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Acetilazione Lenzima N-acetiltransferasi (NAT) catalizza lacetilazione di ammine aromatiche ed idrazine riduzione dellidrofilia. Esistono 2 forme di NAT.

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1 Acetilazione Lenzima N-acetiltransferasi (NAT) catalizza lacetilazione di ammine aromatiche ed idrazine riduzione dellidrofilia. Esistono 2 forme di NAT (nelluomo), NAT 1 (monomorfa?) e NAT2 (polimorfa). Il donatore di gruppi acetile è lacetilCoA

2 Detossificazione vs. attivazione metabolica La NAT può sia attivare che detossificare i suoi substrati Es.: idrazina acetilidrazina acetilidrazina NAT ossidata diacetilidrazina (stabile) metabolita reattivo tossico Ammine aromatiche La NAT è detossificante perché impedisce lossidazione da parte di PHS ed altri enzimi (es. 2- naftilammina).

3 Tuttavia, se lammina viene N-idrossilata (da CYP450) prima di essere acetilata, la NAT può, in questo caso, catalizzare una O-acetilazione. Il gruppo acetossi che si forma è un buon gruppo uscente. Si può formare uno ione nitrenio, elettrofilo altamente reattivo.

4 La tossicità dei substrati delle NAT dipende quindi da: struttura della molecola fenotipo acetilante attività degli enzimi ossidativi (es. CYP1A2)

5 Coniugazione con amminoacidi. Due tipi di reazione 1.Xenobiotico con gruppo acido carbossilico si legano al gruppo amminico degli a.a. (glicina, taurina, glutammina). La coniugazione può aumentare lescrezione renale da parte dei sistemi di trasporto tubulari. Questa reazione è sempre detossificante; alternativa alla glucuronidazione (che può portare ad acilglucuronidi reattivi; es. FANS, ibuprofen)

6 2.Idrossilammine aromatiche + gruppo acido di a.a. (serina, prolina) ammidi che possono formare gli ioni nitronio, fortemente reattivi. Le idrossilammine che si formano per N- idrossilazione, da parte di CYP450, delle ammine aromatiche, possono essere attivate da diverse reazioni di fase II (glucuronidazione, O- acetilazione, O-solfatazione, coniugazione con a.c.)

7 Coniugazione con glutatione Un ampio spettro di substrati da reazioni di coniugazione con il glutatione, con meccanismi diversi: Elettrofili (carboni fenilici e allilici): R-X + GS - R-S-G (tioetere) + X - X = (Cl, NO2, SO4, PO4) GS - può anche addizionarsi a composti insaturi (alcheni, chetoni) La coniugazione con GSH può detossificare molti composti elettrofili formatisi in fase I (epossidi, chinoni, chinoneimmine ecc.) GS- può anche dare reazioni di sostituzione con eteroatomi (O, N, S); es., nitroglicerina

8 Le reazioni possono avvenire spontaneamente (elevata concentrazione cellulare di GSH) oppure essere catalizzate (maggiore velocità) dalla Glutatione-S-transferasi (GST). La GST è un enzima ampiamente diffuso (fegato, reni, intestino, polmoni), molto abbondante nelle cellule (fino al 10% delle proteine totali). Esistono 4 classi solubili e 2 microsomiali di GST; almeno alcune di queste sono inducibili

9 Molto importante nella detossificazione di metaboliti reattivi formatisi nelle reazioni di fase I e II. La resistenza a xenobiotici tossici è spesso associata a sovraespressione della GST: insetti resistenti a DDT piante resistenti ad atrazina cellule tumorali resistenti a chemioterapici

10 Differenze interspecie nellattività GST differenze interspecie nella tossicità Es.: aflatossina B1 cancerogena nelluomo e nel ratto ma non nel topo, che ha alti livelli di una forma di GST. Differenze interindividuali. Sono stati individuati polimorfismi genetici per due delle forme di GST umana (GST Mu1 e GST Tau1). Nei caucasici, circa metà della popolazione non esprime GST Mu1. Questi individui hanno un rischio più elevato di cancro colo-rettale e potrebbero essere più sensibili al tumore polmonare indotto dal fumo.

11 Tossicità dei GSH coniugati 4 meccanismi; 3 riguardano alogeno derivati alchilici, che formano reattivi elettrofili formazione di cistein-derivati di chinoni riduzione del potenziale redox facilitazione dellossidazione a chinoni e formazione di policistein-derivati dei chinoni ulteriore riduzione del potenziale di ossidazione alchilazione di proteine; ciclo redox, con formazione di ROS (radicale. OH) nefrotossicità: necrosi tubulare e cancerogenesi (es. bromobenzene, p-aminofenolo, idrochinone)

12 Induzione enzimatica Numerosi agenti (farmaci, xenobiotici di sintesi e naturali, alimenti) possono indurre laumento della sintesi degli enzimi metabolizzanti, sia di fase I che di fase II. Gli induttori possono essere suddivisi in classi, in dipendenza del pattern di induzione. Alcune classi inducono un aumento della sintesi di numerosi enzimi metabolici. Altre classi sono induttori più selettivi; in genere, comunque, un induttore stimola la sintesi di più di un enzima metabolizzante.

