Università degli Studi di Genova

Presentazione sul tema: "Università degli Studi di Genova"— Transcript della presentazione:

1 Università degli Studi di Genova
Facoltà di Scienze Matematiche Fisiche e Naturali - Corso di Laurea in Fisica Analisi a due fotoni dell’accumulo di ioni divalenti in colture cerebellari di ratto Genova, 9 Ottobre 2002 Relatori: Prof.Mauro Robello Dott.sa Carla Marchetti Analisi a due fotoni dell’accumulo di ioni divalenti in colture cerebellarei di ratto. Questo lavoro di tesi è stato condotto nei laboratori di Biofisica dell INFM presso il Dipartimento di Fisica, in collaborazione con l’istituto di Biofisica del CNR Correlatore: Prof.Maurizio Canepa Candidato: Alessandro Esposito INFM Istituto Nazionale per la Fisica della Materia IBF - CNR Istituto di Biofisica Consiglio Nazionale delle Ricerche

2 Importanza degli ioni divalenti Ca2+ e Pb2+
Introduzione Misure Ratiometriche Misure di Quenching Conclusioni TPM Importanza degli ioni divalenti Ca2+ e Pb2+ Ca2+ Il calcio, secondo messaggero Pb2+ Il piombo, interferisce con alcune funzioni del calcio Meccanismi di permeazione Azione del piombo Pb2+ Ca2+ Genova, 9 Ottobre 2002 All’interno delle cellule avvengono complessi meccanismi fisiologici e molecolari e lo ione calcio riveste un ruolo importantissimo quello cioè di mediare segnali dall’esterno della celulla o fra scomparti intracellulari. Lo ione piombo non è invece un elemento con un ruolo biologico naturale ma si trova negli organismi poiché è uno dei maggiori inquinanti a livello mondiale. L’effetto più importante della sua azione è rappresentato dalle sue capacità neurotossiche ed uno dei meccanismi di tossicità è quello di interferire con i processi molecolari mediati dal calcio. Nonstante il considerevole lavoro sperimentale non sono ancora del tutto chiari i meccanismi di permeazione, sopprattutto in condizioni basali (cioè di non stimolazione di una cellula), e quelli di azione del piombo all’interno del citoplasma (l’interno della cellula) Ca2+ Pb2+ H.A.Godwin, “The Biological Chemisrty of Lead”, Current Opinion in Chemical Biology 5, (2001) M.Mazzolini,S.Traverso,C.Marchetti, “Multiple pathways of Pb(2+) […]”, J.Neurochem.2001 Oct;79(2):407-16 2

3 Modello biologico neuroni cerebellari di ratto Caratterizzazione:
Introduzione Misure Ratiometriche Misure di Quenching Conclusioni TPM Modello biologico neuroni cerebellari di ratto Caratterizzazione: Microscopia in fluorescenza con eccitazione a due fotoni (TPM) sonda fluorescente permeabile alla membrana: Indo-1 Genova, 9 Ottobre 2002 Ca2+ Da ciò si comprende l'importanza degli studi dell'accumulo di questi ioni soprattutto in modelli di cellule nervose. Ho studiato l'accumulo in neuroni cerebellari di ratto utilizzando la microscopia in fluorescenza con eccitazione a due fotoni. Per indagare la distribuzione di calcio e piombo intracellulare ho utilizzanto una sonda fluorescente (l'Indo-1), molecola in grado di permeare attraverso la membrana e di emettere fotoni per fluorescenza se opportunamente stimolata. L'Indo-1 ha un'elevata selettività per lo ione calcio e lo ione piombo ed intergando con questi varia le sue proprietà spettrali. Questo è un tipica immagine di neurone cerebellare acquisita con il microscopio a due fotoni in cui si evidenza al dstribuzione di calcio intracellulare A.Periasamy, “Methods in Cellular Imaging”, Oxford University Press (2001) A.Takahashi […] and B.Herman, “Mesurement of Intracellular Calcium”, Physiol.Review Vol.79 No4 (1999) 3

