti di una sostanza, osservati negli animali in opportune condizioni, possono verificarsi anche nelluomo: Cellule o tessuti di specie diverse, con funzioni e/o vie biochimiche simili hanno simile suscettibilità tossicologica, poiché posseggono lo stesso recettore (recettori di membrana e intracellulari, canali ionici, pompe e trasportatori, enzimi, DNA ecc.) Differenze di tossicità tra specie simili (mammiferi) sono molto spesso dovuti a differenze nel metabolismo (attivazione/inattivazione) della sostanza. Principi degli studi tossicologici

15 Predittività degli studi animali di 221 effetti tossici di 150 farmaci nelluomo. La concordanza totale è risultata pari al 71%.

16 In uno studio, è stata valutata la presenza di 89 effetti, indotti da 6 farmaci, in due specie, ratto e cane. Ipotesi: se leffetto era presente sia nel ratto sia nel cane effetto presente anche nelluomo. se leffetto era presente solo nel ratto o nel cane effetto assente nelluomo (effetto specie –specifico). Lipotesi è stata verificata per comparazione con i dati di tossicità nelluomo. Principi degli studi tossicologici Gli studi di tossicità devono essere effettuati in due specie animali

17 Verifica. Su 86 previsioni: 38 positive (presenti anche nelluomo): 26 corrette (concordanza 68%). 48 negative (assente nelluomo): 38 corrette (concordanza 79%). Concordanza totale (% di previsione corrette): 74% Conclusioni. Tramite i dati di tossicità di 2 specie si ottiene un alto livello di predittività, anche senza considerare i meccanismi di tossicità, metabolismo dei farmaci ecc.

18 Numerose sostanze danno una tossicità specie-specifica, sono cioè tossiche solo in una specie. Esempio: la fumonisina, una micotossina, è tossica solo nel maiale Principi degli studi tossicologici

19 Gli animali più spesso utilizzati per gli studi di tossicità generale sono ratto e cane, nei quali il metabolismo è più simile a quello umano. Per alcuni test di tossicità specifica (riproduttiva, tossicità locale) si usano altre specie di mammiferi, particolarmente sensibili a quel tipo di tossicità. Principi degli studi tossicologici

20 Specie animali non mammifere (batteri, dafnia, echinodermi, drosofila, pesci) sono eticamente più accettabili ed economicamente più vantaggiose. Tuttavia, a causa delle enormi differenze farmacocinetiche, i dati ottenuti con queste specie non possono essere estrapolati alluomo. Gli studi con queste specie possono però allertare sul potenziale tossico di una sostanza necessità di ulteriori studi. Principi degli studi tossicologici

21 Principio 2. Per identificare con sicurezza gli effetti tossici di una sostanza negli animali da laboratorio è necessario somministrare alte dosi. Luso di alte dosi è dovuto allinevitabile limitatezza del numero di animali su cui si effettuano i test. La risposta ad una data sostanza dipende infatti da: 1) dose somministrata; 2) sensibilità individuale (v. curve dose-risposta quantali). Principi degli studi tossicologici

22 Supponiamo che ad una data dose risponda lo 0,1% di individui (più sensibili). Se lesperimento viene condotto con 100 animali, la risposta non viene rilevata. Per essere ragionevolmente sicuri di osservare la risposta con quella dose, lesperimento dovrebbe essere condotto con almeno animali. Aumentando la dose, risponderà una percentuale maggiore di individui (anche quelli meno sensibili). Luso di dosi elevate (rispetto a quelle previste nelluomo) consente quindi di osservare una risposta con un numero ragionevole di animali.

23 Obiettivi degli studi tossicologici animali Natura degli effetti tossici Relazione dose-effetto (intervallo di dosi tossiche, NOEL, ipersensibilità) Fattori influenzanti la tossicità (specie, ceppo, sesso, età, modalità di somministrazione ecc.) Valutazione del rischio

24 Natura degli effetti tossici: meccanismi di tossicità Meccanismi specifici non specifici Tossine animaliComposti organici Composti e vegetali di sintesi inorganici Farmaci

25 Meccanismi specifici Interazione selettiva con specifiche proteine (enzimi, canali ionici, trasportatori ecc.) danneggiamento di funzioni cellulari specifiche tossicità cellulare e/o dorgano. In genere legame non covalente. Razionale biologico: selezionate sostanze non tossiche per lorganismo che le produce; a scopo difensivo, leffetto tossico deve essere intenso e manifestarsi a breve termine.

