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ACC Programma 3. Trasferimento delle conoscenze allo sviluppo di interventi volti a prevenire, diagnosticare e trattare il cancro. Progetto Terapie Biologiche.

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1 ACC Programma 3. Trasferimento delle conoscenze allo sviluppo di interventi volti a prevenire, diagnosticare e trattare il cancro. Progetto Terapie Biologiche combinate e personalizzate nei tumori solidi Coordinatore: Giorgio Parmiani, Istituto Scientifico San Raffaele, Milano

2 Partecipanti Gruppi di Ricerca Afferenti (HSR): Unità di Immuno-Bioterapia del Melanoma e dei Tumori Solidi (G. Parmiani); Unità di Medicina Nucleare (F. Fazio); Unità di Biologia dei Tumori e Targeting Vascolare (A. Corti); Unità di Immunologia Sperimentale (P. Dellabona).

3 Gruppi di Ricerca afferenti ad altre Istituzioni di Ricerca Unità di Immunoterapia dei Tumori Umani, Fondazione IRCCS Istituto Nazionale Tumori Milano (RS. Licia Rivoltini): UOC Immunoterapia Oncologica, Azienda Ospedaliera Universitaria, Siena (R.S. Michele Maio); Laboratorio di Immunoterapia Sperimentale, ISS, Roma (R.S. Maria Ferrantini); Laboratorio di Ricerche in Immunologia e Infiammazione, Istituto Clinico Humanitas, Milano (R.S. Cecilia Garlanda).

4 Destinatari Istituzionali Partecipanti Istituto Nazionale per la Ricerca sul Cancro (Genova) IRCCS (R.S. Paola Queirolo); Istituto Oncologico Veneto IRCCS, Padova (RS. Paola Zanovello)

5 Obiettivi e Razionale Il progetto è basato sullattivazione di studi clinici di combinazione tra farmaci biologici e vaccinazione con peptidi antigenici, oltre a studi associati o paralleli di laboratorio destinati: 1) a migliorare le conoscenze sui meccanismi alla base della combinazione proposta; 2) al monitoraggio immuno/biologico dei pazienti; c) a valutare polimorfismi di geni che possono influire sulla risposta al trattamento.

6 Risultati del primo anno di attività. Studi pre-clinici Unità di Immunologia Sperimentale HSR (P. Dellabona). Obbiettivi: a) identificazione di epitopi della proteina survivina (SVV) riconosciuti da linfociti T; b) lutilizzo di questi peptidi per lo studio della risposta in pazienti con tumori esprimenti SVV; c) utilizzo di epitopi SVV in protocolli di vaccinazione antitumorale.

7 Risultati e conclusione del primo anno di attività.Studi pre-clinici Sono state identificate 9 sequenze di SVV e sintetizzati i peptidi sintetici corrispondenti. I peptidi sono stati utilizzati in vitro per stimolare, in colture a breve termine, linfociti T CD4+ isolati dal sangue di 7 soggetti normali e 7 pazienti con melanoma metastatico. Linfociti CD4 di 2/7 pazienti e 4/7 donatori hanno risposto. Nel caso dei pazienti con melanoma la reattività anti-SVV dei linfociti T CD4+ appare quindi ridotta rispetto a quella dei soggetti sani.

8 Risultati del primo anno di attività. Studi pre-clinici Unità di Biologia dei Tumori e Targeting Vascolare HSR (A. Corti); Obbiettivo: Verificare se la combinazione di NGR-TNF con vaccinazione può indurre, in modelli animali, una più forte e duratura risposta immune e una migliore risposta clinica in confronto alla sola vaccinazione.