13 Induttori ad ampio spettro come il fenobarbital determinano unipertrofia epatica e proliferazione del reticolo endoplasmatico aumento generalizzato della sintesi proteica nel fegato (regione centro-lobulare) aumento di numerosi enzimi metabolizzanti. Idrocarburi policiclici aromatici (IPA): inducono laumento della sintesi di alcuni isozimi CYP450 (soprattutto CYP1A1), con elevata capacità catalitica verso gli induttori, e, in misura minore, di altri enzimi (epossido idrolasi, UDP-glucurunosiltransferasi, glutatione-S- transferasi). Altri induttori importanti sono: pesticidi alogenati (DDT, esaclorobenzene ecc.); policlorobifenili (PCB) e polibromobifenili (PBB); diossine clorurate (in particolare TCDD); steroidi.

14 E stata proposta la classificazione degli induttori in 2 classi, in dipendenza degli enzimi indotti e del meccanismo dellinduzione: 1.Induttori bifunzionali (TCDD, IPA e altri): inducono sia enzimi di fase I che enzimi di fase II; 2.Induttori monofunzionali (difenoli, tiocarbammati, isotiocianati ed altri): inducono prevalentemente enzimi di fase II (glutatione- S-transferasi, UDP-glucuronosiltransferasi) e la DT diaforasi (o NADPH-chinone reduttasi, che viene assimilata agli enzimi di fase II per il suo effetto detossificante).

15 Meccanismi dellinduzione enzimatica 1.Induzione mediata da recettori intracellulari, denominati tipo Ah (Aromatic Hydrocarbon); questo recettore è un fattore di trascrizione capace di legare il DNA in una regione denominata XRE (Xenobiotic Responsive Element), che contiene i geni che codificano per diversi enzimi metabolizzanti. Il legame dellinduttore con il recettore Ah causa la sua dissociazione dalle HSPs e la traslocazione nel nucleo (mediata da una proteina chiamata ARNT, Ah Receptor Nuclear Translocation); il complesso induttore-Ah- ARNT si lega alla XRE modulazione della sintesi proteica. Gli induttori bifunzionali utilizzano questo meccanismo mediato dal recettore Ah

16 Meccanismo di induzione mediato dal recettore intracellulare Ah. Alcuni isozimi CYP450 possono essere indotti in seguito allattivazione di altri recettori intracellulari (PXR, Pregnane Xenobiotic Receptor)

17 Gli induttori monofunzionali stimolano lespressione genica indipendentemente dal recettore Ah. Il meccanismo di induzione dipende dalla presenza di centri elettrofili (che possono essere acquisiti con il metabolismo). Molte piante della famiglia delle Crucifere, in particolare il genere Brassica, sono induttori monofunzionali. Queste piante contengono glucosinati, i cui metaboliti (indoli, isotiocianati) sono induttori monofunzionali protezione dagli effetti genotossici di alcuni carcinogeni (IPA) negli animali da esperimento. Risultati contrastanti nelluomo.

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19 Esistono altri meccanismi di induzione: ad es. aumenta la concentrazione epatica di CYP2E1, apparentemente tramite un rallentamento della sua degradazione.

20 Cinetica dellinduzione enzimatica Linduzione richiede in genere lesposizione ripetuta allinduttore; leffetto aumenta progressivamente. Leffetto di induttori che stimolano la sintesi degli enzimi si mantiene a lungo (giorni-settimane, dipende dal turn-over degli enzimi indotti) dopo la sospensione dellesposizione, anche dopo che linduttore è stato completamente eliminato dallorganismo.