26 Meccanismi non specifici 1.La sostanza, o un suo metabolita reattivo (es.: radicale libero, elettrofilo), reagiscono in modo aspecifico con diversi componenti cellulari (proteine, lipidi, acidi nucleici). Si formano o si rompono legami covalenti (formazione di addotti; ossidazioni; sottrazione di atomi). Ciò causa alterato funzionamento o distruzione dei componenti cellulari colpiti tossicità cellulare tossicità di organo/sistema. In genere, non è chiaro quali dei numerosi siti di attacco cellulare siano responsabili delleffetto tossico.

27 2.Alcune sostanze modificano la composizione dei fluidi biologici: pH (acidi e basi); composizione ionica (sali, chelanti); cofattori enzimatici (deplezione, malassorbimento) concentrazione di metaboliti intermedi (stimolazione o inibizione di vie metaboliche; es.: porfiria, steatosi) Queste alterazioni causano tossicità cellulare e/o dorgano.

28 N.B.: oltre a tossine che agiscono in modo selettivo, i vegetali contengono anche molti composti che danno tossicità con meccanismo non specifico. Molti farmaci e alcuni altri composti organici di sintesi danno tossicità con meccanismo specifico.

29 Tipi di tossicità Tossicità funzionale: alterazioni delle funzioni di un sistema (nervoso, cardiovascolare, endocrino) danno dorgano. Citotossicità: alterazione irreversibile di proteine (enzimi, canali ionici ecc.) o membrane (lipidi); disregolazione del metabolismo necrosi, apoptosi tossicità tissutale e dorgano o sistema (fegato, rene, SNC ecc.). Genotossicità: alterazione del DNA mutazioni, alterazioni cromosomiche cancerogenesi, malattie congenite. Reazioni allergiche: allergeni, apteni, modificatori degli antigeni cellulari risposta immunitaria.

30 1.Alterazione delle normali funzioni cellulari senza danno cellulare diretto tossicità dorgano o sistema (tossicità funzionale) Esempi: Una sostanza che provochi vasodilatazione (es. agonista istaminergico) non causa danni diretti ai vasi ma provoca ipotensione e riduzione del flusso ematico danni cerebrali, renali ecc. Una sostanza che causa contrazione della muscolatura vasale (es. agonista adrenergico) non danneggia i vasi ma causa tossicità renale, cerebrale, cardiaca. Una sostanza che stimoli il rilascio di insulina dalle cellule pancreatiche (senza danneggiarle) causa ipoglicemia e tossicità a carico del sistema nervoso centrale (danno neuronale indiretto) Una sostanza antagonista degli ormoni sessuali può causare tossicità riproduttiva senza causare danno diretto alle cellule dellapparato riproduttivo

31 2.Danno cellulare (citotossicità). Lalterato funzionamento o la distruzione della macromolecola bersaglio provoca una danno cellulare Lentità di tale danno dipende da: importanza della funzione del componente cellulare colpito capacità di riparazione da parte della cellula (rimozione dei componenti danneggiati e loro sostituzione )

32 Se il danno è irreversibile e/o esteso e/o coinvolge componenti cellulari essenziali, si ha la morte cellulare (necrosi). Nella maggior parte dei tessuti, le cellule morte possono essere sostituite da cellule dello stesso tipo (divisione cellulare) riparazione totale del danno. N.B.: i neuroni non possono suddividersi. Se larea necrotica è estesa, si ha infiammazione e formazione di tessuti connettivi di riparazione (tessuti cicatriziali) riparazione parziale del danno (la funzionalità dellorgano è diminuita o alterata). citotossicità

33 Se linsulto cellulare non è grave, si può avere alterazione del metabolismo della cellula senza morte cellulare. In questi casi si possono avere alterazioni di: dimensioni cellulari (atrofia o ipertrofia) proliferazione e differenziazione cellulare (iperplasia, metaplasia) accumulo di componenti cellulari (es. steatosi epatica) citotossicità

