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Corso di Biologia Molecolare - Laurea Triennale MODULO DI REGOLAZIONE POST-TRASCRIZIONALE 1) Metodiche per lo studio dellRNA (trascrizione in vitro, Northern.

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1 Corso di Biologia Molecolare - Laurea Triennale MODULO DI REGOLAZIONE POST-TRASCRIZIONALE 1) Metodiche per lo studio dellRNA (trascrizione in vitro, Northern blot, interazioni nnRNA-proteine) 2) Produzione delle estremità 3 degli mRNA - La poliadenilazione e U7 snRNA 3) Lo splicing e i piccoli RNA nucleari (regolazione di splicing – L32) 4) RNA interference e miRNA Materiale didattico: Materiale disponibile su: Testi consigliati: Biologia Molecolare – R.F. Weaver – Mc Graw Hill - Biologia Molecolare della cellula –Lodish et al. Ed. Zanichelli Il Gene - B. Lewin, Ed. Zanichelli

2 Quale è la differenza tra lRNA ed il DNA? L RNA ha luracile al posto della timina L RNA ha il ribosio al posto del desossiribosio L RNA è a singola elica, rispetto alla doppia elica del DNA, ma può strutturarsi in conformazioni a doppia elica molto complesse

3 Differenze tra DNA e RNA L RNA ha luracile al posto della timina CH3 timina

4 Desossi-ribosio DNA RNA O OH O 5 ribosio P Base azotata PP O OH H O 5 P Base azotata PP

5 Queste differenze hanno delle implicazioni funzionali ed evolutive Le prime molecole viventi dovevano essere in grado di replicare e svolgere funzioni Agli inizi degli anni 80 furono scoperti RNA che erano in grado di ricopiare altre molecole di RNA e che svolgevano funzioni catalitiche simili a quelle svolte dagli enzimi proteici mRNA splicing e la traduzione sono ribo-enzimi lRNA regola la stabilità di altre molecole di RNA parte del genoma deriva da elementi ad RNA

6 LRNA è in grado di replicare se stesso RNA RNA proteine ? Mondo ad RNA

7 Solo i polimeri di RNA hanno mostrato capacità replicativa. catalytic (+) strand template (–) strand catalytic (+) strand copies unfolded template (–) strand two catalytic (+) strands and original template (–) strand Se lRNA può essere sia enzima che stampo, e lRNA può replicare se stesso….ecco la prima molecola vivente! Cech dimostrò che lRNA poteva polimerizzare legami fosfodiesterici ricopiando un templato di RNA

8 Protogenoma molecole di RNA autoreplicanti capaci di dirigere semplici reazioni biochimiche

9 Verso un mondo a DNA sintesi di deossiNTP da riboNTP - sintetasi mutanti che incorporavano dNTP (retrotrascrittasi) - prime sintesi di DNA vantaggi del DNA - desossiribonucleotidi più stabili perché manca lOH in 2 sullo zucchero OH H

10 upstream elements promoter elements transcription START site introns exons TRANSCRIPTION CAPPING SPLICING POLYADENYLATION m7Gm7G m7Gm7G AAAAAAAAAn m7Gm7G TRANSPORT TRANSLATION gene pre-mRNA polyadenylated pre-mRNA mature mRNA Espressione genica negli eucarioti

11 La regolazione post-trascrizionale Per tanti anni lo studio della regolazione dellespressione genica si è concentrato sul controllo trascrizionale. Il motivo risiede nel fatto che i primi geni isolati codificavano per prodotti espressi nel differenziamento terminale (prevalentemente sotto controllo trascrizionale - globine, immunoglobuline, ovalbumina) Quando si sono isolati i geni housekeeping o quelli finemente modulati nel differenziamento cellulare ci si è accorti che molta parte della regolazione dellespressione genica avveniva a livello post-trascrizionale

12 Perché studiare lRNA? splicing/processing sn-snoRNAs poliadenilazione/formazione 3 snRNAs modificazioni (CH 3, U) snoRNAs trasporto traduzione miRNAs editing gRNAs stabilità siRNAs Regolazione post-trascrizionale nucleus cytoplasm