21 Un farmaco induttore, il fenobarbital, causa la diminuzione della concentrazione plasmatica di un altro farmaco, il dicumarolo. Notare che leffetto del fenobarbital, dopo il primo periodo di trattamento, permane per circa 30 giorni

22 Farmaci: aumento della velocità di inattivazione dellinduttore stesso (autoinduzione) e/o di altri farmaci, somministrati contemporaneamente diminuzione delle concentrazioni plasmatiche medie diminuzione dellefficacia rischio di insuccesso terapeutico (es. autoinduzione degli antiepilettici; rifampicina-anticoncezionali; rifampicina-ciclosporina; iperico-inibitori proteasi virali ecc.) Effetti dellinduzione enzimatica

23 Effetto dellinduttore enzimatico rifampicina sulle concentrazioni plasmatiche di chinidina.

24 Tossici che agiscono con meccanismo specifico, mediato dallinterazione con recettori diminuzione della tossicità (es. riduzione della tossicità degli inibitori organofosforici dellAChE). Composti attivati a metaboliti tossici (che agiscono con meccanismo non specifico) linduzione può aumentare o diminuire la tossicità, in dipendenza delleffetto complessivo dellinduttore sullattività degli enzimi attivatori e degli enzimi detossificanti.

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26 Composti endogeni: aumento delleliminazione possibili stati carenziali. Es., osteomalacia da antiepilettici per aumento della formazione del 25-idrossiderivato della vitamina D, inattivo. possibile risposta omeostatica dellorganismo con conseguenze dannose. Es. aumento delleliminazione della tiroxina per aumento della sua coniugazione con acido glucuronico aumento dei livelli di TSH neoplasie follicolari (nel ratto).

27 Inibizione enzimatica Gli inibitori enzimatici agiscono diminuendo la trasformazione metabolica di altri xenobiotici da parte dellenzima inibito, senza modificare la sintesi proteica*. Gli inibitori sono in genere più selettivi degli induttori poiché inibiscono solo un enzima (o un isozima) o isozimi strettamente correlati. * gli inibitori della sintesi proteica (in generale) possono essere considerati inibitori enzimatici

28 Esistono diversi meccanismi di inibizione: Inibitori reversibili: sono substrati dellenzima ed inibiscono quindi la metabolizzazione di altri composti per competizione (inibitori competitivi). Alcuni inibitori modificano lattività catalitica dellenzima legandosi a siti allosterici (inibitori non competitivi). Inibitori irreversibili: sono in genere inibitori suicidi, che vengono trasformati dallenzima in composti che si legano in modo covalente allenzima, inattivandolo permanentemente.

29 Altri inibitori irreversibili non necessitano di attivazione da parte dellenzima ma formano complessi inattivi con lenzima (es. triacetiloleandomicina) Meccanismo dellinibizione suicida

30 Inibizione delle reazioni di fase II per impoverimento dei cofattori. Alcuni composti causano un impoverimento dei cofattori necessari alle reazioni di fase II. Ad es., alcune sulfoximine si coniugano con il glutatione riducendone i depositi tissutali inibizione della reazione di coniugazione con GSH.

31 Cinetiche dellinibizione enzimatica (inibitori reversibili) Linibizione si instaura immediatamente, in seguito alla prima somministrazione dellinibitore. Linibizione scompare quando linibitore viene eliminato dallorganismo.

32 Conseguenze dellinibizione enzimatica Farmaci: diminuzione delleliminazione metabolica aumento della concentrazione plasmatica del farmaco inibito possibile raggiungimento di livelli tossici (es. ketoconazolo- terfenadina). Tossicità cardiaca (aritmie)

33 Effetto dellinibitore enzimatico Ritonavir sulla concentrazione plasmatica di Saquinavir

34 Analogamente, gli inibitori aumentano la tossicità di sostanze tossiche di per sé (tossici diretti). Nel caso di formazione di metaboliti reattivi tossici, linibizione enzimatica riduce la tossicità dovuta ai metaboliti. Es., gli inibitori del CYP2E1 (es. disulfiram) riducono la tossicità di CCl 4 e paracetamolo.

35 Altri fattori che influenzano la capacità metabolica individuale Età: la capacità metabolica (in generale) è bassa alla nascita, aumenta fino ad un massimo nelletà adulta per poi decrescere in vecchiaia. Fattori patologici. Malattie epatiche (cirrosi, epatopatia alcolica, apatiti, epatomi): due effetti contrastanti: 1) diminuzione della capacità metabolizzante, soprattutto del metabolismo ossidativo (anche per alterazioni del flusso ematico); 2) ipoalbuminemia (lalbumina viene prodotta nel fegato) aumento della quota di farmaco non legata aumento della velocità del metabolismo. Leffetto globale dipende dallentità del legame allalbumina e dal coefficiente di estrazione epatico effetto poco prevedibile.

36 Dieta. Presenza di induttori (es. IPA da combustione, Brassicacee ecc.) o inibitori (es. flavonoidi del succo di pompelmo). Stati carenziali di minerali presenti negli enzimi (Fe, Cu, Zn) o che ne regolano lattività (Ca, Mg). Stati carenziali di vitamine (C, E, gruppo B): diminuzione di cofattori enzimatici; alterazione dello status energetico e redox delle cellule.


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