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Nessuna cellula vive isolata. Una complessa rete di comunicazione tra cellule regola crescita, maturazione, differenziamento, metabolismo, omeostasi di.

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1 Nessuna cellula vive isolata. Una complessa rete di comunicazione tra cellule regola crescita, maturazione, differenziamento, metabolismo, omeostasi di cellule che compongono tessuti ed organi. Le cellule bersaglio sono a volte cellule che producono altri ormoni. I recettori ormonali svolgono un ruolo essenziale nel mediare l'azione degli ormoni. L'azione degli ormoni é determinata da differenti meccanismi intracellulari. Gran parte del controllo della secrezione di ormoni dipende da meccanismi a feedback. Esiste una stretta relazione tra l'attività del sistema nervoso centrale e la secrezione di ormoni La fluorescenza citoplasmatica mostra il passaggio di un'onda di concentrazione elevata di calcio (Ca) attraverso un campo di astrociti. Quando colture confluenti di astrociti ippocampali sono stimolate dal neurotrasmettitore glutammato, ne risulta tra l'altro un aumento delCa libero citoplasmatico, aumento che ha andamento oscillatorio; infatti può prendere la forma di onde di incremento di Ca che si propagano tra le cellule a 20 m/s. Icambiamenti della concentrazione di Ca, misurati con l'indicatore di fluorescenza fluo-3, sono campionati a intervalli di 4 s. Le aree che superano un determinato valore-soglia di incremento in un dato tempo assumono un dato colore convenzionalf!, che si sovrappone all'immagine data dalla fluorescenza citoplasmatica di base. Ogni campionamento di 4 s corrisponde a un colore diverso, codificato in una sequenza temporale. Si può osservare un'onda che origina dall'area viola a sinistra del centro, si allarga verso il centro del campo in un'area azzurra e poi si irradia verso l'alto attraverso archi verdi, giallo, arancio e rosso. (Per gentileconcessione di Steohen Smith.) I segnali cellula-cellula: ormoni e recettori

2 Forme di segnalazione

3 Caratteristiche comuni: 1) Secrezione nel torrente circolatorio 2) Genesi di potenziali elettrici e depolarizzazione 3) Peptidi prodotti da cellule endocrine possono agire da neurotrasmettitori 4) Neurotrasmettitori possono agire da ormoni; 5) Un singolo tipo cellulare può produrre sia neurotrasmettitori (es. amine biogene) che ormoni (peptidici) 6) Un singolo gene può determinare la produzione di 1 peptide neurotrasmettitore e di 1 peptide ormonale. Segnalazione endocrina e sinaptica a confronto Caratteristiche differenti

4 Recettori specifici mediano la risposta a segnali extracellulari Figura 19.2 Alcuni ormoni si legano a recettori di superficie, altri a recettori all'interno della cellula. (a) Recettori di superficie. Gli ormoni peptidici e proteici, le prostaglandine, gli amminoacidi, l'epinefrina e i composti simili a essi si legano ai recettori posti sulla superficie delle cellule, determinando un aumento o una diminuzione della concentrazione citosolica di AMPc, di Ca 2+, di 1,2-diacilglicerolo, o di qualche altro secondo messaggero. (b) Recettori citosolici o nucleari. Gli steroidi, la tiroxina e l'acido retinoico, di natura molto idrofobica, sono trasportati da proteine ematiche. Dissociati dal trasportatore, gli ormoni penetrano nella cellula, si legano a recettori specifici nel citosol o nel nucleo e agiscono sul DNA nucleare, alterando la trascrizione di geni specifici. La > parte degli ormoni lipofilici interagisce con recettori citosolici o nucleari e altera lespressione genica. Gli ormoni idrosolubili interagiscono con recettori sulla superficie cellulare

5 Progesterone Estradiolo Testosterone Cortisolo Ovaio, corpo luteo; placenta Ovaio, placenta Testicolo Corteccia surrenale Differenziamento dell'utero in preparazione all'impianto del embrione; mantenimento delle prime fasi della gravidanza, sviluppo del sistema alveolare delle ghiandole mammarie Maturazione e normale funzionamento degli organi sessuali accessori maschili; sviluppo delle caratteristiche sessuali maschili Differenziamento dell'utero e di altri organi sessuali femminili; mantenimento dei caratteri sessuali secondari della femmina e delle normali funzioni cicliche degli organi sessuali accessori; sviluppo del sistema duttale delle ghiandole mammarie Effetto sul metabolismo dei carboidrati, dei lipidi e delle proteine; riduzione dell'infiammazione e delle risposte immunitarie; aumento delle risposte fisiologiche globali allo stress Ormoni steroidei. Precursore comune rappresentato dal colesterolo; ormoni secreti dalle ghiandole della riproduzione; corticosurre- nalici; metaboliti attivi della vitamina D. Aldosterone Mantenimento del bilancio idrico e ionico; riassorbimento degli ioni da parte delle cellule epiteliali del rene