9 TNF NGR-TNF CNGRCG peptide Targeted delivery of TNF to tumor vasculature by coupling with the NGR-peptide (a ligand of CD13 expressed by angiogenic vessel) Curnis et al., Nat. Biotechnol., 2000 The antitumor activity of NGR-TNF is >10 times greater than that of TNF in several mouse models Sacchi et al., Clin. Cancer Res. 2006

10 Risultati del primo anno di attività. Studi pre-clinici I risultati del primo anno indicano che basse dosi di NGR-TNF possono indurre, in maniera più efficiente e persistente del solo TNF, il rilascio di varie citochine e chemochine (IL-2, IL-6, IP-10, lymphotactin, MCP-1, MIP-1beta, oncostatin M, TIMP-1). Esperimenti sono in corso in modelli animali per testare in contesto terapeutico la risposta alla combinazione tra NGR- TNF+vaccino peptidico.

11 Risultati del primo anno di attività. Studi pre-clinici UOC Immunoterapia Oncologica, Azienda Ospedaliera Universitaria, Siena (Michele Maio) Obbiettivo: verificare se cellule di melanoma esprimono antigeni di tipo Cancer Testis (CTA) quali MAGE e NY- ESO1, e se la loro espressione correla con uno stato de-metilato dei rispettivi promotori.

12 Regulation of CTA expression in human melanoma xenografts by 5-AZA-CdR

13 Recognition of Mel313 clones by a MAGE-3-specific HLA-B37-restricted CTL clone

14 Conclusioni La valutazione degli effetti sinergici fra 5- AZA-CdR sulla immuno-modulazione del melanoma ha mostrato che il trattamento in vitro e in vivo porta ad un aumento di 2- 4 volte nei livelli di espressione di diversi CTA (es. MAGE-3, NY-ESO-1). Indurre aumento di espressione di CTA nei pazienti (?)

15 Risultati del primo anno di attività. Studi pre-clinici Unità di Immunoterapia dei Tumori Umani, Fondazione IRCCS Istituto Nazionale Tumori Milano (Licia Rivoltini). Obbiettivo: Studio delle cellule immunosoppressive (T regolatorie e mieloidi) nei pazienti con melanoma.

16 Myeloid suppressor cells are increased in peripheral blood of stage II-III melanoma patients % CD14 + CD11b + HLA-DR -/lo STAGE IIB- IIIC STAGE IV HD MELANOMA p<0-01 p<0.01 N=40 N=30

17 Increased frequency of CD4 + CD25Foxp3 + Treg is a late event in melanoma patients n.s. p= p=0.04 p= 0.002

18 % CD4 + CD25 high FoxP3 + cells (gated on lymphocytes) Monitoring T regs : no major effect of low-dose cyclophosphamide on the frequency of CD4 + CD25 high Foxp3 + HD P0 P1 P VACCINATION ARM cyclophosphamide 300mg/m days before vaccination IIB-IIIC HIGH RISK MELANOMA PATIENTS cyclophosphamide

19 Conclusioni 1.Myeloid suppressor cells are increased in the peripheral blood of stage II-III melanoma patients 2.Increased frequency of CD4+CD25FoxP3+ Tregs is a late event in melanoma patients 3. No major effect of low-dose cyclophosphamide on the frequency of CD4+CD25+Foxp3+

20 Risultati del primo anno di attività. Studi pre-clinici Laboratorio di Ricerche in Immunologia e Infiammazione, Istituto Clinico Humanitas, Milano (Cecilia Garlanda). Obbiettivo: Trasferimento clinico delle conoscenze sulle molecole infiammatorie da utilizzarsi quali potenziali biomarcatori diagnostici/prognostici delle terapie anti- tumorali. La pentraxina lunga PTX3, proteina di fase acuta, è espressa nella risposta infiammatoria e svolge il duplice ruolo di difesa contro i patogeni e di proteina strutturale della matrice extra-cellulare. Valutare le potenzialità diagnostiche di PTX3 sullo stato infiammatorio del paziente alla diagnosi e durante la terapia, e come marcatore di rischio di infezioni opportunistiche.