4 Microscopia a due fotoni
Introduzione Misure Ratiometriche Misure di Quenching Conclusioni TPM Microscopia a due fotoni (Teoria perturbativa al second’ordine) TPLSM CLSM ~350nm E0 E1 Microscopia in fluorescenza a scansione laser Eccitazione a singolo fotone Selezione del piano focale durante l’eccitazione Utilizzo di radiazione rossa e nel vicino infrarosso anziché Vis-UV Genova, 9 Ottobre 2002 Microscopia a due fotoni Il microscopio utilizzato è un microscopio in fluorescenza a scansione laser, in cui come sorgente luminosa si utilizza appunto un laser focalizzato all'interno del campione. In questo esempio, soluzione contenente una molecola fluorescente, è illuminata da un fascio laser focalizzato in un punto all'interno del campione. La sonda nel doppio cono illuminato dal laser emette per fluorescenza. Questa è invece l'eccitazione a due fotoni in cui solo in un piccolo volume a fuoco la sonda fluorescente viene eccitata. Spostando questo volumetto dalle dimensioni della frazione del femtolitro, eseguendo una scansione con il fascio laser lungo un piano è possible ottenere informazioni riguardanti solo la sezione ottica che si sta selettivamente eccitando. Si può comprendere questo fenomeno attraverso la teoria delle perturbazioni sviluppata al second'ordine. Utilizzando l'Indo-1 che ha uno spettro di assorbimento centrato sui 350nm e radiazione di 700nm, si ha che evidentemente la sezione d'urto del processo del prim'ordine è trascurabile. In queste condizioni sperimentali le uniche transizioni osservabili sono quelle del second'ordine che hanno sezione d'urto con un massimo vicino ai 700nm. Queste transizioni sono mediate, in uno schema semplificato, da un livello virtuale intermedio e dunque radiazione a 700nm può essere in grado di eccitare la molecola. La probabilità di transizione per unità di tempo è proporzionale al quadrato dell'intensità della radiazione incidente. L'intensità del fascio laser focalizzato, segue una distribuzione lorenziana lungo l'asse ottico. Poichè il numero di fotoni assorbiti per assorbimento a due fotone è proporzionale al quadrato dell'intensità, allontanandosi dal punto a fuoco il numero di fotoni assorbiti e, di conseguenza, la fluorescenza emessa, decade con la quarta potenza della distanza dal punto focale. E' questo il processo per cui è possibile selezionare una sezione ottica in eccitazione. J.J. Sakurai, “Modern Quantum Mechanics”, The Benjamin/Cummings Publishing Company, Inc. (1985) Max Born and Emil Wolf, “Principles of Optics”, Pergamon Press (1970) 4

5 Caratteristiche rilevanti della TPM
Introduzione Misure Ratiometriche Misure di Quenching Conclusioni TPM Caratteristiche rilevanti della TPM Luce IR-NIR per eccitare sonde Vis-UV Minore fototossicità e fotodanneggiamento Confocalità Sezioni ottiche 2m Analisi delle distribuzioni di fluorescenza nello spazio (3D) e nel tempo superfici Lunghezza d’onda: 700nm ( nm) Potenza media sul campione: 5-7mW (0-70mW) Laser pulsato: 80MHz ; fs Risoluzione Assiale: 700nm Laterale: 250nm Temporale: 3s/pxl volumi Genova, 9 Ottobre 2002 Abbiamo scelto la microscopia a due fotoni rispetto ai confocali con sorgenti a singolo fotone in quanto l'utilizzo di radiazione infrarossa è meno tossica per la cellula, si riduce il fotodanneggiamento della sonda, permette un più facile uso dell'Indo-1 che richederebbe appunto radiazione ultraviletta e rende comunque disponibili analisi di distribuzioni di sonda nelle tre dimensioni oltre che, ovviamente, nel tempo. La risoluzione dello strumento è pari a 700 e 250nm assiale e laterale rispettivamente con 3 us epr pixel di risoluzione temporale. il laser utilizzato è un laser pulsato al femtosecondo per ottenere potenze di picco sufficientemente alte da poter osservare il fenomeno desccritto, ma potenze medie sufficientemente basse da non danneggiare il campione biologico. La confocallità intrineseca del sistema è utile per ottenere immagini a più elevato rapporto segnale rumore e per poter ricostruire distribuzioni di fluorescenza in tre dimensioni. Per esempio, questo è un insieme di sezioni ottiche di un neurone, distanti l'una dall'altra 1u (inserire tavola colori) in cui le zone rosse rappresntano zone a più alta fluorescenza, quelle blu bassa e azzurre-verdi intermedie. Si può comprendere come l'elaborazione delle immagini sia fondamentale per questo tipo di misure e, infatti, la programmazione ha rappresentato una parte importante del presente lavoro di tesi. Grazie alle informazioni raccolte è possibile quindi ricostruire distribuzioni nello spazio con la ricostruzione del volume cellulare e l'analisi delle distribuzioni di fluorescenza lungo qualsiasi sezione virtuale. A.Diaspro, “Confocal and Two-Photon Microscopy”, Wiley-Liss (New York, 2002) F.M. Wahl, “Digital Image Signal Processing”, Artech House (1987) 5

