L’isolamento virale: aspetti innovativi

Presentazione sul tema: "L’isolamento virale: aspetti innovativi"— Transcript della presentazione:

1 L’isolamento virale: aspetti innovativi
A.Azzi Firenze, 19/11/2004

2 Le colture cellulari Le colture cellulari
Colture primarie Colture primarie Linee continue In monostrato In sospensione Primo passaggio di cellule ottenute dalla disaggregazione di un tessuto espiantato Rappresentative del tessuto d’origine Laboriose da preparare Molto variabili

3 Le colture cellulari Colture primarie
Linee continue Linee continue In monostrato In sospensione linee di cellule trasformate e immortalizzate per mutazione spontanea o indotta da carcinogeni chimici radiazioni ionizzanti infezione in vitro con agenti immortalizzanti.

4 Le colture cellulari Linee subcontinue:
possono essere subcoltivate per un limitato numero di passaggi dopo la coltura primaria, prime del fenomeno di senescenza mantengono il fenotipo normale

5 Le colture cellulari Colture primarie Linee continue In monostrato
Aderenti al supporto Es HeLa, Hep-2, KB, MRC 5 WI38 ……….. Colture primarie Linee continue In monostrato In sospensione

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8 Rene di coniglio

9 Fibroblasti di polmone umano

10 Hep-2

11 Fornitori di colture cellulari
ATCC American Type Culture Collection ECACC European Collection of (Animal) Cell Culture DSMZ Deutsche Sammlung vov Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH Centro Substrati Cellulari-Istituto Zooprofilattico di Brescia

12 I terreni per le colture cellulari
Terreni di crescita + siero bovino fetale al 10 % Terreni di mantenimento + siero bovino fetale al 2 % Terreni serum-free Principali componenti Sol. salina bilanciata Sistemi tampone (bicarbonato/CO2, Hepes) Carboidrati o glutamina Aminoacidi Vitamine Ormoni e fattori di crescita Proteine e peptidi Acidi grassi e lipidi Fattori accessori (tracce di elementi, nucleotidi) Antibiotici ???

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14 La coltura tradizionale
Asportazione del terreno Lavaggi Inoculazione del campione (pre-trattato) Adsorbimento (incubazione x 1 ora a 37°C) Asportazione dell’inoculo Aggiunta del terreno di mantenimento Incubazione per giorni, fino a comparsa dell’ECP Identificazione del virus e tipizzazione

15 Limite dei sistemi tradizionali di isolamento
Esperienza Tempo Necessità di mantenere diverse linee

16 Shell vial

17 Inoculazione in shell vials

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19 Linee cellulari per l’isolamento di virus
Alcune linee “particolari” HCE (human corneal epithelial): da coltura primaria da donatore cornea cellule immortalizzate con vettore ricombinante SV 40-adenovirus per HSV-1 Linea B95-8: linea linfoblastoide trasformata da EBV Per virus del morbillo

20 Valutazione della linea
Inoculazione campioni (corneal scraping) in shell vials di HCE e Vero Incubazione ore IF con sieri policlonalianti-HSV-1 Valutazione qualitativa = presenza di cellule con IF specifica Valutazione quantitativa = n° foci IF in ciascun preparato (shell vial)

21 Risultato Vero: 4 pos /17 HCE: 10 pos /17

22 HCE monostrato

23 HCE cells ECP

24 ECP in shell vial

25 IF su HCE infettate con HSV 1

26 Colture cellulari Transgenic cell lines for detection of animal viruses Olivo 1996

27 Espressione di recettori virali
Characterisation of L cells expressing the human poliovirus receptor for the specific detection of poliovirus in vitro. Pipkin et al 1993

28 Cellule transgeniche che favoriscono l’individuazione del virus

29 Rapid detection of HSV with an enzyme-linked virus inducible system (ELVIS) employng a genetically modified cell line Profitt and Schindler 1995

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31 Isolamento dei virus respiratori
Influenza A Influenza B Virus respiratorio sinciziale V.parainfluenzale 1 V.parainfluenzale 2 V.parainfluenzale 3 Adenovirus

32 Isolamento di virus respiratori
Necessità di allestire colture con diverse linee cellulari Coltura tradizionale Centrifugation-enhanced shell vial culture Coltura simultanea di più linee cellulari R-Mix e R-Mix shell vial Hep-2, LLC-MK2, MDCK su vetrino Inoculazione Centrifugazione a 700 x g Incubazione per ore e ore Hep-2, LLC-MK2, MDCK :sospensione mista contenente cellule di ciascuna linea /vetrino Inoculazione Incubazione per 48 ore IF con pool monoclonali 1

33 Coltura simultanea di più linee cellulari
2 IF 7 diversi monoclonali: Flu A, Flu B, RSV, Para 1,Para 2, Para 3, Ad

34 R-MIX Shell vial: cellule di polmone di visone (ceppo Mv1Lu) e cellule di adenocarcinoma umano (A549) Inoculazione Centrifugazione (1 ora a 700x g) Incubazione per 24 ore - 48ore IF

35 Isolamento dei virus respiratori
La coltura tradizionale a tempi lunghi rimane il test di riferimento IFD < CM < CT

36 Monostrati di cellule criopreservati
HELVIS R-mix Stabili a -80°C per oltre 4 mesi

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