34 Natura delleffetto tossico Organi bersaglio. La tossicità a carico di un organo dipende dalla capacità rigenerativa dellorgano, dalla sua dipendenza dal mantenimento dellomeostasi, da fattori tossicocinetici (sito di assorbimento, metabolismo, accumulo, eliminazione). Gli organi più frequentemente colpiti sono: SNC, sistema ematopoietico, fegato, rene, polmone, cute. Obiettivi degli studi tossicologici

35 Comparsa delleffetto. Tossicità immediata (citotossicità, tossicità funzionale). Tossicità ritardata (genotossicità, tossicità funzionale). Reversibilità delleffetto. Dipende dal tipo di tossicità e dallorgano bersaglio. Natura delleffetto Obiettivi degli studi tossicologici

36 Relazione dose-effetto. Curve dose-risposta Forma della curva. Pendenza della curva. Dose efficace 50 (DE50). E la dose con la quale si ha: una risposta pari al 50% delleffetto massimo (curve dose-risposta graduali) una risposta nel 50% dei soggetti (curve dose-risposta quantali) Dose soglia. E la dose al di sotto della quale non si manifesta tossicità. Dipende dal tipo di tossicità in esame. E la base per estrapolare i limiti di sicurezza. DE50 e dose soglia sono una misura della potenza di un tossico. Obiettivi degli studi tossicologici

37 Fattori influenzanti la tossicità Specie animale Ceppo Differenze di tossicità in diversi ceppi di ratto Obiettivi degli studi tossicologici

38 Modalità di somministrazione La tossicità di una sostanza è funzione di: DOSExESPOSIZIONE Via di Durata Frequenza esposizione Fattori influenzanti la tossicità Obiettivi degli studi tossicologici

39 Via di esposizione. In genere, la tossicità di una sostanza dipende dalla via di somministrazione. Lordine di tossicità è: endovenosa, inalatoria, intraperitoneale, sottocutanea, intramuscolare, orale, cutanea. Negli studi di tossicità acuta si utilizzano due vie (farmaci), di cui una è quella prevista nell'uomo. Negli studi di tossicità prolungata e cronica si usa quasi sempre la via orale. Fattori influenzanti la tossicità Obiettivi degli studi tossicologici

40 Durata e frequenza dellesposizione In generale, la tossicità di una determinata dose aumenta allaumentare della durata e della frequenza dellesposizione, a causa di due fenomeni: accumulo del tossico nellorganismo; si ha quando la velocità di somministrazione (frequenza) è maggiore della velocità di eliminazione e la durata è tale che il tossico raggiunge livelli dannosi. accumulo del danno; la velocità di somministrazione (frequenza) è maggiore della velocità di riparazione del danno da parte dellorganismo. Fattori influenzanti la tossicità Obiettivi degli studi tossicologici

41 Se la frequenza di somministrazione è tale che la velocità di somministrazione è maggiore della velocità di eliminazione accumulo del tossico e raggiungimento dello stato stazionario. Il raggiungimento dello stato stazionario dipende dallemivita del tossico e dalla frequenza di somministrazione. Per aversi stato stazionario, il tossico deve essere somministrato ad intervalli di tempo inferiori a 5 emivite. E quindi importante conoscere lemivita del tossico per prevedere lentità dellesposizione. Obiettivi degli studi tossicologici Fattori influenzanti la tossicità

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43 Si può avere accumulo del danno anche senza accumulo del tossico. Infatti il tempo di recupero del danno è spesso maggiore del tempo necessario alleliminazione del tossico dallorganismo. Ad es., la somministrazione di etanolo causa deposito di lipidi nel fegato (steatosi); il tempo necessario per la scomparsa dei depositi di grasso epatici è molto più lungo di quello necessario alleliminazione delletanolo. Fattori influenzanti la tossicità Obiettivi degli studi tossicologici

44 In alcuni casi, la tossicità cronica è dovuta a deplezione di cofattori detossificanti. Es.: tossicità cronica da cianuro per deplezione di tiosolfato. La tossicità cronica è anche funzione di: tolleranza farmacodinamica (es. anticolinesterasici) tolleranza farmacocinetica (induzione enzimatica) Fattori influenzanti la tossicità Obiettivi degli studi tossicologici

45 Tolleranza agli inibitori dellAcetilcolinesterasi (AChE): down-regulation recettoriale Soggetti esposti ripetutamente a dosi subletali di inibitori dellAChE sviluppano tolleranza a successive somministrazioni.