6 TPM: apparato sperimentale
Introduzione Misure Ratiometriche Misure di Quenching Conclusioni TPM TPM: apparato sperimentale Microscopio TE300Eclipse (Nikon) Testa di Scansione (PCM2000) PMT1 PMT2 Genova, 9 Ottobre 2002 Filtro neutro Il Millennia è un laser allo stato solido che emette a 532 (controllare) nm. E' la pompa dello Tsunami, cavità laser che utilizza come mezzo attivo un cristallo al Titanio Zaffiro che permette di selezionarne la lunghezza d'onda da 690 a 105nm circa. L'intensità del fascio viene attenuato da un filtro neutro a densità variabile e portato dentro la testa di scansione, PCM2000 della Nikon, che contiene le ottiche e gli specchi galvanometrici per eseguire la scansione del laser lungo la sezione ottica ela raccolta del segnale di ritorno dal microscopio TE300 Eclipse, sempre della Nikon. La scansione lungo zeta è invece fatta spostando il fuoco dell'obbiettivo. Il segnale di flurescenza può essere diviso in due fasci, filtrato e portato a due fotomoltiplicatori tramie fibra ottica in mdo tale da ptoer osservare due diversi intervalli degli spettri emessi. L'acquisizione, il controllo dei fotomoltiplicatori e della scansione sono assistiti da calcolatore. Tsunami Millennia A.Diaspro […] and M.Robello (1999b), “Adapting a compact confocal […]”, Microsc. Res. Tech. 47, A.Diaspro […] M.Robello and F.Olivini (2001), “Two-photon microscopy […]”, J.Biomed.Opt. 6

7 Perfusione e soluzioni
Introduzione Misure Ratiometriche Misure di Quenching Conclusioni TPM Perfusione e soluzioni Misure di calcio intracellulare: Depolarizzazione (KCl75mM) Acido N-metil-D-aspartico 100M (NMDA) Misure di accumulo di piombo: Piombo (20M) Lantanio (25M) Genova, 9 Ottobre 2002 Questo è il micrscopio su cui è alloggiata la cameretta di perfusione ove sono contenuti i neuroni adesi ad un vetrino. Grazie ad un sistema di elettrovalvole la soluzione esterna in cui sono mantenute le cellule può essere cambiata. Per le misure di calcio intracellulare ho depolarizzato la cellula atraverso una soluzione ad alto potassio che induce canali ionici di membrana ad aprirsi elevando la concentrazione interna di calcio. Inoltre ho utilizzato acido n-metil-d-aspartico (NMDA), molecola che interagisce con un recettore eccitatorio che induce l'apertura di un secondo tipo di canale che ha anch'esso come effetto l'ingresso di calcio nel citoplasma. Per le misure di piombo ho aggiunto alla soluzione esterna di controllo piombo 20uM in assenza o meno di lantanio. Il lantanio è un generico bloccante dei canali ionici ed una sua azione sulla permeazione del piombo potrebbe dare qualche indizio sulla tipologia di trasporto coinvolto 7