6 Aumentata produzione di calore; mantenimento del metabolismo del glucosio e di altri «carburanti»; ampi effetti sull'espressione genica e sull'induzione di sintesi enzimatiche ormone tiroideo, catecolamine (adrenalina, noradrenalina); precursore comune tirosina. Amine Tetraiodiotironina (T4) Triidiotironina (T3) Tiroide Contrazione delle arteriole; diminuzione della circolazione periferica. Contrazione del muscolo liscio Epinefrina Norepinefrina Istamina Prostaglandine; derivati ac. arachidonico Midolla surrenale Mastociti > Parte del corpo Aumento delle pulsazioni e della pressione sanguigna; contrazione della maggior parte dei muscoli lisci; glicogenolisi nel fegato e nel muscolo; idrolisi dei lipidi del tessuto adiposo Dilatazione dei piccoli vasi sanguigni

7 Proteine e peptidi GlucagonePeptide, 29 aacidiCellule alfa del pancreas Stimola la sintesi del glucosio e la degradazione del glicogeno nel fegato, lidrolisi dei lipidi nel tessuto adiposo InsulinaPolipeptide, catena A: 21 aacidi catena B: 30 aacidi Cellule beta del pancreas Stimola l'assunzione di glucosio nelle cellule adipose e muscolari e il meta-bolismo dei carboidrati; stimola la sintesi di lipidi da parte del tessuto adiposo e stimola in generale la sintesi proteica e la proliferazione cellulare GastrinaPolipeptide, 17 aacidiIntestinoSecrezione di HCI e di pepsina da parte dello stomaco SecretinaPolipeptide, 27 aacidiIntestino tenue Secrezione di enzimi digestivi pancrea Secrezione di enzimi digestivi pancreatici; svuotamento della cistifellea ColecistochininaPolipeptide, 23 aacidiIntestino tenue Secrezione di enzimi digestivi pancreatici; svuotamento della cistifellea Ormone adreno corticotropo (ACTH) Polipeptide, 39 aacidAdenoipofisiIdrolisi su lipidi da parte del tessuto adiposo; stimola la corteccia surrenale a produrre cortisolo e aldosterone Ormone fol1icolo stimolante (FSH) Proteina, Catena alfa: 92 aacidi Catena beta : 118 aacidi AdenoipofisiStimola la crescita degli oociti e dei follicoli ovarici e la sintesi di estrogeni da parte dei follicoli Ormone luteinizzante (LH) Proteina Catena alfa: 92 aacidi Catena beta: 115 aacidi AdenoipofisiMaturazione delloocita; stimola secrezione di estrogeni e di progesterone da parte dei follicoli ovarici Ormone tireostimolante (TSH) Proteina Catena alfa: 92 aacidi Catena beta: 112 aacidi AdenoipofisiRilascio di tiroxina da parte delle cellule tiroidee Ormone paratiroideoProteina, 84 aacidiParatiroideAumento del Ca 2+ e diminuzione dei fosfati nel sangue; mobilizzazione dei fosfati di calcio dalle ossa; aumento del riassorbimento di calcio e diminuzione di riassorbimento di fosfato dal filtrato renale

8 Proteine e peptidi VasopressinaProteina, 9 aacidiNeuroipofisiAumento dellassorbimento di acqua dallurina da parte dei tubuli renali; costrizione dei capillari sanguigni e aumento della pressione sanguigna Ormone di rilascio del TSH Polipeptide, 3 aacidi IpotalamoInduce secrezione dellormone tiroido-stimolante da parte delladenoipofisi Ormone del rilascio dellLH (LHRH) Polipeptide, 10 aacidi Ipotalamo, neuroniInduce secrezione dellormone luteinizzante da parte delladenoipofisi Fattore di crescita dellepidermide (EGF) Polipeptide, 53 aacidi Ghiandole salivari e altre ghiandole Crescita delle cellule dellepidermide e di altre cellule Somatotropina (GH) (ormone della crescita) Polipeptide, 191 aacidi AdenoipofisiStimola lassunzione di aacidi da parte di molte cellule; stimola il fegato a produrre IGF-1 che, a sua volta, induce la crescita delle ossa e dei muscoli EritropoietinaPolipeptidi, 166 aacidi ReneDifferenziamento delle cellule staminali eritrocitarie Fattore stimolante le colonie granulocitiche e macrofagiche (GM-CSF) Polipeptidi di PM e Linfociti T, cellule endoteliali e fibroblasti Differenziamento di cellule staminali granulocitiche e macrofagiche Interleuchina-2Polipeptide di PM Linfociti T e macrofagiDivisione dei linfociti T, nel sistema immunitario Fattore di crescita delle cellule nervose Fattore di crescita insulino-simile 1 (IGF-1) 2 catene identiche di 118 aacidi Polipeptide, 70 aacidi Tutti i tessuti innervati da neuroni simpatici Fegato ed altre cellule Crescita e differenziamento dei neuroni sensori e simpatici Fattore di crescita autocrino/paracrino indotto da GH; stimola crescita e divisione cellulare e assunzione di glucosio e aacidi; fa aumentare sintesi di glicogeno nel fegato Fattori di crescita e differenziamento

9 Regolazione livelli ormonali Sintesi, liberazione e degradazione degli ormoni sono soggetti a regolazione I livelli ormonali sono regolati da complessi circuiti di feedback

