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ENZIMI DI RESTRIZIONE Reazione ligasica di frammenti di restrizione.

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Presentazione sul tema: "ENZIMI DI RESTRIZIONE Reazione ligasica di frammenti di restrizione."— Transcript della presentazione:

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2 ENZIMI DI RESTRIZIONE

3 Reazione ligasica di frammenti di restrizione

4 DNA RICOMBINANTE: DUE MOLECOLE DI DNA VENGONO UNITE IN PROVETTA SFRUTTANDO LE PROPRIETA’ DI ENDONUCLEASI DI RESTRIZIONE DI TIPO II E DELLA DNA LIGASI CLONAGGIO -IN BIOLOGIA CLONARE UN ORGANISMO SIGNIFICA OTTENERE UN INDIVIDUO UNA POPOLAZIONE DI ORGANISMI CHE SONO GENETICAMENTE IDENTICI -IN BIOLOGIA MOLECOLARE CLONARE UN TRATTO DI DNA SIGNIFICA OTTENERE UNA POPOLAZIONE DI DNA IDENTICHE ALLA MOLECOLA DI PARTENZA

5 Fig 4.20 separation of poly-A mRNA

6 mRNA Purification 1. Total RNA Purification 2. PolyA + RNA purification using oligo(dT)

7 mRNA primed mRNA mRNA/cDNA hybrid AAAAA n TTTTT AAAAA n TTTTT Anneal oligo dT primer Reverse Transcriptase and dNTPs Gubler Hoffman cDNA Synthesis - 1

8 mRNA/cDNA hybrid nicked RNA AAAAA n TTTTT AAAAA TTTTT RNase H Gubler Hoffman cDNA Synthesis - 2 AAAAA n TTTTT DNA Pol I nicked RNA used as primers by Pol

9 2nd strand cDNA in pieces ds cDNA AAAAA TTTTT cDNA Library Clone into vector E. coli DNA Ligase Gubler Hoffman cDNA Synthesis - 3 AAAAA TTTTT

10 cDNA synthesis TTTTTTTTT First strand Nick translation cDNA library

11 Vettori e clonaggio Vettori Plasmidi Fagi Cosmidi YAC

12 Vettori e clonaggio Plasmide Molecola circolare di DNA a doppio filamento, normalmente presente nella cellula batterica, in grado di replicarsi autonomamente dal cromosoma.

13 VETTORI DI CLONAGGIO

14 Vettori e clonaggio Replicazione di un plasmide

15 INSERIMENTO DI UN TRATTO DI DNA ESOGENO IN UN VETTORE DI CLONAGGIO

16 CLONAGGIO: -TRASFORMAZIONE -SELEZIONE -CRESCITA COLONIE

17 IDENTIFICAZIONE DELLA COLONIA BATTERICA DI INTERESSE

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19 Bromo-chloro-indoyl-  -galactopyranosidase or X-Gal (Clear) Bromo-chloro-indoyl (Deep blue insoluble) + galactose  -galactosidase

20 Inserting chromosomal DNA into a vector GAATTC CTTAAG GAATTC CTTAAG GAATTC CTTAAG GAATTC CTTAAG GAATTC CTTAAG Vector Chromosome Cut with EcoRI and add DNA ligase Recombinant vector Ampicillin resistant;  -galactosidase negative (White on X-Gal) LacZ gene codes for  -galactosidase Ampicillin resistance gene

21 Bacteria from ligation plated on ampicillin and X-Gal Contains wild type plasmd Contains recombinant plasmd

22 Vettori e clonaggio

23 Lunghezza massima del DNA clonabile in un plasmide: circa 20 Kb

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25 Amino acid sequence Met-Asn-Lys-Trp-Glu-Met ATG AAT AAA TGG GAA ATG ATG AAT AAA TGG GAG ATG ATG AAT AAG TGG GAA ATG ATG AAT AAG TGG GAG ATG ATG AAC AAA TGG GAA ATG ATG AAC AAA TGG GAG ATG ATG AAC AAG TGG GAA ATG ATG AAC AAG TGG GAG ATG Met = ATG; Asn = AAT or AAC; Lys = AAA or AAG; Trp = TGG; Glu = GAA or GAG How many probes must we make?