8 Proprietà spettrali dell’Indo-1: misure raziometriche
Introduzione Misure Ratiometriche Misure di Quenching Conclusioni TPM Proprietà spettrali dell’Indo-1: misure raziometriche HQ405/30 HQ485/30 Ca2+ Concentrazioni assolute di calcio  Genova, 9 Ottobre 2002 Fotodanneggiamento e perdita di sonda L'indo-1 ha uno spettro centrato sui 485nm qui rappresentato dalla urva azzurra. L'interazione con il calcio genera uno spostamento dello spettro di emissione vero i 405nm. E' possibile quindi misurare l'intensità di fluorescenza su due distinte bande dello spettro centrate rispettivamente a 405 e 485nm e larghe 30nm. Più calcio lega molecole di Indo più il segnale raccolto con il filtro HQ405/30 cresce ed il segnale sui 485nm diminuisce e, quindi, all'aumentare del calcio il rapporto delle due intensità misurate a 405 e 485nm cresce. I vantaggi delle misura di un rapporto, da cui il ermine misure raziometriche, anzichè di singole intensità di fluorescenza sono immediati. Si eliminano dalla misura i contributi del sistema di acquisizioni quali potenza, guadagno, periodo di integrazine del segnale, si elimina la dipendenza della misura dalla quantità di sonda interna. Artefatti dovuti a fotodanneggiamento della sonda o perdita di Indo-1 attraverso la membrana cellulare, nonchè alla disomogeneità della marcatura sono eliminati. Inoltre attraverso queta tecnica è possibile misurare la concentrazione assoluta di calcio e non solo avere un indice relativo delle sue variazioni. Nella formula raziometrica per la derivazione delle concentrazioni Rmax ed Rmin sono i valori massimi e minimi che il rapproto può assumere durante un esperimento ed assieme al fattore di proporzionalità Q possono essere stimati sperimentalmente utilizando soluzioni con 0 calcio o calcio saturante. Kca è la costante di equilibrio di Indo e calcio. Disomogeneità della marcatura G.Grynkiewicz, M.Poenie and R.Y.Tsien, “A New Generation of Ca2+ Indicators with Greatly Improved Fluorescence Properties”, The Journal of Biological Chemistry Vol.260 No.6 25th March 8

9 Immagini raziometriche
Introduzione Misure Ratiometriche Misure di Quenching Conclusioni TPM Immagini raziometriche Rapporto (a.u.) 2.0 Rapporto 405nm/485nm 1m controllo Indo-1 libero (485nm) Intensità (a.u.) 183 Indo-1 legato (405nm) Intensità (a.u.) 250 Genova, 9 Ottobre 2002 NMDA (100M) Questa è un'immagine in fluorescenza di un neurone cerebellare, ottenuta misurando la banda settrale corrispondente alla sonda libera, in condizioni basali. Le macchie di maggiore fluorescenza possono essere interpretate sia come zone ad alto calcio sia come zone a maggiore concenrazione di sonda. Questa è invece la corrisponmdente immagine misrata a 405nm in cui è chiaro come le macchie rappresentino zone di accumulo dell'Indo. Il rapporto delle due è la corretta stima della distribuzione di calcio intracellulare. Queste immagni sono state acqusite in condizioni basale, mentre analoga misura condotta in presenza di NMDA, rivela l'aumento di calcio nel citoplasma. 9