10 II modello: ormoni proteici e catecolammine Meccanismo di azione degli ormoni I modello: ormoni steroidei, tiroidei, acido retinoico La > parte degli ormoni lipofili interagisce con recettori citosolici o nucleari e altera lespressione genica con effetti duraturi (ore o giorni) Gli ormoni idrosolubili interagiscono con recettori della superficie cellulare con effetti immediati. I fattori di crescita peptidici inducono variazioni espressione genica Figura Modello di attivazione dei geni a opera di un ormone solubile nei lipidi della membrana cellulare; esso entra nella cellula per diffusione. Il recettore ormonale si trova complessato con un inibitore, che si distacca dopo l'interazione ormone- recettore. All'ormone si lega a1 dimero del recettore, che è di natura proteica; il complesso penetra nel nucleo e si associa agli elementi di risposta a livello del DNA, attivando in questo modo la trascrizione del relativo gene.

11 1) Meccanismo di azione ormoni steroidei e tiroidei: Superfamiglia dei recettori intracellulari

12 Figura Legame del recettore per il glucocorticoide alle sequenze del promotore del virus per il tumore mammario di topo (MMTV). (a) Disegno della regione del genoma dell'MMTV che contiene i siti di legame per il recettore del glucocorticoide e il sito di inizio (+ 1) per la sintesi di RNA dipendente dall'ormone. (b) Fotografia al microscopio elettronico dei complessi formati dal recettore per i glucocorticoidi e lormone e legati al DNA schematizzato in (a). Il recettore, una proteina, forma probabilmente dei tetrameri. (c) Footprint dopo trattamento con DNasi della regione del promotore del genoma deII'MMTV, in presenza e in assenza del recettore per i glucocorticoidi, che protegge quattro regioni (barrette rosse) dalla digestione con DNasi. Nelle corsie da 2 a 5 sono presenti concentrazioni crescenti di recettore per i glucocorticoidi, che non sono presenti nella corsia 1. I numeri indicano le posizioni dei nucleotidi a monte dal sito di inizio. (Da F. Payvar, et al., 1983, CelI, 35, D. 391.; fotografie per gentile concessione di K. Yamamoto.J Figura Ipotesi di struttura ad ansa con dita di zinco per i domini ripetuti del TF III A, risultante dal legame di coordinazione delle cisteine (C) e delle istidine (H) invarianti con uno ione di zinco (Zn). La figura mostra solo le prime due delle nove anse possibili. I numeri a fianco dei codici a singola lettera per gli amminoacidi indicano le distanze in numero di residui amminoacidici (Figura 11.12). I pallini neri indicano le catene laterali che con maggior probabilità sono impegnate in legami con il DNA. In ogni ansa si trovano sempre una leucina (L) invariante e una tirosina (y) o una fenilalanina (F). (Adattata da l. Miller, A.D. McLachlan, 1985, EMBO J.) 2) Meccanismo di azione ormoni steroidei e tiroidei: Elementi di risposta I recettori degli ormoni steroidei posseggono regioni a dita di zinco con cui si legano al DNA

13 Figura Controllo della trascrizione. A. Un tipico gene eucariota è costituito da due regioni, la regione codifìcante, che viene trascritta dalla RNA polimerasi Il nell'RNA messaggero e quindi tradotta in proteine specifiche, e una regione regolatrice, che comprende alcuni elementi intensifìcatori e un elemento promotore, che regola ['inizio della trascrizione del gene strutturale. B. Le proteine che regolano la trascrizione si legano sia alla regione del promotore che a quella dell'intensificatore. 1) Jn gruppo di proteine si lega alla TATA-box, al promotore e alla regione distale dell'intensificatore. 2. Le proteine che si legano alla regione dell'intensificatore determinano un ripiegamento ad ansa del DNA, che permette alle proteine regolatrici legate alla regione distale dell'intensificatore di entrare in contatto con la polimerasi, Regolazione della trascrizione genica Un numero limitato di proteine regolatrici è in grado di esercitare un numero molto elevato di interazioni regolatrici sul processo di trascrizione

14 Meccanismo dazione degli ormoni idrosolubili: recettori di superficie Non tutti i recettori di superficie utilizzano il secondo messaggero intracellulare Secondi messaggeri Figura 19.3 Tipi di recettori di superficie. (a) Canali ionici attivati dal calcio. Il ligando induce nel recettore, associandosi a esso, una variazione conformazionale, che apre nella proteina stessa un canale ionico specifico. Ne consegue un flusso di ioni, che altera la differenza di potenziale elettrico tra i due lati della membrana. (b) Proteina chinasi attivata dal ligando. La formazione del legame recettore-ligando induce un'attività proteina- chinasica; il recettore fosforila una proteina substrato e, così facendo, ne altera l' attività. (c) Proteina fosfatasi di residui tirosinici attivata dal ligando. II ligando induce nel recettore l'attivazione di un'attività fosfatasica, che rimuove un residuo fosforico legato a una tiroxina di una proteina substrato. L'attività di tale proteina ne è di conseguenza alterata. (d) Guanilato ciclasi attivata dal ligando. Questo, legandosi, attiva la sintesi nel citosol del secondo messaggero GMP 3',5 ciclico a partire da GTP. (e) Attivazione indotta dal ligando di una proteina G e generazione di un secondo messaggero. Il legame del ligando attiva una proteina G che si lega, attivandolo, a un enzima, che genera un secondo messaggero intracellulare specifico.