21 PTX3 expression of liposarcoma specimen and corresponding normal fat tissue Normal fat tissuePleomorphic liposarcoma

22 Potential role of PTX3 in the control of tumor growth and metastatic potential: Increased tumor growth in absence of PTX3 in two different models of murine fibrosarcoma MN/MCA1: non immunogenic and metastasic fibrosarcoma * * * * * * * ** * * * * * MCA203: immunogenic and non metastasic fibrosarcoma

23 Conclusione Identificazione di forme tumorali producenti PTX3: liposarcomi, condrosarcomi, gliomi. Ruolo potenziale di PTX3 nel controllo della crescita tumorale e della metastatizzazione.

24 Risultati del primo anno di attività. Studi pre-clinici Laboratorio di Immunoterapia Sperimentale, ISS (Roma) (Maria Ferrantini ) Obiettivo: Identificazione di biomarcatori genetici predittivi della risposta biologica e clinica ai diversi protocolli di vaccinazione sperimentati nel corso degli studi clinici di questo progetto. Metodica: Strategie basate sul microarray verranno utilizzate per valutare lesistenza di possibili correlazioni tra la risposta clinica e/o immunologica indotta dai vaccini e la presenza nel DNA dei pazienti di specifici polimorfismi a singolo nucleotide (SNP) in geni codificanti citochine e proteine ad esse correlate.

25 Risultati del primo anno di attività. Studi pre-clinici Istituto Oncologico Veneto IRCCS, Padova (Paola Zanovello) Obbiettivo: Studio pre-clinico della immunogenicità di hTERT, un antigene da utilizzarsi in studi clinici. E stata valutata la immunogenicità di diversi epitopi di h- TERT presentati in associazione alla molecola HLA- A*0201, e la generazione di linee e/o cloni di linfociti T CD8 specifici per questo antigene. A tale scopo sono stati immunizzati topi transgenici HLA- A*0201 (topi HHD) con hTERT impiegando diversi protocolli. Per ciascuna delle modalità di immunizzazione è stata condotta una valutazione ex vivo mediante ELISPOT.

26 CD8+ T cells induced by im DNA vaccination and electroporation in HHD-mice KILLED 14days DNA 14days KILLED 14days14days DNA 14days14days control HHD mice showed strong reactivity against epitopes R30 and R865

27 Cytotoxic activity of T cells obtained after several cycles of in vitro re-stimulation was measured against a panel of HLA-A2 human tumor cell lines nine restimulations of CD8 T cells from hTERT immunized HHD mice with - irradiated and peptide pulsed splenocytes

28 Conclusioni I risultati ottenuti non hanno dimostrato significative differenze fra i diversi protocolli utilizzati per immunizzare. La fase di valutazione pre-clinica è stata completata studiando la capacità di riconoscere in vivo in topi Rag2(-/-) una linea tumorale umana di ca della prostata da parte delle linee T CD8 specifiche per l'epitopo R865 o per l'epitopo R30.

29 Obiettivi clinici Tre studi clinici sono proposti: Uno coordinato dallUnità di IST di Genova: Studio di fase I-II di vaccinazione con oncolisato cellulare di melanoma autologo associato ad IFN-α2b in pazienti con melanoma metastatico; Due coordinati da HSR (Milano) e comprendenti, a) Studio di fase II randomizzato di IFN-α2b ad alte dosi per un mese in combinazione con vaccino peptidico in pazienti con melanoma metastatico (M1a/b); b) Studio di fase I-II di combinazione di NGR/TNF (anti- angiogenico MolMed) e vaccino peptidico in pazienti con melanoma o carcinoma del colon.

30 Risultati del primo anno di attività. Studi clinici Istituto per lo Studio e la Cura dei Tumori IRCCS Genova (Paola Queirolo) Obbiettivo: Attivare il protocollo clinico. Nel corso del primo anno lOncologia Medica A e il Laboratorio di Terapia Immunologica dellIST si sono occupati della stesura del protocollo dello studio clinico. La preparazione del vaccino avverrà in regime di GMP presso il centro di biotecnologie avanzate dellIST.

