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Analisi a due fotoni dellaccumulo di ioni divalenti in colture cerebellari di ratto Candidato: Alessandro Esposito INFM Istituto Nazionale per la Fisica.

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1 Analisi a due fotoni dellaccumulo di ioni divalenti in colture cerebellari di ratto Candidato: Alessandro Esposito INFM Istituto Nazionale per la Fisica della Materia IBF - CNR Istituto di Biofisica Consiglio Nazionale delle Ricerche Università degli Studi di Genova Relatori: Prof.Mauro Robello Dott.sa Carla Marchetti Correlatore: Prof.Maurizio Canepa Facoltà di Scienze Matematiche Fisiche e Naturali - Corso di Laurea in Fisica

2 Importanza degli ioni divalenti Ca 2+ e Pb 2+ Ca 2+ Pb 2+ Ca 2+ Il calcio, secondo messaggero Pb 2+ Il piombo, interferisce con alcune funzioni del calcio Meccanismi di permeazione Azione del piombo Pb 2+ Ca 2+ IntroduzioneMisure RatiometricheMisure di QuenchingConclusioniTPM 2 H.A.Godwin, The Biological Chemisrty of Lead, Current Opinion in Chemical Biology 5, (2001) M.Mazzolini,S.Traverso,C.Marchetti, Multiple pathways of Pb(2+) […], J.Neurochem.2001 Oct;79(2):407-16

3 Modello biologico neuroni cerebellari di ratto Caratterizzazione: - Microscopia in fluorescenza con eccitazione a due fotoni (TPM) - sonda fluorescente permeabile alla membrana: Indo-1 IntroduzioneMisure RatiometricheMisure di QuenchingConclusioniTPM Ca 2+ 3 A.Periasamy, Methods in Cellular Imaging, Oxford University Press (2001) A.Takahashi […] and B.Herman, Mesurement of Intracellular Calcium, Physiol.Review Vol.79 No4 (1999)

4 Eccitazione a singolo fotone Microscopia a due fotoni Microscopia in fluorescenza a scansione laser TPLSM CLSM J.J. Sakurai, Modern Quantum Mechanics, The Benjamin/Cummings Publishing Company, Inc. (1985) Max Born and Emil Wolf, Principles of Optics, Pergamon Press (1970) IntroduzioneMisure RatiometricheMisure di QuenchingConclusioniTPM Microscopia a due fotoni ~350nm (Teoria perturbativa al secondordine) E0E0 E1E1 Selezione del piano focale durante leccitazione Utilizzo di radiazione rossa e nel vicino infrarosso anziché Vis-UV 4

5 Caratteristiche rilevanti della TPM Luce IR-NIR per eccitare sonde Vis-UV Minore fototossicità e fotodanneggiamento Confocalità Lunghezza donda: 700nm ( nm) Potenza media sul campione: 5-7mW (0-70mW) Laser pulsato: 80MHz ; fs Risoluzione Assiale: 700nm Laterale: 250nm Temporale: 3s/pxl IntroduzioneMisure RatiometricheMisure di QuenchingConclusioniTPM Sezioni ottiche 2 m Analisi delle distribuzioni di fluorescenza nello spazio (3D) e nel tempo superfici volumi 5 A.Diaspro, Confocal and Two-Photon Microscopy, Wiley-Liss (New York, 2002) F.M. Wahl, Digital Image Signal Processing, Artech House (1987)

6 TPM: apparato sperimentale A.Diaspro […] and M.Robello (1999b), Adapting a compact confocal […], Microsc. Res. Tech. 47, A.Diaspro […] M.Robello and F.Olivini (2001), Two-photon microscopy […], J.Biomed.Opt. Tsunami Millennia IntroduzioneMisure RatiometricheMisure di QuenchingConclusioniTPM Filtro neutro Microscopio TE300Eclipse (Nikon) Testa di Scansione (PCM2000) PMT1 PMT2 6