15 Recettori di superficie accoppiati a proteine G Figura 14-2 Schema generale delle vie di secondo messaggero. Finora sono state identificate soltanto alcune delle vie attraverso le quali può aver luogo la trasduzione dei segnali.Le tre vie rappresentate nella figura comportano una serie di passaggi analoghi (a sinistra). Gli ormoni entrano in contatto con molecole recettrici della membrana plasmatica ed attivano una famiglia di proteine trasduttrici strettamente imparentate fra loro e capaci di attivare enzimi che fungono da effettori primari. Questi enzimi danno origine alla formazione di un secondo messaggero, che può attivare un effettore secondario o agire direttamente su proteine bersaglio (regolatrici). La prima delle vie rappresentate dà origine al secondo messaggero AMPc che viene prodotto dall'adenil-ciclasi attivata da una proteina-G (il nome dipende dal fatto che queste proteine sono attive soltanto in presenza di guanosin trifosfato (GTP). La proteina-G rappresentata viene detta G, in quanto stimola la ciclasi. Alcuni recettori attivano un'altra proteina, G i, che inibisce la ciclasi. La seconda via è attivata da un recettore muscarinico per l' ACh ed impiega un'altra proteina-G (G) per attivare la fosfolipasi C (PLC). L'enzima dà origine a una coppia di secondi messaggeri, il DAG e l'IP 3. L'IP 3 a sua volta, mobilizza Ca 2+ dai depositi intracellulari. Il DAG attiva la protein-chinasi C (PKC). Il terzo principale sistema rappresentato attiva una cascata di reazioni enzimatiche che modificano l'acido arachidonico attraverso la fosfolipasi A2 (PLA2). Tre importanti enzimi che si formano in questa cascata di reazioni sono: la 5- e la 12-lipossigenasi e la ciclossigenasi. Figura 14-3 La struttura dei recettori accoppiati a proteire G è caratterizzata dalla presenza di sette segmenti di catena polipeptidica che attraversano la membrana a tutto spessore. La struttura del recettore 1 -adrenergico è analoga a quella del recettore 2 -adrenergico, del recettore muscarinico per l' ACh e della rodopsina. Una caratteristica strutturale importante di questi recettori è rappresentata dal sito di legame per il neurotrasmettitore che è localizzato sulla superficie extracellulare della cellula, appena ricoperto dalla matrice lipidica della membrana (nell'esempio, il sito è rappresentato dal residuo 113 di un aspartato). La parte del recetto re colorata in marrone è quella con cui prende rapporto la proteina-G. I due residui di serina, raffigurati in nero indicano i siti dove avviene la fosforilazione. (Modificata, da Frielle e collaboratori, 1989.) Le diverse vie di secondo messaggero hanno molte caratteristiche comuni Recettore a sette eliche

16 Sistema dellAMPciclico ; AMPc Sintesi e degradazione dellAMPc TessutoOrmone che aumenta cAMP Risposta metabolica AdiposoAdrenalina; ACTH; glucagone > idrolisi trigliceridi; < assunzione di amminoacidi FegatoAdrenalina; noradrenalina; glucagone > glicogenolisi; < sintesi di glicogeno; > assunzione di amminoacidi; > gluconeogenesi Follicolo ovaricoFSH; LH> sintesi di estrogeni e progesterone Corteccia surrenaleACTH> sintesi di aldosterone e cortisolo Cellule muscolari cardiache Adrenalina> ritmo di contrazione TiroideTSHSecrezione della tiroxina Cellule osseeOrmone paratiroideo> riassorbimento del calcio dall'osso Muscolo scheletricoAdrenalinaConversione del glicogeno a glucosio IntestinoAdrenalinaSecrezione di fluidi ReneVasopressinaRiassorbimento dell'acqua Piastrine del sangueProstaglandina I< aggregazione e secrezione

