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Disordini genomici strutturali e submicroscopici Vincenzo Nigro Dipartimento di Patologia Generale Seconda Università degli Studi di Napoli Telethon Institute.

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1 disordini genomici strutturali e submicroscopici Vincenzo Nigro Dipartimento di Patologia Generale Seconda Università degli Studi di Napoli Telethon Institute of Genetics and Medicine (TIGEM)

2 portatori di un rischio riproduttivo indipendente dal partner portatori di una traslocazione cromosomica bilanciata (reciproca) scambio di materiale genetico tra cromosomi non omologhi non vi è modificazione della dose genica frequenza 1/520 nati fenotipicamente normale traslocazione reciproca

3 traslocazioni bilanciate lo scambio di segmenti cromosomici avviene senza perdita di alcuna informazione genetica nessuna regione cromosomica è assente, ma è solo trasferita su un altro cromosoma ma un gene di fusione tra due geni altrimenti separati, un evento che è comune nelle cellule maligne traslocazione reciproca

4 traslocazioni bilanciate (meiosi e fertilizzazione) Traslocazione bilanciata Normale Traslocazione Trisomia Segregazione alternata Segregazione adiacente 1 Segregazione adiacente 2 La formazione di tetravalenti aiuta a capire: solo con la segregazione alternata si formano gameti normali o con traslocazione bilanciata, mentre le segregazioni adiacenti 1 e 2 portano alla traslocazione sbilanciata o alla trisomia

5 traslocazioni robertsoniane (rob) coinvolgono i cromosomi acrocentrici 13, 14, 15, 21 e 22 nessuna regione cromosomica è assente, perché questi contengono un braccio corto privo di geni che può risultare perduto con la fusione dei bracci q di due cromosomi acrocentrici La più frequente traslocazione Robertsoniana è la rob(13q14q) che rappresenta il 75% di tutte le rob segue poi la rob(14q21q) e la rob(21q21q) si formano in genere durante la meiosi femminile e comportano infertilità maschile o abortività ripetuta. rob

6 Percentuale alla nascita di figli con cariotipo sbilanciato da genitori con traslocazione robertsoniana t(13;14) M=F 1% t(14;21) F 15% M 2% t(21;22) F 10% M 5% t(21;21) M=F 100%

7 Traslocazione sbilanciata maggiori sono le dimensioni cromosomiche, minore è la possibilità di una gravidanza a termine minori sono le dimensioni, maggiore è il rischio di un feto malformato Sesso del genitore donna>uomo (gli spermatozoi hanno il 7.5% di difetti contro l1% degli oociti, ma sono selezionati) Il rischio aumenta se il difetto è stato accertato a partire da un figlio precedente con cariotipo sbilanciato

8 rischio alla nascita di figli con cariotipo sbilanciato Se non vi sono stati casi in famiglia e la madre è eterozigote per una traslocazione reciproca il rischio è il 7% Se non vi sono stati casi in famiglia e il padre è eterozigote per una traslocazione reciproca il rischio è il 3% Se vi sono stati casi di traslocazioni sbilanciate in famiglia e la madre è eterozigote il rischio è il 14% Se vi sono stati casi di traslocazioni sbilanciate in famiglia e il padre è eterozigote il rischio è l8%

9 inversioni Le inversioni sono rare (meno di 1 caso su 1000) e a volte difficili da mettere in evidenza Possono essere semplici quando comprendono due punti di rottura su di un singolo cromosoma Sono pericentriche quando il segmento invertito contiene il centromero (es: 46, XX inv(3)p25q21) Le inversioni pericentriche dei cromosomi 1, 9, 16 e Y sono eteromorfismi citogenetici di normale riscontro in soggetti sani Le inversioni sono dette paracentriche se confinate ad uno dei due bracci (es: 46,XX. Inv(11)q21q23) Leterozigote per uninversione è un soggetto normale.