46 Per definire una dose tossica, un intervallo di dosi tossiche, è necessario indicare la durata dellesposizione. Frequenza: negli studi prolungati, la sostanza viene in genere aggiunta al cibo (o allacqua) frequenza di somministrazione elevata. In caso di somministrazione parenterale, in genere 1 somministrazione/giorno. Fattori influenzanti la tossicità Obiettivi degli studi tossicologici

47 Controlli. Sia per gli studi subcronici che cronici è necessario avere un gruppo di controllo, per: incidenza di effetti (patologie) non indotti dalla sostanza (fattori congeniti e/o ambientali) comparazione statistica. Fattori influenzanti la tossicità Obiettivi degli studi tossicologici

48 Tipi di studi di tossicità Tossicità generale Tossicità specifica: teratogenesi, riproduttiva, mutagenesi, cancerogenesi, immunitaria, locale, comportamentale

49 Studi di tossicità generale: acuta: singola somministrazione; a breve termine (dosi ripetute): giorni; prolungata (10-25 % della vita dellanimale, subcronica): 3-6 mesi (nel ratto) cronica (> 50% della vita): 1-2 anni nel ratto (in genere studi di cancerogenesi)

50 In termini di esposizione umana: gli studi acuti rappresentano lesposizione dovuta ad incidenti o a sovradosaggi accidentali o volontari. gli studi subcronici rappresentano lesposizione (a livelli più bassi di quelli dovuti ad incidenti) frequente a sostanze di uso professionale (es. solventi) o domestico (es. detergenti), a additivi alimentari, farmaci e inquinanti ambientali; gli studi cronici rappresentano giornaliera, per tutta la vita, di additivi alimentari, residui di pesticidi nel cibo e nellacqua ecc.

51 Studi di tossicità acuta Singola somministrazione (o più somministrazioni in 24 ore). Osservazioni fino a 14 giorni dalla somministrazione: mortalità, segni clinici di tossicità. Sono richiesti dalle Autorità Regolatorie per nuovi farmaci, sostanze chimiche, pesticidi. tossicità acuta

52 Obiettivi: Curve di letalità e relativi parametri: Dose Letale 50 (DL50: è la dose che determina la morte del 50% degli animali trattati), pendenza della curva di letalità. La DL50 fornisce una stima quantitativa della potenza tossica della sostanza (DL50 o intervallo in cui cade la DL50; es mg/kg) indicazioni sulla tossicità acuta nelluomo (intossicazione accidentale o volontaria, sovradosaggio) limiti e precauzioni. tossicità acuta

53 Classificazione UE (Etichettatura delle Sostanze pericolose) DL50 orale, ratto (mg/kg) DL50 cutanea, ratto o coniglio (mg/kg) CL50 inalatoria ratto (mg/lt/4 ore) Classe di tossicità ,5 Molto tossico – 4000,5 – 2 Tossico 200 – – Nocivo Sostanze con DL50 maggiori non hanno bisogno di etichettatura. La classificazione impone precauzioni nella lavorazione, trasporto ecc. delle sostanze.

54 Identificazione degli organi/sistemi bersaglio (N.B. gli organi bersaglio della tossicità acuta possono essere diversi da quelli della tossicità cronica; es: anestetici alogenati). Curve dose- risposta per effetti tossici a carico di specifici organi/sistemi. Dosi soglia: NOEL (No Observed Effect Level: massima dose a cui non si osserva effetto); LOEL (Lowest Observed Effect Level: minima dose a cui si osserva un effetto). tossicità acuta

55 N.B.: le curve dose-risposta variano con leffetto tossico osservato anche le dosi soglia variano.

56 Tempo di comparsa delleffetto: tossicità immediata o ritardata. Eventuale reversibilità delleffetto e tempo di recupero. tossicità acuta

57 Curve di letalità; determinazione della DL50 e della pendenza della curva. Studi classici. Somministrazione di dosi pre- fissate, con rapporto costante tra dosi successive (es: D2/D1=2). Almeno 3 dosi devono dare letalità nella parte rettilinea della curva. Si calcola la pendenza della curva e si estrapola la DL50. In genere utilizzate 4 o più dosi, somministrate a gruppi di 10 animali (di entrambi i sessi) per dose (in media 50 animali per determinare la DL50).