17 . Figura L'attivazione dell'adenilato ciclasi operata dal legame di un ormone al suo recettore. Il tratto di membrana cellulare disegnato contiene due proteine transmembrana, un recettore proteico per un ormone (R ), l'adenilato ciclasi (C) e, sul versante citosolico, la proteina di trasduzione G s. Allo stato di riposo, G S., subunità di G s, è associata a GDP. Quando un ormone si lega a esso, R subisce una variazione conformazionale (fase 1). R, allo stato attivato, si lega a G s (fase 2). Questo attiva G S che rilascia GDP e lega GTP; il che causa la dissociazione della subunità G S,. dalle subunità G, (fase 3). La subunità G S,.libera si lega a C, attivandola, in modo che essa inizi a catalizzare la formazione di cAMP a partire da ATP (fase 4); questo passaggio può comportare una variazione conformazionale di G. Ache il GTP viene idrolizzato a GDP, reazione che con ogni probabilità è catalizzata dalla stessa G S. G S perde la capacità di attivare C (fase 5) e C e G S e G, si riassociano. In seguito, l'ormone si dissocia dal recettore e l'ormone torna allo stato di riposo. Figura la proteina G si associa in maniera ciclica a GTP e a CDP; tale associazione è accoppiata all'attivazione e all'inattivazione dell'adenilato ciclasi. Si ritiene che la subunità G S stessa catalizzi l'idrolisi del GTP a GDP. Figura Diverse proteine G mediano l'attivazione e l'inibizione dell'adenilato ciclasi. Numerosi complessi ormone- recettore si legano a una proteina stimolante G S determinando la sostituzione del GDP precedentemente legato con GTP e la dissociazione della subunità G S GTP, che va a legarsi con I'adenilato ciclasi e ad attivarla. Altri complessi ormone- recettore si legano a una proteina G diversa, con funzione inibente, G i, costituita anch'essa da una subunità che lega il GDP o il GTP e dalla subunità G,. In qualche modo, la proteina inibente G i viene modificata, dopo di che lega ladenilato ciclasi e la inibisce. Nei due tipi di proteine G, stimolanti e inibenti, le subunità G, sono uguali, mentre le subunità G e i recettori differiscono. Attivazione delladenilato ciclasi Esistono proteine G attivatrici ed inibitrici La proteina G passa reversibilmente da una forma attiva a una quiescente e viceversa.

18 Proteine G Proteina G Attivata dai recettori per EffettoriVie di segnalazione GSGS Catecolammine istarnina, glucagone, ACTH, LH, FSH, TSH etc. Adenilato ciclasi Canali del Ca++ AMPc > Ingresso diCa++ G olf Molecole odoranti Adenilato ciclasi > AMPc (olfatto ) G tl (bastoncelli) Fotoni,Fosfodiesteras i del GMPc < GMPc (visione) G t2 (coni) FotoniFosfodiesteras i del GMPc < GMPc (visione dei colori) G il G i2 G i3 Noradrenalina, prostaglandine, oppiati angiotensina, numerosi peptidi Adenilato ciclasi Fosfolipasi C Fosfolipasi A 2 Canali del K + < AMPc IP 3, diacilglicerolo, Ca ++ Liberazione di arachedonato GqGq Acetilcolina, adrenalina Fosfolipasi C Polarizzazione della membrana IP 3, diacilglicerolo, Ca ++ Modificata da Bourne HR, Sanders DA, McConnick F: Nature 348:125, 1990 Eterotrimeriche Monomeriche SottoclassiEffetti cellulari Proteine Ras simil Controllo della crescita e della differenziazione Proteine Rho simili (incluse le Rac) Controllo della polimerizzazione dei filamenti di actina e del loro assemblaggio in strutture specifiche come le adesioni focali Proteine Rab simili Controllo del movimento delle vescicole (mediante specificazione delle membrane bersaglio) Proteine ARFsimili Regolazione dell'assemblaggio e del disassemblaggio delle proteine di rivestimento delle vescicole (e, pertanto, del movimento delle vescicole) Figura 5-7 Il ciclo di attività di una proteina G monomerica di tipo Ras. Altre proteine G monomeriche hanno cicli simili. L' attivazione della Ras è 5timolata da una GNRP (proteina che libera nucleotidi guaninici), che promuove il legame di GTP e la liberazione di GDP e, pertanto, l'attivazione della proteina G monomerica. L 'inattivazione della Ras è, invece, promossa da una GAP (proteina attivatrice della GTPasi), che stimola l'idrolisi del GTP legato.

19 Protein chinasi A dipendente da AMPc.Figura 5.8 Attivazione della proteina chinasi dipendente dall' AM Pc. Le due subunità regolatrici (subunità R) del complesso R2C2 sono legate da due ponti disolfuro. Il legame di due molecole di AMPc a ogni subunità R provoca la flessione di ogni subunità R nella regione cerniera e la liberazione delle due subunità catalitiche (C). (Elaborato da Taylor S: J Biol Chem 264:8443, 1989.) Figura 5-9 La famiglia delle proteine chinasi. Tutte le proteine chinasi conosciute possiedono un nucleo catalitico comune (regione colorata) che contiene sia i domini dell' ATP e del legame del peptide sia il sito attivo nel quale si verifica il trasferimento del fosforo. I residui conservati sono stati allineati sulla lisina 72 (pallini in colore), 1'aspartato 184 (quadrati in colore) e le regioni ricche di glicina (rettangoli in colore) della subunità catalitica della proteina chinasi dipendente dallAM Pc. Le regioni tratteggiate in colore sono importanti per la regolazione. I siti di legame covalente con l' acido miristico, un acido grasso che contribuisce alI' ancoraggio della proteina chinasi alla membrana plasmatica, sono indicati da m. (Modificata da Taylor S et al: Annu Rev Cell Biol 8: ) Molte protein chinasi contengono una regione regolatrice definita domino del pseudosubstrato, la cui sequenza amino-acidica assomiglia a quella del sito di fosforilazione dei substrati proteici.