10 coppia con familiarità per anomalie cromosomiche è indicazione allesecuzione di un cariotipo fetale e lestensione dellindagine ai parenti traslocazioni X-autosoma –maschi sterili, femmine inattivano la X normale traslocazioni robertsoniane –non 21 60% cariotipo bilanciato –21 15% rischio di Down, se è eterozigote la madre 1% se è eterozigote il padre inversioni –pericentriche varianti dell1, 9, 16 e Y, in altri casi il rischio è 5-10% –paracentriche, rischi inferiore allo 0.5%

11 donna eterozigote per una traslocazione bilanciata X-autosoma

12

13 disordine genomico submicroscopico un disordine genomico submicroscopico è una patologia causata da acquisizione perdita alterazione di uno o più geni contigui le cui variazioni di dosaggio possono produrre effetti fenotipici La base molecolare è rappresentata da riarrangiamenti genomici, quali duplicazioni, delezioni, inversioni, senza alterazioni apparenti del cariotipo (<5Mb)

14 dominanza e recessività in genetica, il carattere (o lallele) è dominante se leterozigote è indistinguibile dallomozigote in medicina la malattia è: –dominante: fenotipo clinicamente manifesto con 1 allele mutato –recessiva: fenotipo clinicamente manifesto con 2 alleli mutati (omozigote o eterozigote composto)

15 La maggior parte dei geni autosomici si trova nella condizione A o C: il dosaggio genico critico è <50%. In tal caso, si osserva un fenotipo patologico solo se entrambi gli alleli sono colpiti I geni autosomici responsabili della patogenesi dei disordini genomici si trovano nella condizione B o D: si osserva un fenotipo già in eterozigosi per aploinsufficienza. Spesso anche un dosaggio genico aumentato >>100% può determinare una patologia

16 aploinsufficienza insufficiente quantità di prodotto genico causata da una mutazione in eterozigosi la mutazione è di tipo allele amorfo o ipomorfo colpisce geni per i quali il 50% di prodotto genico non è abbastanza per garantirne la funzione spesso un dosaggio preciso è richiesto ai fattori di trascrizione e alle molecole di segnale espressi nel corso dello sviluppo

17 In caso di delezioni del cromosoma X nei maschi si osserva direttamente in fenotipo come sindrome da geni contigui In caso di delezioni autosomiche in eterozigosi, molto spesso il dosaggio dimezzato non è causa di malattia. Quando si osserva una sindrome da delezione, è risolutivo trovare la stessa sindrome causata da una mutazione puntiforme in uno solo dei geni. Se questa non si trova, la sindrome esiste solo come somma di più difetti.

18 ACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATA GCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTC CGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGC TAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGC GACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACAC 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19 ACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATA GCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTC CGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGC TAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGC GACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACAC 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20 duplicazioni segmentali il genoma umano contiene complessivamente il 13,7% di segmenti duplicati con almeno il 90% di identità di sequenza il 5,2% del genoma contiene segmenti duplicati lunghi tra 1 e 10kb, mentre il 4,5% tra 10kb e 20kb i cromosomi più colpiti sono lY (50,4%) ed il 22 (11,9%), ma anche il 7, 9, 10, 15, 16, 17 e X le duplicazioni segmentali possono essere intracromosomiche o intercromosomiche con tre localizzazioni differenti: –pericentromeriche (47Mb, dupliconi originati da altri cromosomi) –subtelomeriche (ciascuna solo kb, orientate) –interstiziali (solo nella specie umana sono disseminate ad una distanza media di 3Mb)

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22 Malattie autosomiche dominanti Come fanno le delezioni in uno solo dei due alleli a costituire un carattere dominante? 1.il livello dimezzato di prodotto genico è insufficiente a mantenere il fenotipo 2.il difetto eterozigote diviene omozigote a livello delle cellule dei tessuti periferici (LOH) 3.un solo allele è espresso per imprinting dellaltro

23 FISH

24 Sonde FISH le sonde FISH devono essere mirate, non possono essere utili nellanalisi genomica generale centromero telomero intero cromosoma locus