58 Successivamente, si sono sviluppati disegni sperimentali che consentono di ridurre notevolmente il numero di animali. Ad es., un animale riceve una prima dose: se lanimale muore, si somministra ad un secondo animale una dose minore (ridotta di un fattore costante); se il primo animale non muore, si somministra al secondo animale una dose maggiore (aumentata di un fattore costante). Si procede fino a testare 5 animali. Si effettua una stima della DL50 con metodi statistici Con questo disegno sequenziale occorrono in media 6-9 animali per determinare la DL50.

59 Altri tipi di disegni sperimentali non hanno come endpoint la morte. Es.: Tossicità acuta a dose fissa: si somministrano dosi pari a 5, 50, 200, 2000 mg/kg. Si osserva la comparsa di segni evidenti di tossicità. Test limite: si pre-determina una dose limite (in genere sulla base della prevedibile esposizione umana o ambientale); se non si osserva mortalità a quella dose DL50> dose limite. Con qualsiasi disegno sperimentale, non ha senso testare dosi orali>5 g/kg, dosi cutanee> 2 g/kg, dosi inalatorie > 50 mg/m 3. tossicità acuta

60 Effetti tossici a carico di organi/sistemi. Si rilevano mediante analisi ed osservazioni dei segni clinici. Analisi. Ematologia: ematocrito, conta eritrocitaria, conta leucocitaria, emoglobina Analisi chimico-cliniche sul sangue (elettroliti, glucosio, azotemia, transaminasi, proteine, bilirubina) e sulle urine (pH, proteine, sedimento, glucosio, corpi chetonici ecc.) tossicità acuta

61 Esame anatomoistopatologico di organi Lesioni macroscopicheFegato Gangli linfaticiCistifellea Ghiandole mammariePancreas Ghiandole salivariMilza Costole, FemoreReni Vertebre (compreso midollo osseo)Surreni IpofisiVescica TimoProstata TracheaTesticoli PolmoniOvaie CuoreUtero TiroideCervello EsofagoOcchi Stomaco, Intestino tenue, Colon Midollo spinale

62 Segni clinici Sistema Nervoso: tremore, eccitazione, sedazione, riflessiSistema Nervoso: tremore, eccitazione, sedazione, riflessi Cardiovascolare: frequenza cardiaca, aritmie; Vasodilatazione/costrizione; ipertermia/ipotermiaCardiovascolare: frequenza cardiaca, aritmie; Vasodilatazione/costrizione; ipertermia/ipotermia Respiratorio: apnea, dispnea, cianosi ecc.Respiratorio: apnea, dispnea, cianosi ecc. Digestivo: vomito, costipazione, diarreaDigestivo: vomito, costipazione, diarrea Urogenitale: diuresi, anuria, poliuriaUrogenitale: diuresi, anuria, poliuria Cute e annessi: piloerezione, edema, eritema, alopecia, necrosi ecc.Cute e annessi: piloerezione, edema, eritema, alopecia, necrosi ecc. tossicità acuta

63 Periodo di osservazione: deve essere adeguato a mettere in luce i danni ai tessuti e agli organi (tossicità immediata o ritardata) e leventuale ritorno delle condizioni dellanimale alla norma (reversibilità delleffetto); la durata è abitualmente di 14 giorni, e comunque mai inferiore a 7 giorni e può proseguire per tutto il tempo in cui persistono i segni di tossicità. Durante questo periodo si compiono le osservazioni (animali morti, segni di tossicità, analisi sangue e urine). Alla fine, si esegue lautopsia su tutti gli animali. tossicità acuta