20 Regolazione del metabolismo del glicogeno da parte dellAMPc Figura l'inibizione della fosfoproteina fosfatasi da parte del cAMP. la fosfoproteina fosfatasi è enzimaticamente attiva a meno che una proteina inibitrice non sia legata a essa. l'inibitore deve essere fosforilato dalla proteina chinasi cAMP-dipendente per potersi legate alla fosfoproteina fosfatasi e inibirla. In tal modo, la.fosfatasi è inattiva inpresenza di un atto livello di cAMPe attiva solo quando il livello di cAMP è basso. (Da P. Cohen, 1982, Nature, 296, p. 613.) Figura Il cAMP controlla la degradazione e la sintesi di glicogeno nel fegato e nelle cellule muscolari. (a) L'aumento del livello di cAMP determina un incremento nel livello di glucosio, attivando ladegradazione del glicogeno e inibendo la sintesi di glicogeno. La forma attiva della proteina chinasi cAMP- dipendente fosfori là la glicogeno sintetasi, riducendo la sua attività. La chinasi fosfori la anche la glicogeno fosforilasi chinasi, attivando la sua capacità di fosforilare e di attivare la glicogeno fosforilasi, I'enzima che degrada il glicogeno a glucosio 1-fosfato. La proteina chinasi cAMP-dipendente fosforila anche un inibitore della fosfoproteina fosfatasi, attivandolo. Di conseguenza, i gruppi fosforici aggiunti agli altri enzimi non vengono rimossi. (b) La diminuzione del livello di cAMP fa diminuire la concentrazione di glucosio 1- fosfato, inibendo la degradazione del glicogeno e attivando la sua sintesi. Questo risultato viene ottenuto tramite I'attiv~ionedella fosfoproteina fosfatasi; il gruppo fosforico viene rimosso dall'inibitore che, di conseguenza, viene inattivato. La fosfatasi attiva rimuove quindi i residui fosforici dalla glicogeno fosforilasi chinasi e dalla glicogeno fosforilasi, inibendo la degradazione del glicogeno. La rimozione del gruppo fosforico dalla glicogeno sintetasi, invece, attiva I'enzima e determina, di conseguenza, la sintesi di glicogeno. Maggiore quantità di glucosio disponibile Minore quantità di glucosio disponibile

21 Amplificazione del segnale Una delle funzioni della cascata di chinasi è lamplificazione M M M M

22 Lidrolisi dei fosfatidil-inositolo è legato a diverse vie di segnalazione: 1) Aumenta la concentrazione di calcio intracellulare (tramite lIP 3 ); 2) Attiva la sintesi degli eicosenoidi (tramite lacido arachidonico) 3) Attiva la protein chinasi C (tramite il diacil-glicerolo e il calcio) IP3 si lega attivandoli ai recettori-canale sul RE, provocando luscita di calcio; una volta rilasciato il calcio può mediare fuoriuscita di altro calcio Meccanismo dazione dellIP3 Sistema del fosfatidilinositolo, Ca 2+ e 1,2 diacilglicerolo

23 Il calcio come messaggero intracellulare Sistema di controllo del calcio citosolicoVie di entrata del Ca 2+ in risposta a segnali TessutoOrmone che induce aumento di IP 3 e di Ca 2+ Risposta cellulare Cellule acinose del pancreasAcetilcolinaSecrezione enzimi digestivi Ghiandola salivare (parotide)AcetilcolinaSecrezione di amilasi Cellule del pancreas AceticolinaSecrezione di insulina Muscolatura liscia dei vasi e dello stomacoAcetilcolinaContrazione FegatoVasopressinaConversione glicogeno in glucosio Piastrine del sangueTrombinaAggregazione, cambiamenti di forma, secrezione di ormoni MastocitiAntigeneSecrezione di istamina FibroblastiFattori di crescita peptidici, bombesina e PDGFSintesi di DNA, divisione cellulare Uova di riccio di mareSpermatozoiFormazione membrana di fecondazione Alcuni esempi

24 Figura Variazioni nella concentrazione locale di ioni Ca 2+ in un uovo di riccio di mare dopo la fecondazione. Il Ca 2+ cellulare è stato monitorato per mezzo della fluorescenza del fura-2, attraverso un microscopio (Figura 19.27); a fini grafici, le concentrazioni di Ca 2+ sono espresse secondo una scala graduata di colori (a destra) in micromoli di Ca 2+. La concentrazione di Ca2+ aumenta inizialmente nel punto in cui lo spermatozoo è entrato (la parte in basso a sinistra della cellula) e si innalza, diffondendosi come un'onda. In un tempo successivo, la concentrazione di Ca 2+ diventa elevata e uniforme in tutta la cellula, poi decade uniformemente allo stato di riposo. (Da R.Y. Tsien e M. Poenie, 1986, TIBS, 11, pp ; per gentile concessione di j. Alderton, M.Poenie, R.A. Steinhardt e R.Y. TsienJ Figura La concentrazione citosolica di Ca 2+ può esser monitorata in continuo sfruttando la fluorescenza dei complessi Ca 2+ -fura-2. Aggiunto al mezzo di coltura, l'estere lipofilo del fura-2 (a sinistra) diffonde attraverso la membrana plasmatica e viene idrolizzato a fura-2 dalle esterasi del citosol. Il fura-2, di carattere non lipofilo (a destra) non può attraversare le membrane cellulari e resta nel citosol. In assenza di Ca 2+, il fura-2 non è fluorescente e la fluorescenza dei complessi Ca 2+ -fura-2 è proporzionale alla concentrazione di ioni Ca 2+ del citosol. Le variazioni di calcio intracellulare si possono visualizzare Nelle cellule di grandi dimensioni si possono distinguere differenze nella concentrazione di calcio in regioni specifiche del citosol