25 FISH

26 Sindrome di DiGeorge

27 DiGeorge/velocardiofacciale La sindrome di DiGeorge del22q11.2 è la più frequente sindrome da microdelezione, con un incidenza di 1 su nati La delezione comprende 3Mb ed almeno 30 geni

28 La migrazione di cellule della cresta neurale contribuisce alle strutture embrionali colpite nella sindrome di DiGeorge

29 DiGeorge È caratterizzata da –Anomalie cardiache –T-cell deficit –palatoschisi –anomalie facciali –Ipocalcemia Mutazioni puntiformi del gene TBX1 possono portare a questi 5 tratti fenotipici, ma non alle difficoltà nellapprendimento che è invece frequente nella sindrome da delezione

30 Williams-Beuren prevalenza alla nascita 1/ /20.000, ma può non essere diagnosticata

31 Williams una delezione tipica

32 Williams genetica delezione de novo trasmissione autosomica dominante delezione di 1.6MB da 21 geni contigui in eterozigosi a 7q11.23 –gene dellelastina –LIM kinase 1 (LIMK1) –CLIP-115 che lega i microtubuli –Fattori di trascrizione GTF2I e GTF2IRD1 –effetto posizionale su altri geni circostanti la delezione

33 FISH della s. di Williams delezione 7q11.23 rilevabile mediante FISH ma non cariotipo rilevabile mediante FISH ma non cariotipo

34 Williams comportamento lieve o medio ritardo mentale (IQ tra 41 e 80) scarsa capacità di concentrazione ritardo nellapprendimento del linguaggio e poi esagerata loquacità personalità amichevole e affettuosa danno facilmente confidenza anche a sconosciuti ansietà, spesso preoccupati per il benessere altrui ipersensibilità ai suoni memoria visiva e uditiva spesso fuori dal comune ricordano persone, luoghi e motivi musicali predisposizione ad imparare le lingue e la musica

35 Williams aspetto e segni Faccia da elfo Occhi blu (77%) con pattern stellato delliride (74%) ma questo vale per i nordeuropei, strabismo (40%) Naso con la punta bulbosa bocca larga e guance piene microdontia e micrognazia Statura 10 cm in meno del normale ipercalcemia stenosi periferica delle arterie polmonari stenosi aortica sopravalvolare

36 Williams foto

37

38 Wolf-Hirschhorn genetica delezione de novo di circa 4MB le delezioni sono più frequenti nella linea germinale maschile trasmissione autosomica dominante Regione critica di 165 kb di molti geni contigui in eterozigosi a 4p16.3

39 Wolf-Hirschhorn delezione a 4p16.3

40 Wolf-Hirschhorn Scarso accrescimento Ritardo mentale, ipotonia Labbro leporino Conformazione ad elmo di guerriero greco

41 Sindrome 5p- (cri du chat) 1: nati Pianto acuto e flebile Caratteristiche principali: –Ritardo di crescita –Microcefalia ed ipertelorismo –Ipotonia, diastasi dei retti –Deficit intellettivo e del linguaggio

42 imprinting una piccola parte del genoma umano presenta differenze significative nellespressione a seconda se un gene è ereditato dal padre o dalla madre se due cromosomi sono provenienti dallo stesso genitore (disomia uniparentale) e non da entrambi i genitori, si determina morte o malattia alla base di queste differenze cè limprinting genomico è dovuto a modificazioni epigenetiche (non correlate alla sequenza primaria del DNA) comporta l'aggiunta di un gruppo metile (CH3)- alla posizione 5 di un residuo di citosina nel DNA che precede immediatamente un residuo di guanina (CpG).