64 Specie animali Ai fini regolatori, sono in genere richieste prove su almeno due specie di mammiferi, di ceppo noto. In genere sono utilizzati ratto e topo. Via di somministrazione In genere richieste due vie di somministrazione, di cui una è quella prevista nelluomo (orale, inalatoria, cutanea) ed una assicuri assorbimento completo (parenterale). tossicità acuta

65 Esempio di esame istopatologico

66 Studi di tossicità generale dopo esposizioni ripetute Permettono di evidenziare: effetti tossici che occorrono, a dosi più basse di quelle degli studi acuti, per accumulo del tossico e/o accumulo del danno; effetti tossici ritardati (cancerogenesi, neuropatia ritardata da organofosforici ecc.). Leffetto osservato non è la mortalità ma la morbilità. Le dosi usate sono notevolmente più basse di quelle usate negli studi di tossicità acuta.

67 Lorgano bersaglio della tossicità prolungata può essere diverso di quello della tossicità acuta (es. etanolo). Anche se lorgano bersaglio è lo stesso, gli effetti cronici sono diversi da quelli acuti. tossicità da esposizioni ripetute

68 Effetti acuti e cronici a carico di alcuni sistemi Gli effetti dellesposizione cronica possono manifestarsi come patologie spontanee (es. tumori, diabete ecc.), anche nelluomo.

69 Studi di tossicità generale dopo esposizioni ripetute: a breve termine (dosi ripetute, subacuta): 7-28 giorni; prolungata o subcronica (10-25 % della vita dellanimale): 3-6 mesi (nel ratto) cronica (> 50% della vita): 1-2 anni nel ratto (in genere studi di cancerogenesi) tossicità da esposizioni ripetute

70 La durata degli studi dipende dallesposizione prevista nelluomo. Per i farmaci: Durata del trattamentoDurata degli studi di tossicità 1 giorno (una o più dosi)2 settimane (subacuta) 7 giorni 4 settimane (subacuta) 30 giorni tre mesi (subcronica) > 30 giorni6 mesi (cronica) 6 mesi e più (anche non continuativi;es. farmaci per allergie stagionali, ansiolitici) anche studi di cancerogenesi (18-24 mesi) tossicità da esposizioni ripetute

71 Studi di tossicità subcronica (10-25 % della vita dellanimale, 3-6 mesi nel ratto): consentono di evidenziare quasi tutti gli effetti tossici dovuti ad esposizione prolungata; la loro predittività si è dimostrata uguale a quella di studi di più lunga durata (cronici, 1-2 anni nel ratto), tranne che per gli effetti cancerogeni. tossicità da esposizioni ripetute

72 Tempo di comparsa di effetti tossici (non cancerogeni) da farmaci in studi animali totale: 100% tossicità da esposizioni ripetute

73 Obiettivi: determinare natura degli effetti tossici ed organi bersaglio determinare NOEL e LOEL Limiti di esposizione e precauzioni tossicità da esposizioni ripetute

74 Dosi. Per determinare NOEL e LOEL, si utilizzano si (almeno) tre dosi: una dose che determini la comparsa di tossicità; una che non produca effetti tossici; una dose intermedia. Studi di tossicità subcronica

75 Somministrazione: si evita, per quanto possibile, di usare vie di somministrazione traumatiche (sondino gastrico, iniezioni); la via più usata è quella orale, con la sostanza mescolata nel cibo o nellacqua.

76 Osservazioni. 1) In vivo Segni clinici (v. prima) Peso corporeo, consumo di cibo e acqua: una diminuzione del peso è un sintomo generale di tossicità; può essere dovuta a riduzione dellassunzione di cibo; lassunzione di acqua permette di identificare effetti diuretici.

77 Analisi ematologiche: consentono di individuare effetti tossici sul sistema ematopoietico. Analisi chimico cliniche: mirate, possono consentire di individuare specifiche tossicità dorgano (es. fegato) Analisi delle urine. Volume: effetti sulla diuresi, disidratazione; osmolarità: abilità del rene di concentrare le urine; glucosio: diabete; colorazione-torbidità: ematuria, emoglobinuria, formazione di calcoli.