7 Perfusione e soluzioni IntroduzioneMisure RatiometricheMisure di QuenchingConclusioniTPM Misure di calcio intracellulare: Depolarizzazione (KCl75mM) Acido N-metil-D-aspartico 100M (NMDA) Misure di accumulo di piombo: Piombo (20M) Lantanio (25M) 7

8 Proprietà spettrali dellIndo-1: misure raziometriche IntroduzioneMisure RatiometricheMisure di QuenchingConclusioniTPM Ca 2+ HQ405/30HQ485/30 Fotodanneggiamento e perdita di sondaDisomogeneità della marcatura Concentrazioni assolute di calcio 8 G.Grynkiewicz, M.Poenie and R.Y.Tsien, A New Generation of Ca2+ Indicators with Greatly Improved Fluorescence Properties, The Journal of Biological Chemistry Vol.260 No.6 25th March

9 Immagini raziometriche 1m controllo Indo-1 libero (485nm) 0 Intensità (a.u.) 183 Indo-1 legato (405nm) 0 Intensità (a.u.) 250 NMDA (100M) 0 Rapporto (a.u.) 2.0 Rapporto 405nm/485nm IntroduzioneMisure RatiometricheMisure di QuenchingConclusioniTPM 9

10 Misure raziometriche Sonda legata (405nm) Sonda libera (485nm) Rapporto NMDA(100M) KCl (75mM) Intensità di fluorescenza (a.u.) Rapporto 405nm/485nm Tempo (s) IntroduzioneMisure RatiometricheMisure di QuenchingConclusioniTPM 10

11 Proprietà spettrali dellIndo-1: quenching HQ460/50 Pb 2+ IntroduzioneMisure RatiometricheMisure di QuenchingConclusioniTPM Non è più una sonda raziometrica Stimare la concentrazione di sonda Stimare il fotodanneggiamento della sonda 11 M.E.Legare, R.Barhoumi, E.Hebert, G.R.Bratton, R.C.Burghardt and E.Tiffany-Castiglioni, Analysis of Pb2+ Entry into Cultured Astroglia, Toxicological Sciences 46, (1998)

12 Marcatura tramite micropipetta La sonda diffonde piuttosto velocemente nel citoplasma. Indo M fornisce misure di intensità di fluorescenza prossime a quelle osservate con la la marcatura tramite diffusione da membrana 12 Micropipetta con Indo-1 100M IntroduzioneMisure RatiometricheMisure di QuenchingConclusioniTPM Brust-Mascher and Webb, Calcium Induced by Large Voltage Pulses in Fish Keratocytes,Biophy.J. Vol Ricostruzione 3D e sezionamento virtuale di un neurone marcato tramite micropipetta. 5m 0255 Intensità (a.u.)

13 Permeazione del piombo IntroduzioneMisure RatiometricheMisure di QuenchingConclusioniTPM 6115M 5411M 13

14 Inibizione del lantanio Pb 2+ La 3+ IntroduzioneMisure RatiometricheMisure di QuenchingConclusioniTPM 14

15 Analisi dellaccumulo di piombo 4411pM Piombo legato:6115M e probabile saturazione del trasporto Piombo libero: 4411pM Parziale inibizione del lantanio IntroduzioneMisure RatiometricheMisure di QuenchingConclusioniTPM 15 R.H.S.Westerink and Henk P.M.Vijverberg, Ca 2+ -indipendent vesicular catecholamine release in PC12 cells by nanomolar concentrations of Pb 2+, Journal of Neurochemistry, 2002 Vol

16 Conclusioni IntroduzioneMisure RatiometricheMisure di QuenchingConclusioniTPM Caratterizzazione dellautofluorescenza, fotodanneggiamento e spettri dellIndo-1 Elaborazione di codici (Matlab – VisualBasic) per lelaborazione ed analisi (3D-t) delle immagini, lassistenza allacquisizione Studio delle tecniche raziometrica e del quenching Analisi delle variazioni di concentrazioni di calcio Probabile saturazione del trasporto del piombo Inibizione del lantanio 16 Per approfondimenti:


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