43 Imprinting

44 Nelle cellule germinali primordiali limprinting viene cancellato del tutto e il DNA è demetilato Successivamente nella linea germinale maschile si determina un pattern di imprinting che in alcuni loci è complementare a quello della linea germinale femminile I cromosomi su cui avviene limprinting (7, 11, 15) manterranno questo pattern e lo riprodurranno ad ogni mitosi Si potranno sempre distinguere lespressione genica del cromosoma materno e paterno

45 Disomia uniparentale Due copie dello stesso cromosoma sono ereditate dallo stesso genitore Spesso questo avviene attraverso un fenomeno transitorio di trisomia, seguito dalla perdita del cromosoma singolo e mantenimento del cromosoma doppio

46 Angelman 70% dei casi delezione della regione cromosomica 15q11-q13, che è soggetta al fenomeno dell'imprinting del cromosoma paterno Il gene materno (l'unico espresso) può essere alterato con 4 meccanismi noti: –delezione –disomia uniparentale paterna –difetti nell'imprinting –mutazioni a carico del gene UBE3A (ubiquitin ligasi) La diagnosi è clinica e il difetto genetico non si identifica nel 20% dei casi

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48 "happy puppet syndrome" si può identificare in Cucciolo (Dopey) "addormentato", il più giovane dei nani che non ha mai imparato a parlare ritardo mentale con assenza del linguaggio, difficoltà nell'equilibrio, eccessivo buon umore Angelman

49 L'incidenza è 1/ nati crisi epilettiche e comunque alterazioni dell'EEG e microcefalia relativa Angelman

50 Prader-Willi iperfagia>obesità eccessiva assunzione di liquidi reazioni abnormi ai sedativi acromicria, criptorchidismo insensibilità al dolore, lesioni cutanee sbalzi di umore

51 Prader-Willi 1/15.000

52 Nomenclatura delle delezioni Le delezioni sono designate con la sigla del che segue i numeri dei nucleotidi a monte e a valle della delezione separatida un segno _ –82_83del (o 82_83delTG) indica una delezione di TG nella sequenza ACTTTGTGCC (dove A è il nucleotide 76) che diventa ACTTTGCC

53 Malattie degenerative progressive Variazione dello spessore delle miofibrille con forti cambiamenti nella istologia del muscolo indebolimento e degenerazione del tessuto muscolare in fibroso e adiposo aree di necrosi con processi infiammatori Cosa sono le distrofie muscolari?

54 Duchenne Becker cingoli facio- scapolo- omerale distale oculo- faringea Emery- Dreifuss

55 Distrofia muscolare Duchenne/Becker DMD Duchenne - 1/3,500 maschi Insorgenza -- Infanzia - tra 2 e 6 anni Sintomi – Debolezza generalizzata e danno muscolare prima agli arti e al tronco, polpacci ingrossati Progressione – Lenta ma inesorabile. Colpisce tutti i muscoli volontari. Sopravvivenza fino a anni BMD Becker - 1/10,000 maschi Insorgenza – Adolescenza o dopo Sintomi – Identici alla DMD ma più attenuati. Vi è coinvolgimento cardiaco significativo Progressione – Più lenta e più variabile della distrofia di Duchenne con buona aspettativa di vita

56 Le delezioni intrageniche del gene della distrofina mandano fuori cornice la lettura delle triplette quando gli esoni cancellati contenevano un numero di nucleotidi che non è multiplo esatto di tre (1,2,4,5,7,8,10,11 ecc). Questo causa la distrofia di Duchenne.

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58 Le delezioni intrageniche che non alterano la cornice di lettura portano alla distrofia muscolare di Becker o ad un apparente buona salute. Forniscono informazioni per preparare delle microdistrofine per la terapia genica

59 Nomenclatura delle delezioni Le delezioni sono designate con la sigla del che segue i numeri dei nucleotidi a monte e a valle della delezione separatida un segno _ –82_83del (o 82_83delTG) indica una delezione di TG nella sequenza ACTTTGTGCC (dove A è il nucleotide 76) che diventa ACTTTGCC