25 La calmodulina è strettamente correlata correlata alla troponina delle cellule muscolari scheletriche; 1) fra i bersagli regolati dal complesso Ca 2+ -calmodulina vi sono enzimi e proteine di trasporto come la Ca 2+ -ATPasi; 2) la > parte degli effetti é mediata da protein-chinasi dipendenti dal complesso calcio-calmodulina; Complesso calcio-calmodulina Figura 9.17 La calmodulina, proteina citosolica di 149 aacidi con quattro siti di legame per il calcio, forna il complesso Ca 2+ /calmodulina, un importante regolatore intracellulare. (A) Sequenza amrninoacidica del sito di legame per il calcio situato all'estremità C-terrninale della calmodulina. Ogni sito di legame contiene residui di aspartato, glutammato ed asparagina (mostrati in colore) le cui catene laterali stabiliscono legami ionici con uno ione Ca 2+, formando un'ansa nello scheletro della proteina. Gli altri siti di legame contengono anche residui di treonina e di serina, e gli atomi di ossigeno presenti nelle catene laterali di questi amminoacidi si associano allo ione calcio. (B) Modello di una molecola di calmodulina a cui sono legati quattro ioni calcio (sfere grigie). (C) Rappresentazione schematica della variazione conformazionale indotta dal legame del calcio alla calmodulina. Quando tutti e quattro i siti di legame per il calcio sono occupati, la calmodulina subisce un cambiamento della struttura terziaria. Il risultante complesso Ca 2+ /calmodulina può legarsi a numerose proteine bersaglio, regolandone l'attività. [Parte B cortesemente concessa da Y.S. Babu e W.J. Cook; parti A e C adattate da Lodish et al., 1995.]

26 Regolazione operata dal complesso Ca 2+ -calmodulina Ca 2+ -ATPAsi Fosfodiesterasi Fosforilasi chinasi (FosCh) Chinasi calmodulina dipendente III (CaMKIII) Del fattore eucariotico di allungamento II Adenilato-ciclasi La CaM II fosforila Sinapsina I nel tessuto nervoso Guanilato ciclasi Fosforilazione proteine nucleari e Della membrana Fosforilazione proteine del citoscheletro ( Disassemblaggio dei Microtubuli) Chinasi che fosforila catena leggera della miosina (MLCK) CaM chinasi multifunzionali Ia, Ib, II e IV CaM chinasi specifiche Fosfolipasi

27 Attivazione della chinasi CaM II L'attivazione della chinasi CaM II può servire da traccia di memoria di un precedente impulso di Ca 2+ a causa della proprietà di autofosforilazione La chinasi CaM II é un esempio di chinasi CaM multifunzionale. Attiva la tirosina idrossilasi e di conseguenza la sintesi di catecolammine Fosforila la sinapsina I attivando lesocitosi dei neurotrasmettitori

28 Un esempio classico é la fosforilasi chinasi del muscolo scheletrico che può essere attivata sia dal complesso calcio-calmodulina che dalla protein chinasi A A) Il calcio attiva la contrazione muscolare, libera le risorse enegetiche necessarie (glucosio da glicogeno) sia: 1) attivando la fosforilasi chinasi 2)inibendo la glicogeno sintasi (mediante fosforilazione da parte della chinasi CaM); B) LAMPc, indotto da adrenalina, attiva la PKA che fosforila la fosforilasi chinasi Ciò prepara la cellula muscolare ad una accresciuta domanda di energia, sensibilizzando la fosforilasi chinasi a basse concentrazioni di calcio. La via dell'AMP ciclico e del Ca 2+ interagiscono PKA Ca 2+

29 Ruolo del diacilglicerolo Dà origine ad acido arachidonico, che agisce a sua volta come messaggero essendo usato nella sintesi degli eicosanoidi; Attiva la protein chinasi C la protein chinasi C (PKC) dipende dal calcio; quando attivata da diacilglicerolo fosforila residui di serina e treonina; la concentrazione piu alte di protein chinasi C si trova nel cervello, dove fosforila canali ionici alterando l'eccitabilità della membrana plasmatica; può attivare trascrizione genica secondo due vie