78 Osservazioni post-mortem. Necropsia per alterazioni morfologiche evidenti degli organi Peso degli organi Analisi istologica Servono per identificare organo bersaglio, regione colpita, tipo di tossicità

79 Specie animali Per i farmaci,in genere sono richiesti studi su almeno 2 specie, di cui una non roditore. La specie non roditore viene scelta sulla base della risposta: più possibile simile a quella nelluomo (cane, scimmia); oppure specie più sensibile ad effetto tossico. es.: conigli per studi di irritazione cutanea e teratogenesi; cavia per studi di tossicità immunologica.

80 Gli studi di tossicità cronica (>50% della vita, 1-2 anni nel ratto) servono per: per composti (es. additivi alimentari, contaminanti di alimenti ed acqua) per i quali si può supporre unesposizione controllabile nelluomo per tutta la vita, gli studi di tossicità cronica a 2 anni (nel ratto) forniscono una stima più affidabile dei limiti di esposizione accettabili (es. ADI) nelluomo. Le dosi sono scelte in base allesposizione prevista nelluomo. studi di cancerogenesi (2 anni nel ratto)

81 Controlli. Sia per gli studi subcronici che cronici è necessario avere un gruppo di controllo, perché: diversi effetti tossici (patologie) si sviluppano spontaneamente (soprattutto tumori); per assicurare che gli effetti osservati siano dovuti alla sostanza e non a fattori ambientali e/o sperimentali.

82 Metodologie I risultati degli studi possono dipendere dalle modalità sperimentali. Studi sulla stessa sostanza, condotti da gruppi diversi, possono fornire risultati diversi, a volte contrastanti. Ciò rende difficile la valutazione del rischio.

83 Sostanza somministrata. Contenuto in principio attivo e impurezze; variabilità interlotto; stabilità e condizioni di conservazione. metodologie sperimentali

84 Via di somministrazione Gli effetti ottenuti con una via di somministrazione non sono a priori applicabili ad altre vie. E importante utilizzare la via di esposizione prevista nelluomo. metodologie sperimentali

85 Es.: lamianto è molto tossico (cancerogeno) per via inalatoria ma relativamente non tossico se somministrato per via orale.

86 Via orale (per os); è la più semplice e quindi la più utilizzata. La sostanza viene mescolata al cibo o aggiunta allacqua. Occorre verificare compatibilità, stabilità e accettabilità. Vie parenterali (iniettive). Sono in genere limitate a studi acuti o a breve termine, per i possibili danni e lo stress causato dalle somministrazioni. metodologie sperimentali

87 Specie: una o più specie, con metabolismo dello xenobiotico simile alluomo (necessari studi preventivi o conoscenze su metabolismo di composti strutturalmente correlati). Ceppo: vi possono essere ceppi particolarmente sensibili o particolarmente resistenti, per fattori metabolici (sovra-espressione o carenza di particolari enzimi). Condizioni di stabulazione. E importante che gli animali siano stabulati in condizioni ottimali e controllate di temperatura, umidità relativa, ciclo luce/buio. Cibo ed acqua devono rispondere a standard di qualità. metodologie sperimentali

88 Controlli negativi: importanti soprattutto per effetti con bassa incidenza o gravità e per effetti che si manifestano spontaneamente. Controlli positivi: per verificare la sensibilità della specie e del ceppo e la correttezza dei metodi, in alcuni tipi di studi (es. cancerogenesi) si possono utilizzare i controlli positivi, animali trattati con una sostanza che causa sicuramente leffetto tossico studiato. metodologie sperimentali

89 Statistica. I test statistici consentono di verificare, con un determinato grado di probabilità, se la differenza osservata (tra trattati e controlli) è dovuta al caso o al trattamento. Il numero di animali dovrebbe essere pre-determinato in base allentità della differenza e delle variabilità previste. N.B.: uno studio può dare un risultato statisticamente significativo ma biologicamente poco importante (v. DBP). Viceversa, risultati statisticamente non significativi (per esiguità del numero di animali o altre cause sperimentali) ma con grande importanza biologica potenziale necessità di ulteriori studi. metodologie sperimentali


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