13 RNA non codificanti large - rRNA 18+28S Xist small - 5S rRNA traduzione tRNA traduzione snRNAs splicing snoRNAs modificaz./process. rRNA scRNAs controllo traduzionale gRNAs editing piRNAs stabilità del genoma miRNAs controllo traduzionale siRNAs stabilità dellRNA rasiRNAs silenziamento trascriz. …?…. …?… …… La maggior parte dei trascritti del genoma sono RNA non codificanti per proteine ……

14 Metodi di studio dellRNA Trascrizione in vitro Trascrizione in vitro Northern blot Northern blot Preparazione di estratti cellulari Preparazione di estratti cellulari Studio delle interazioni tra RNA e proteine Studio delle interazioni tra RNA e proteine Trascrizione in vitro Trascrizione in vitro Northern blot Northern blot Preparazione di estratti cellulari Preparazione di estratti cellulari Studio delle interazioni tra RNA e proteine Studio delle interazioni tra RNA e proteine

15 Trascrizione in vitro dellRNA Procedura Procedura -Clonare il DNA stampo in un vettore contenente un promotore per le RNA polimerasi fagiche (T7 o SP6) -Linearizzare il DNA stampo con enzimi di restrizione (*) -Incubare in provetta DNA, ribonucleotidi trifosfato e RNA polimerasi -Lasciare procedere la reazione per 1-2h a 37°C -estrarre lRNA Procedura Procedura -Clonare il DNA stampo in un vettore contenente un promotore per le RNA polimerasi fagiche (T7 o SP6) -Linearizzare il DNA stampo con enzimi di restrizione (*) -Incubare in provetta DNA, ribonucleotidi trifosfato e RNA polimerasi -Lasciare procedere la reazione per 1-2h a 37°C -estrarre lRNA T7 o SP6 promoter Sito di restrizione per * cDNA + RNA pol + NTPs + 32 P-UTP Trascrizione RNA radioattivo digestione linearizzazione

16 1000V22 mA RNAcircolare RNA e DNA sono carichi negativamente catodo- anodo+ Analisi di RNA marcato su gel e autoradiografia

17 Procedura Procedura – Isolare lRNA – Elettroforesi dellRNA su gel (agarosio o PAGE) – Trasferire lRNA su membrana (nylon) – Ibridazione con una sonda marcata Procedura Procedura – Isolare lRNA – Elettroforesi dellRNA su gel (agarosio o PAGE) – Trasferire lRNA su membrana (nylon) – Ibridazione con una sonda marcata Northern blot

18 Elettroblot (per gel di poliacrilammide) Buffer TB 0.5X blotting paper gel gel(acrilammide) Membrana(nylon) 10V 80 mA ON Membrana (nylon) Polo + Polo -

19 Controllo, mediante colorazione con bromuro detidio, del trasferimento dellRNA Membrana prima 28S rRNA 18S rRNA Gel dopo

20 AB CD Gel Soluzione di sviluppo Soluzione di fissaggio Lastra mRNA per la proteina X AB CD Lastra autoradiografica messa a contatto con il filtro Lastra sviluppata 1) Ibridazione della membrana con una soluzione nncontenente una sonda (RNA o DNA a singolo nnfilamento) marcata radioattivamente 2) 2) Rivelazione dei segnali

21 Alcune applicazioni... 1.In quali tessuti è espresso il trascritto?

22 2. Come varia lespressione del trascritto? miR-124a miR-98 U2 snRNA controllo di caricamento + stimolo assenza di stimolo + stimolo