31 Risultati del primo anno di attività. Studi clinici Il documento riassuntivo di tale protocollo era stato oggetto di una pre-audizione presso lISS/AIFA che ha suggerito alcune revisioni. Attualmente è stata redatta una versione rivista del protocollo che è in fase di sottomissione allISS. Inoltre sono state preparate le istruzioni operative inerenti al processo di preparazione del vaccino ed è stata ultimata la stesura del Technology Transfer Report. Il ritardo nella ri-sottomissione del protocollo è legato alla necessità di eseguire adeguamenti strutturali del laboratorio GMP dellIST, sulla base della normativa vigente. Infatti tale struttura non è ancora stata approvata e verrà valutata nel corso della site-visit ministeriale per questo protocollo.

32 Conclusione Nel corso del primo anno i gruppi IST hanno svolto una preziosa attività di preparazione della struttura GMP che si intende utilizzare, ridefinito il protocollo e iniziato uno studio delle possibili reazioni allergiche che possono comparire in pazienti trattati con alte dosi di IFNα2a.

33 Risultati del primo anno di attività. Studi clinici Unità di Immuno-Bioterapia dei Tumori Solidi, HSR (G. Parmiani) Obbiettivo: Iniziare le procedure per attivare due studi clinici. 1. Studio di fase II randomizzato di IFN-α2b ad alte dosi in combinazione con vaccino peptidico in pazienti con melanoma metastatico (M1a/b); 2. Studio di fase I-II di combinazione di NGR/TNF (anti-angiogenico MolMed) e vaccino peptidico in pazienti con melanoma o carcinoma del colon.

34 Risultati del primo anno di attività. Studi clinici Lattivazione degli studi è stata bloccata dalla repentina impossibilità di utilizzare peptidi per questi protocolli in Europa (gennaio 2008). Dopo un anno di discussione con diverse industrie Biotech e i colleghi europei interessati, si è finalmente arrivati a poter utilizzare nuovi peptidi, acquistati in forma consortile per renderne il costo compatibile con i finanziamenti. I peptidi saranno disponibili entro aprile

35 Risultati del primo anno di attività. Studi clinici Tuttavia il costo costringe a ridurre da 4 a 2 il numero di peptidi vaccinali che verranno inoculati nei pazienti. Le due industrie interessate agli studi (ma non sponsors) confermano la possibilità di fornire gratuitamente i farmaci da combinare col vaccino (IFN-α2b e NGR/TNF). Ciò ha costretto a rivedere in parte i protocolli che verranno presentati alle autorità regolatorie entro marzo/aprile 2009.

36 Conclusioni generali dopo il primo anno di attività Due incontri si sono tenuti per lavvio e la verifica dei programmi in corso con la partecipazione delle Unità coinvolte. Nuove informazioni sono state ottenute a livellopre-clinico per migliorare il disegno degli studi clinici di combinazione immuno-bioterapia. I protocolli clinici previsti potranno iniziare il reclutamento dei pazienti entro giugno 2009.

37

38 Adoptive-Transfer of mTERT-specific CTLs in TRAMP mice causes reduction of peripheral blood lymphocytes Autoimmunity side effect ? WBC x10E03/µLRBC 10E06/µL β-Gal T cells mTERT T cells NEUT10E03/µLLYM 10E03/µLMONO 10E03/µL β-Gal T cells mTERT T cells * ** *Student t test P= **Student t test P=

39 Effects of low dose cyclophosphamide and IL-2 on CD4+CD25+Foxp3+ Treg cells in PBMC CD4+CD25+Foxp3+ Treg cells in PBMC CTX1 CTX2 Surgery IL-2 V1 V2 V3 V5 % FoxP3+CD25+ in CD4+ T cells V0

40 INT-001 INT-004 Ex vivo recognition of Mart-1 peptide (by IFNγ ELISpot) and Treg frequency in vaccinated melanoma patients

41 HD N=10 Prostate carcinoma with biochemical recurrence N=22 Metastatic prostate carcinoma N=6 %CD4+CD25 high Foxp3+ in G1 Low frequency of Treg cells in prostate carcinoma patients with biochemical recurrence: Tregs frequency may depend on tumor burden n.s. p<0.01

42 Potenziale diagnostico di PTX3 in patologia neoplastica Cecilia Garlanda Laboratorio di Ricerche di Immunologia Istituto Clinico Humanitas, Rozzano, Milano.