26 Screening the Library ATTAGCGCCTTTACGCA ……………………TAATCGCGGAAATGCGT…………

27 Il metodo Sanger (o metodo a terminazione di catena) 1) Il sequenziamento a terminazione di catena coinvolge la sintesi di nuovi filamenti di DNA, complementari ad uno stampo a singolo filamento Per la sintesi del DNA si utilizzano DNA polimerasi caratterizzate da Elevata processività Bassa attività esonucleasica 5’-3’ Bassa attività esonucleasica 3’-5’ (es. Klenow, Sequenasi)

28 Denaturazione del vettore Utilizzo di un fago helper Per M13 e produzione della Forma a singolo filamento (1) Produzione dello stampo a filamento singolo Utilizzo della PCR Utilizzo di fagemidi

29 Il metodo Sanger (o metodo a terminazione di catena) 2) un innesco specifico (primer) 3) La marcatura con un dNTP* marcato, di solito con 35 S Nel sequenziamento a terminazione di catena la reazione oltre ad 1) Uno stampo a singola elica ha bisogno di:

30 5’-A T C T T T T A G A GT A C C 3’-T A G A A A A T C T C A T G G A C T C T C T A C T A T C T A C A T G T A -5’ PRIMER DNA Polimerasi 5’-A T C T T T T A G A GT A C C T G AG*AGAT GA T AG*A 3’-T A G A A A A T C T C A T G G A C T C T C T A C T A T C T A C A T G T A -5’ DNA Polimerasi PRIMER (2,3) Sintesi del filamento marcato

31 Il metodo Sanger (o metodo a terminazione di catena) Nel sequenziamento a terminazione di catena la reazione oltre ad 1) Uno stampo a singola elica 2) un innesco specifico (primer) 3) La marcatura con un dNTP* marcato, di solito con 35 S ha bisogno di: 4) una miscela di ddNTP, uno per ogni reazione di sequenza

32 La sintesi del filamento compementare, tuttavia non prosegue indefinitivamente, perché la miscela di reazione contiene, in quattro distinte reazioni piccole quantità di specifici dideossinucleotidi trifosfati, ddATP, ddTTP, ddCTP e ddGTP, che bloccano l’allungamento perché posseggono un solo atomo di idrogeno al posto del gruppo -OH in 3’ Terminazione della catena

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34 ddCTP 5’-A T C T T T T A G A GT A C C T G AG*AGAT GA T AG*A 3’-T A G A A A A T C T C A T G G A C T C T C T A C T A T C T A C A T G T A -5’ DNA Polimerasi PRIMER + ddNTP ( per es. ddCTP) 5’-A T C T T T T A G A GT A C C T G AG*AGAT GA T AG*AT G T A dd C 3’-T A G A A A A T C T C A T G G A C T C T C T A C T A T C T A C A T G T A -5’ STOP Il risultato è una serie di frammenti interrotti ciascuno in corrispondenza di ogni dCTP

35 DNA stampo a singola elica 3’-GGCTAAC 5’3’ Ibridazione con Il primer + [ 35 S]dATP+dCTP,dGTP,dTT (dNTP) +Sequenasi ddATP, dNTP ddCTP, dNTP ddGTP, dNTP ddTTP, dNTP -CCG ddA -ddC -C ddC -CC ddG -CCGATT ddG -CCGA ddT -CCGAT ddT Sequenza: 5’-CCGATTG A C G T -CCGATT ddG -CCGAT ddT -CCGA ddT -CCG ddA -CC ddG -C ddC -ddC GTGT T A G C C Schema di sequenziamento a terminazione di catena Direzione di lettura

36 Nuovi metodi di sequenziamento Il sequenziamento a ciclo termico ( PCR asimmetrica) Il sequenziamento automatizzato con marcatori fluorescenti

37 Il sequenziamento a ciclo termico ( PCR asimettrica) Vengono effettuate 4 rezioni di PCR, ognuna contiene un solo primer e uno dei 4 dideossi nucleotidi trifosfati. Si generano le consuete famiglie di filamenti a catena terminata che vengono risolti per elettroforesi su gel di poliacrilammide DNA stampo ddATP PCR con un solo primer ddA

38 Il sequenziamento automatizzato con marcatori fluorescenti Coniugando a ciascun ddNTP un diverso marcatore fluorescente, è possibile effettuare le quattro reazioni di sequenziamento in un unico tubo da saggio e caricare il tutto in solo pozzetto di gel ddA ddC ddT ddG

39 Le emissioni fluorescenti vengono captate da un rilevatore e le informazioni vengono integrate e trasformate in picchi di colore diverso, con aree proporzionali all’intensità di emissione.

40 Fluorescent DNA Sequencing A G T A C T G G G A T C Gel Electrophoresis

41 Detection of Fluorescently Tagged DNA DNA Fragments Separated by Electrophoresis Output to Computer Scanning Laser Excites Fluorescent Dyes Optical Detection System

42 Fluorescent DNA Sequencing Data

43 Fluorescent DNA Sequence Trace


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