23 Estratti cellulari Procedura Procedura Cellule sedimentate, incubate in tampone di lisi (contenente detergente non ionico) Cellule sedimentate, incubate in tampone di lisi (contenente detergente non ionico) Dopo agitazione, gli omogenati sono centrifugati: i supernatanti contengono estratti citoplasmatici. Dopo agitazione, gli omogenati sono centrifugati: i supernatanti contengono estratti citoplasmatici. I sedimenti, contenenti i nuclei, sono lisati in un tampone di estrazione per ottenere gli estratti nucleari I sedimenti, contenenti i nuclei, sono lisati in un tampone di estrazione per ottenere gli estratti nucleari Procedura Procedura Cellule sedimentate, incubate in tampone di lisi (contenente detergente non ionico) Cellule sedimentate, incubate in tampone di lisi (contenente detergente non ionico) Dopo agitazione, gli omogenati sono centrifugati: i supernatanti contengono estratti citoplasmatici. Dopo agitazione, gli omogenati sono centrifugati: i supernatanti contengono estratti citoplasmatici. I sedimenti, contenenti i nuclei, sono lisati in un tampone di estrazione per ottenere gli estratti nucleari I sedimenti, contenenti i nuclei, sono lisati in un tampone di estrazione per ottenere gli estratti nucleari

24 Purificazione di proteine Procedura Procedura Si fissa ad un supporto solido una molecola esca che ha affinità per la proteina che vogliamo isolare (es. anticorpo) Si fissa ad un supporto solido una molecola esca che ha affinità per la proteina che vogliamo isolare (es. anticorpo) Si fa scorrere lungo il supporto solido un estratto cellulare in modo che avvenga linterazione specifica con la molecola esca immobilizzata Si fa scorrere lungo il supporto solido un estratto cellulare in modo che avvenga linterazione specifica con la molecola esca immobilizzata Si recuperano le proteine trattenute con una soluzione che ne destabilizza i legami con la molecola esca Si recuperano le proteine trattenute con una soluzione che ne destabilizza i legami con la molecola esca Procedura Procedura Si fissa ad un supporto solido una molecola esca che ha affinità per la proteina che vogliamo isolare (es. anticorpo) Si fissa ad un supporto solido una molecola esca che ha affinità per la proteina che vogliamo isolare (es. anticorpo) Si fa scorrere lungo il supporto solido un estratto cellulare in modo che avvenga linterazione specifica con la molecola esca immobilizzata Si fa scorrere lungo il supporto solido un estratto cellulare in modo che avvenga linterazione specifica con la molecola esca immobilizzata Si recuperano le proteine trattenute con una soluzione che ne destabilizza i legami con la molecola esca Si recuperano le proteine trattenute con una soluzione che ne destabilizza i legami con la molecola esca

25 Cromatografia per affinità

26 SDS-PAGE Colorazione con Blu di Coomassie acrilammide/bis-acrilammide 29:1 (6-20%)+ SDS 0.1%

27 Procedura Procedura si effettua una trascrizione in vitro dellRNA di interesse. si effettua una trascrizione in vitro dellRNA di interesse. Si incuba il trascritto marcato con un estratto proteico contenente la proteina che si ipotizza legare lRNA di interesse Si incuba il trascritto marcato con un estratto proteico contenente la proteina che si ipotizza legare lRNA di interesse Il complesso RNA-proteina viene quindi analizzato su gel di acrilammide non denaturante Il complesso RNA-proteina viene quindi analizzato su gel di acrilammide non denaturante Procedura Procedura si effettua una trascrizione in vitro dellRNA di interesse. si effettua una trascrizione in vitro dellRNA di interesse. Si incuba il trascritto marcato con un estratto proteico contenente la proteina che si ipotizza legare lRNA di interesse Si incuba il trascritto marcato con un estratto proteico contenente la proteina che si ipotizza legare lRNA di interesse Il complesso RNA-proteina viene quindi analizzato su gel di acrilammide non denaturante Il complesso RNA-proteina viene quindi analizzato su gel di acrilammide non denaturante Analisi di interazione RNA- proteine

28 Analisi interazioni RNA-proteine: band shift RNA radioattivo estratto proteico legame specifico RNA senza aggiunta di proteine elettroforesi autoradiografia complesso RNA libero incubazione

29 Saggio di band shift RNA libero


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