30 Recettori guanilico ciclasi Utilizzati dai peptidi natriuretici atriali, i quali determinano stimolazione del rene ad eliminare acqua e sali e rilassamento dei vasi sanguigni. I recettori guanilico ciclasi mediano il loro effetto, producendo direttamente GMPc che si lega ad una protein chinasi G, attivandola, che fosforila proteine specifiche a livello dei residui di serina e treonina. Segnalazione tramite recettori di superficie collegati ad enzimi. 1) Recettori guanilico ciclasi (produzione di GMPc); 2) recettori tirosina-chinasici; 3) recettori associati a tirosina-chinasi; 4) recettori tirosina fosfatasi; 5) recettori serina/treonina chinasi ;

31 I recettori per l'insulina sono già in forma tetramerica e di conseguenza il legame dell'ormone al suo sito provoca interazione allosterica fra le due metà del recettore che induce l'autofosfilazione del recettore, che si attiva e i suoi domini catalitici fosforilano una proteina chiamata IRS-1 (substrato 1 del recettore dell'insulina) Recettori tirosina-chinasici EGF = Epidermal growth factor IGF-1 = insulin-like growth factor NGF = nerve growth factor PDGF = piastrine derived growth factor M-CSF = factor stimulating Colonie - macrophages FGF = fibroblast i growth factor VEGF = vasculare endothelium growth factor Il legame di un ormone induce dimerizzazione e autofosforilazione dei recettori che in tal modo si attivano

32 1)proteina che attiva la GTPasi (GAP); 2) fosfolipasi C-gamma (PLC-gamma); 3) fosfatidilinositolo 3 chinasi (PI3-chinasi) I residui di tirosina fosforilata sono riconosciuti da proteine con domini SH2

33 Le proteine Ras forniscono il collegamento nelle cascate di reazioni intracellulari attivate dai recettori tirosina-chinasi. Le proteine Ras sono GTPasi monomeriche e possono essere regolata da GTPasi (GAP) che tende a inibirle o da proteine rilascianti GDP le GNRP he tendono ad attivare Ras.

34 Le MAP-chinasi attivate possono migrare nel nucleo e fosforilare ElK-1 attivandolo alla trascrizione del gene fos ; MAP può fosforilare la proteina Jun che si combina con la proteina fos a formare la proteina regolatrice AP-1 che può attivare numerosi altri geni; anche la chinasi C può fosforilare Jun o attivare MAP chinasi chinasi chinasi Ras attiva una cascata di fosforilazioni in serina/treonina che attiva la MAP-chinasi

35 Recettori associati a tirosina chinasi Comprendono recettori per l'ormone della crescita e prolattina; funzionano tramite tirosina chinasi associate che fosforilano varie proteine bersaglio quando il recettore lega il suo ligando Le chinasi coinvolte con questi recettori sono: SRC e JANUS. Figura 5-14 I recettori per l'ormone della crescita (GH), la prolattina e alcuni altri ligandi non possiedono attività tirosina chinasica intrinseca. Il recettore per l'ormone della crescita si dimerizza in seguito al legame di GH, lega una o più tirosina chinasi di tipo JAK che fosforila se stessa e il recettore. Le tirosina chinasi di tipo STAT si legano al complesso e vengono quindi fosforilate. La forma fosforilata di STAT si dissocia sotto forma di dirneri, che vengono successivamente trasportati al nucleo, dove determinano la fosforilazione di fondamentali fattori di trascrizione. JAK, chinasi specifiche per la tirosina di tipo Janus; STAT, trasduttori del segnale e attivatori della trascrizione.

36 Protein chinasi

37 Alcune risposte cellulari sono graduate in maniera semplicemente proporzionale alla concentrazione del ligando (risposta primaria ad ormoni steroidei); In altri casi la risposta cellulare é piu complessa, man mano che aumenta il numero di molecole effettrici che deve legarsi simultaneamente per attivare un molecola bersaglio. Risposta ai segnali extracellulari

38 Adattamento della cellula bersaglio Quando la cellula bersaglio é sottoposta ad uno stimolo per un periodo prolungato, la sua capacità di risposta diminuisce (processo di adattamento e sensibilizzazione). Adattamento lento Gli ormoni proteici una volta legati ai loro recettori vengono internalizzati con i loro recettori mediante un meccanismo di endocitosi e poi sottoposti a degradazione lisosomiale, mentre i recettori riciclano; a volte anche i recettori sono degradati e questo comporta una diminuzione nel tempo se essi sono sottoposti a continua esposizione del ligando (down regulation) Adattamento rapido comporta fosforilazione del recettore Trasporto degli ormoni e loro eliminazione (mg/min) rimossi ml depurati VCM = = = clearance metabolica mg/ml di plasma minuti

39 Recettori muscarinici dell'acetilcolina mediante attivazione di proteine Gi (inibitrici) che possono: 1) inibire l'adenilato ciclasi; 2) promuovere direttamente l'apertura dei canali del K+ sulla membrana delle cellule muscolari cardiache, rendendo piu difficile la depolarizzazione della cellula e contribuendo all'effetto inibitorio dell'acetilcolina sul cuore; Alcuni recettori fanno diminuire l'AMPc inibendo l'adenilato ciclasi tramite una proteina G trimerica inibitrice Alcune proteine G regolano direttamente canali ionici


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