60 La tecnica del CGH (comparative genomic hybridization) permette lindividuazione di sequenze delete o duplicate nel genoma da testare (red) mediante il confronto con un genoma di riferimento (green). Sono preparate due sonde fluorescenti di colore diverso che ibridano contemporaneamente sui cromosomi. Se in una regione cromosomica prevale il colore (green) relativo al genoma di controllo questo significa che il genoma da testare (red) ha una delezione in quella regione

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62 CGH DNA del paziente DNA di controllo Aggiungere DNA Cot-1 Ibridazione Analisi delle immagini con software dedicati CGH array

63 DNA RNA From one-dimensional to multi-dimensional … with multiple applications … Splice Variants ChIP GX aCGH/ CNV CH 3 miRNA Sure Select Elucidate the role that protein-DNA interactions play in transcription, replication, modification and repair Perform global interrogations of the transcriptome and identify alternative splice forms to uncover the role gene variants play in drug response and disease Explore gene transcription on a genome-wide basis across a variety of model systems mRNA Conduct high- resolution, genome-wide profiling of DNA copy number changes associated with cancer and other genetic diseases Copy number Discover and monitor epigenetic modifications known to play a fundamental role in many cellular processes MethylationTranscription Factors mRNA isoforms Profile microRNAs and explore the role they play in gene regulation RNA interferenceDNA Target Enrichment Gene Silencing Protein Mutagenesis Whole Gene Synthesis Genome Partitioning Agilent Technology

64 combine with new database (6M probes) V combine with two new databases (18M + 4M) V V million, 400bp spacing Scoring model v1 Probes pass Agilent Tm and homology filters One mapping per probe 8 million, 200bp spacing Scoring model v2 Probes pass Agilent Tm and homology filters One mapping per probe Used in selection of 244K and 105K CGH catalog products 24 million, 40bp spacing Scoring model v3 Probes pass Agilent Tm filters One or more mappings per probe Used for selection of new SurePrint G3 catalog designs Probe with >40 perfect matches marked as unmapped Evoluzione del catalogo delle sonde già testate Human CGH High Density (HD) Database

65 Agilent Manufacturing Facility -Industrial manufacturing – Class 10,000 clean-room -Ability to easily scale production capacity -FAB wired directly into e- array allowing direct customer access to fully customizable microarrays -High-performance Ink Jet Printing Enables High Levels of Spatial Multiplexing and Flexible Designs Advances to printing technology continue to occur against which Agilent can capitalize upon without having to make significant investments.

66 1M 400K 180K 60K nuovi Formati dei Microarray Agilent K 44K 105K 15K attuali 22K44K 1.9K 11K Multiplex vecchi

67 44,000-oligonucleotide with 8,769 interrogating probes (60-mer oligonucleotides) Agilent Technologies average spacing of probes across the DMD coding region of at least one every 144 base pairs digestion with AluI and Rsa I and labeling Agilent CGH-Analytics V3.4s software F F

68 9293 probes that were replicated twice (Agilent) remaining spots on each 44 K array were filled with probes from the X chromosome (11745) and all of the autosomes (12053) CGH Analytics software (v3.5)

69 microarray-based mutation detection in the dystrophin gene (Nimblegen) 385,474 probes spanning the 2,222,000 bases of the dystrophin gene on chromosome X: 31,046,000–33,268,000 probe lengths from 45 to 60 nt with isothermal melting temperature DNA samples sonicated to a size between 500 and 2,000 bases Labelling with Klenow and Cy3 or Cy5 Exon 44

70 Normalized log2 ratio data were analyzed using two different analysis programs: (SegMNTor DNA copy) NimbleScan Gain and Loss Analysis of DNA (GLAD) (www.bioconductor.org)www.bioconductor.org DNA copy GLAD DNA copy GLAD dup 2-4 del 44

71 (1, gain; 0, normal; and–1, loss), del del 48-52

72 Solo la CGHarray riesce a chiarire la mutazione nelle donne portatrici di una delezione o duplicazione del cromosoma X. A causa della presenza del secondo cromosoma X normale sono difficili da identificare con altre tecniche del del dup 18-38


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