10 Intensità di fluorescenza (a.u.)
Introduzione Misure Ratiometriche Misure di Quenching Conclusioni TPM Misure raziometriche Sonda legata (405nm) Sonda libera (485nm) Rapporto NMDA(100M) KCl (75mM) Intensità di fluorescenza (a.u.) Rapporto 405nm/485nm Tempo (s) Genova, 9 Ottobre 2002 Questo è il grafico relativo alla medie dei segnali calcolate sulla serie temporale da cui sono state prese le immaggini precedentemente illustrate. In verde ed in blu sono rappresentate le intensità medie di fluorescenza, misurate a 405 e 485nm rispettivamente. In alto, le barre nere, indicano la stimolazione con depolarizzazione prima e con acido d n metil aspartico dopo. Il rapporto del segnali, graficato in nero, mostra che in entrambi i casi il calcio intracellulare viene elevato dalle stimolazione ma, mentre l'apertura dei canali voltaggio dipendenti induce una risposta non sostenuta nel tempo, l'NMDA porta ad un aumento sostenuto di calcio sino al lavaggio con soluzione standard. Si può notare che le singole intensità di fluorescenza, nella parte finale del grafico ove non è presente alcuna stimolazione, tendono a diminuire. Ciò dipende dal fotodanneggiamento della sonda, ma il rapporto invece non è alterato da questo fenomeno. 10

11 Proprietà spettrali dell’Indo-1: quenching
Introduzione Misure Ratiometriche Misure di Quenching Conclusioni TPM Proprietà spettrali dell’Indo-1: quenching HQ460/50 Pb2+ Genova, 9 Ottobre 2002 Non è più una sonda raziometrica Abbiamo scelto l'Indo qauale sonda fluorescente poichè è in grado di interagire anche con il piombo. Non esiste una sonda specifica studiata per tale ione ed il vantaggio dell'Indo sulle altre sonde è che il legame con il piombo genera una variazione dello spettro marcatamente differente rispetto alle proprietà spetrali della sonda libera o legata allo ione per cui era stata studiata, in questo caso il calcio. Come potete vedere nel grafico la sonda incorre nel fenomeno propriamente detto di quenching. In pratica il piombo estingue la fluorescenza dell'Indo. E' possibile quindi analizzare le variazioni di fluorescenza per determinare la quantità di piombo accumulato all'interno della cellula e che si è legato alla sonda o meno. L'Indo-1 non è più raziometrica con il piombo ed è stato dunque necessario stimare la concentrazione di sonda fluorescente all'interno dei neuroni, ma anche il fotodanneggiamento perchè concorre, assieme al quenching, a diminuire la fluorescenza del campione. Stimare la concentrazione di sonda Stimare il fotodanneggiamento della sonda M.E.Legare, R.Barhoumi, E.Hebert, G.R.Bratton, R.C.Burghardt and E.Tiffany-Castiglioni, “Analysis of Pb2+ Entry into Cultured Astroglia”, Toxicological Sciences 46, (1998) 11

12 Marcatura tramite micropipetta
Introduzione Misure Ratiometriche Misure di Quenching Conclusioni TPM Marcatura tramite micropipetta Micropipetta con Indo-1 100mM Ricostruzione 3D e sezionamento virtuale di un neurone marcato tramite micropipetta. 5mm 255 Intensità (a.u.) Genova, 9 Ottobre 2002 La sonda diffonde piuttosto velocemente nel citoplasma. Indo-1 100mM fornisce misure di intensità di fluorescenza prossime a quelle osservate con la la marcatura tramite diffusione da membrana Con l'uso dell'Indo permeabile alla membrana cellulare non si conosce di fatto la cocnentrazione interna finale di sonda. Ho quindi marcato alcuni neuroni attraverso una micropipetta contenente indo-1 impermeabile alla membrana cellulare e confrontato le fluorescenze emesse nei due tipi di marcature. A sinistra potete vedere appunto la ricostruzione tridimensionale in sezione, di un neurone in contatto con la micropipetta. La sonda diffonde piuttosto velocemente nel citoplasma e le misure all'equlibrio hanno permesso di stimare che nei differenti esperimenti si hanno concentrazioni di Indo-1 fra i 50 e i 130uM in buon accordo con i dati di letteratura. Brust-Mascher and Webb, “Calcium Induced by Large Voltage Pulses in Fish Keratocytes”,Biophy.J. Vol 12