43 PTX3: a multifunctional soluble Pattern Recognition Receptor (Garlanda C. et al. Ann. Rev. Immunol. 2005)

44 Diagnostic potential of PTX3 in human pathology Hischemic heart disease and heart failure (Circulation 2000, 2004) Sepsis (Mueller et al. Crit. Care Med. 2001) Small vessel vasculitis (Arthritis Rheum 2001, 2006) Atherosclerosis (Rolph et al. Arterioscler.Thromb.Vasc. Biol.2002) RA (Lucchetti et al. Clin. Exp. Immunol. 2000) Infections: TBC, Dengue (Microbes Infect. 2005, J med virol.2005) Preeclampsia (Am J Obstet Gynecol. 2006;194: ; Obstet Gynecol. 2006;108: ) Preterm delivery (B.J.Ob.Gy. 2007)

45 Functional characterization of hTERT 865 and hTERT 30 -specific CD8 T cells obtained from HHD vaccinated mice T cells nine restimulations of CD8 T cells from hTERT immunized HHD mice with - irradiated and peptide pulsed splenocytes

46 Clone Levels of MAGE-3 mRNA expressed by different single cell clones from Mel 313 melanoma cell line Mel 313 cell line MAGE-3 mol/ -actin mol (x10 -3 )

47 0 4x x ,2x ,6x x x x10 -3 Up-regulation of MAGE-3 expression in single cell clones from Mel 313 cells by 5-AZA-CdR Clone 5Clone 14 MAGE-3 mol/ -actin mol

48 Persistency of 5-AZA-CdR-induced CTA expression in human melanoma xenografts NY-ESO-1 mol/ -actin mol

49 CELLULAR SOURCES OF PTX3 MATRIX DEPOSITION MøMømyeloid DC fibroblastsadipocytesmesangial cells SMC endotheliumgranulosa cells FERTILITY PTX3 TLR AGONISTS (e.g. LPS ) PRIMARY INFLAMMATORY CYTOKINES (IL-1, TNF) IL-10 OXIDIZED LDL GDF9 FSH, cAMP, EGF (+ oocyte) INNATE IMMUNITY Resistance to A. fumigatus, P. brasiliensis, P. aeruginosa, K. pneumoniae, CMV … (Garlanda Bottazzi and Mantovani Annu Rev Immunol 2005; Bottazzi Curr Op Immunol 2006) Tuning inflammation PMN

50 Valutazione dei livelli serici di PTX3 in diverse forme tumorali -Trovata in liposarcoma, condrosarcoma, glioma, carcinoma ovarico, polmonare e mammario, AML, ALL (Willeke et al. Eur J Cancer, 2006) SCOPO: Valutare le potenzialità diagnostiche di PTX3 sullo stato infiammatorio del paziente alla diagnosi e durante la terapia, e come marcatore di rischio di infezioni opportuniste.

51 Obiettivi (1) Sulla base di studi pre-clinici già condotti o da condurre nellambito del programma, identificare i potenziali meccanismi di sinergia anti-tumorale per combinare due o più agenti terapeutici di cui almeno uno di tipo biologico in protocolli clinici di fase I-II.

52 PTX3 deficiency is associated with increased tumor growth and metastatic potential Mice were sacrificed at 32 days after s.c. injection with MN/MCA1 fibrosarcoma (10*5 cell/mice)

53 Conclusioni Al momento, oltre a numerosi ulteriori tentativi di messa a punto di un protocollo efficace per lutilizzo dei vetrini di microarray prodotti in house, il gruppo sta valutando la possibilità di procedere con lacquisto di una diversa piattaforma di microarray commercialmente disponibile.


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