Software usati in proteomica

Presentazione sul tema: "Software usati in proteomica"— Transcript della presentazione:

1 Software usati in proteomica
Università degli Studi di Perugia Corso di Laurea Interfacoltà in Biotecnologie Fondamenti di Bioinformatica e di Biologia dei Sistemi Proteomica e Metabolomica Software usati in proteomica Pier Luigi Orvietani Biotecnologie

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3 Strumentazione per la cattura delle immagini
VERSADOC

4 Tools del Versadoc tramite software

5 Identificazione Comparazione

6 Il confronto e l’analisi dei 2D Gels vengono effettuati mediante l’uso di opportuni Hardware e Software Bioinformatica 6

7 PDQuest Workflow Acquire the image Size and orient the image
Spot identification Spot comparison and matching Data analysis Spot cutting and mass spectrometry analysis Publish results

8 Digital Data and Signal Intensity
PDQuest converte i segnali dal campone biologico in dati digitali Ogni oggetto visualizzato dal monitor è composto da tanti piccoli pixel. Ogni pixel ha una coordinata X eY a cui corrisponde una posizione orizzontale e verticale Vi è anche un valore Z che corrisponde all’intensità del segnale del pixel

9 Caratterizzazione dell’intensità del segnale
L’oggetto per essere visibile e quantificabile deve avere l’intensità del suo cluster di pixel maggiore di quella del background L’intensità totale di un oggetto è la somma dell’intensità di tutti i pixel che formano lo stesso oggetto L'intensità media di un oggetto è l'intensità totale diviso per il numero di pixel dell'oggetto. L‘unità dell’intensità del segnale è espressa in Densità Ottica D.O.

10 IMMAGINI CREATE DURANTE LO SPOT DETECTION
2-D Scan Filtered Image Gaussian Image PDQuest usa modelli Gaussiani per creare spot che possano essere precisamente identificati e quantizzati PDQuest crea spot Gaussiani rapportati tridimensionalmente per meglio evidenziare le differenze fra di loro

11 SPOT QUANTITY Spot Quantity è la totale intensità di un spot ben definito in un immagine del gel Spot Quantity viene calcolato mediante l’immagine Gaussiana con la seguente formula Altezza dello spot * π *σx * σy Altezza dello Spot è il picco dello spot ed è misurato in OD/ unità di immagine (IU) 1 IU: 0,1 mm σx σy è la deviazione standard della distribuzione Gaussiana dello spot secondo gli assi X e Y . Anche queste sono misurate in IU Spot Quantity viene espresso in OD*IU2

12 L’IMMAGINE VIENE IMPORTATA E VISUALIZZATA

13 L’Immagine viene regolata nelle sue caratteristiche di luminosità, contrasto, gamma etc.

14 Una volta elaborata viene tagliata e dimensionata

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17 via software vengono individuati gli spots,
dai più deboli ai più intensi 17

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25 Il software confronta i vari gels, evidenziando gli spots (proteine)
presenti o assenti nell’uno o nell’altro. 25

26 Normalizzazione dei dati
Formula di Normalizzazione Raw spot quantity * Scaling factor * pipette error compensation factor __________________________________________________ Normalization factor Raw spot quantity è l’intensità dello spot Scaling factor è il valore con cui noi vogliamo esprimere l’intensità normalizzata (PPM ;%)

27 Normalizzazione dei dati
Ciò è importante perché possiamo avere errori dovuti a: Errori di prelevamento del campione Diversa colorazione per diversi tempi di contatto Campione può essere perso durante il caricamento Acquisizione diversa dovuta ad una diversa energia della sorgente Tempi di esposizione non ottimale per l’acquisizione delle immagini Formula della normalizzazione: quantità dello spot non normalizzato x PPM (scaling factor) / Fattore di normalizzazione

28 Vari tipi di analisi possono essere effettuate
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30 Vari tipi di analisi possono essere effettuate
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32 Gli spot possono essere elaborati anche con analisi statistica

33 … mettere in relazione i dati derivanti da set di analisi per es
… mettere in relazione i dati derivanti da set di analisi per es. l’analisi quantitativa con l’analisi statistica 33

34 Ottenere alla fine un quadro riassuntivo degli spot di interesse

35 Gli spots vengono ricontrollati ed ottimizzati
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36 Anche con l’aiuto dell’immagine 3D degli spot interessati

37 E’ possibile esaminare i gels relativi a diversi esperimenti …
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38 … e confrontarne i risultati
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39 Ogni proteina (spot) è caratterizzata da Mr - pI Ricerca nei Data Base
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42 Se non è possibile ritrovare gli spot in data base allora si prosegue con l’analisi degli spot dal gel

43 SPOT CUTTER

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45 ALCUNE DELLE APPLICAZIONI DELLA PROTEOMICA
CAMPO FARMACEUTICO: STUDIO DEGLI EFFETTI DI NUOVI FARMACI E LORO TOSSICITA IDENTIFICANDO LE VARIE MODIFICAZIONI POLIPEPTIDICHE CAMPO AGRO-ALIMENTARE: STUDIO DI PROTEINE TOSSICHE O PROTETTIVE CHE SONO COINVOLTE IN MOLTI MECCANISMI DI RESISTENZA AD AGENTI PATOGENI E PARASSITARI SVILUPPATISI CON L’INTRODUZIONE DI TECNOLOGIE TRANSGENICHE NELLA CLINICA MEDICA: ANALISI DI MAPPE PROTEOMICHE COME MEZZO DI DIAGNOSI RICERCA DI NUOVI TARGET TUMORALI: DALLO STUDIO DI PROTEINE DI MEMBRANA E LORO CARATTERIZZAZIONE SI POTRANNO SVILUPPARE FARMACI SEMPRE PIU MIRATI ALLA LORO CURA

46 NELLA CLINICA MEDICA: ANALISI DI MAPPE PROTEOMICHE COME MEZZO DI DIAGNOSI SIA PER I TUMORI CHE PER LE MALATTIE INFETTIVE

47 RICERCA DI NUOVI TARGET TUMORALI:
DALLO STUDIO DI PROTEINE DI MEMBRANA E LORO CARATTERIZZAZIONE SI POTRANNO SVILUPPARE FARMACI SEMPRE PIU MIRATI ALLA LORO CURA

48 Caratterizzazione della Proteina Tumorale TD52
S1 S3 S2 M (kDa) 25 _ 37 _ 50 _ 75 _ mappa 2D Caratterizzazione della Proteina Tumorale TD52 proteina anticorpo S1 S3 S2 25 _ 37 _ 50 _ 75 _

49 La 2-DE si può applicare anche con l’uso di isotopi radioattivi
incubazione con S35 del campione solubilizzazione separazione in 2DE seccaggio del gel esposizione su lastra L’analisi comporta vari step Questo tipo di analisi può essere applicata allo studio di cinetiche cellulari