13 Permeazione del piombo
Introduzione Misure Ratiometriche Misure di Quenching Conclusioni TPM Permeazione del piombo 6115M 5411M Genova, 9 Ottobre 2002 Questi sono i risultati della statistca delle variazioni di fluorescenza. In rosso la stima del fotodanneggiamento della sonda, in grigio le variazioni osservate durrante gli esperimenti di quenching con il piombo. Si osserva come l'incremento delle variazioni in conseguenza della perfusione di piombo sia significativo. Sottraendo quindi il contributo del fotodanneggiamento della sonda ed utilizzando le stime di concentrazione di Indo ho ottenuto una statistica rappresentativa dell'ingresso dell'accumulo di piombo intracellulare. In conseguenza della perfusione di piombo 20uM per 90 secondi si ha un accumulo pari uM. Successiva analoga perfusione ha un basso incermento della stima puntuale evidenziando un fenomeno di saturazione. -1+-3uM 13

14 Inibizione del lantanio
Introduzione Misure Ratiometriche Misure di Quenching Conclusioni TPM Inibizione del lantanio Pb2+ La3+ Genova, 9 Ottobre 2002 Ripetendo gli esperimenti con la presenza di lantanio si osserva una significativa inibizione del processo di permeazione e quindi di accumulo nel citoplasma. La curva in verde infatti rappresenta il piombo kegatio alla sonda flurescente durante gli esperimenti conditti in presenza di lantanio. Linibizione pari al % si riscontra anche nella scomparsa o marcata attenuazione della saturazione. 14

15 Analisi dell’accumulo di piombo
Introduzione Misure Ratiometriche Misure di Quenching Conclusioni TPM Analisi dell’accumulo di piombo Piombo legato:6115M e probabile saturazione del trasporto Piombo libero: 4411pM Parziale inibizione del lantanio 4411pM Genova, 9 Ottobre 2002 Ho elaborato un'analoga statistica per il piombo libero nel citoplasma ed otenuto un valore nell'intervallo picomolare. E' dimostrato in letteratura come concentrazioni di questo tipo pssano avere effetti biologici rilevanti. Si conclude quindi che, per quanto rigarda l’analisi dell’accumulo di piombo, questo ione è in grado di accumularsi su intervalli di concentrazioni dell’ordine micromolare, con una frazione libera dell’ordine picomolare che potrebbe mediare un’inibizione del trasporto del piombo stesso. Trasporto od insieme di meccanismi di trasporto che può essere parzialmente inibito dal lantanio R.H.S.Westerink and Henk P.M.Vijverberg, “Ca2+-indipendent vesicular catecholamine release in PC12 cells by nanomolar concentrations of Pb2+”, Journal of Neurochemistry, 2002 Vol 15

16 Per approfondimenti: http://www.fantagp.net/alessandro/research/
Introduzione Misure Ratiometriche Misure di Quenching Conclusioni TPM Conclusioni Studio delle tecniche raziometrica e del quenching Analisi delle variazioni di concentrazioni di calcio Probabile saturazione del trasporto del piombo Inibizione del lantanio Genova, 9 Ottobre 2002 Caratterizzazione dell’autofluorescenza, fotodanneggiamento e spettri dell’Indo-1 Elaborazione di codici (Matlab – VisualBasic) per l’elaborazione ed analisi (3D-t) delle immagini, l’assistenza all’acquisizione In questo lavoro di tesi ho quindi studiato ed impiegato le tecniche di misura raziometrica e del quenching per l’analisi della variazioni del calcio e del piombo, dimostrando una probabile saturazione del trasporto di piombo ed una sua parziale inibizione del lantanio. Parallelamente a questi risultati ho ottenuto una caratterizzazione dell’autofluorescenza, del fotodanneggiamento e degli spettri dell’Indo.1, oltre ad aver elaborato codice in Matlab e Visualbasic per l’elaborazione e l’analisi di immagini tridimensionali, serie temporali e per l’assistenza dell’acquisizione Per approfondimenti: 16