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TIROSIN CHINASI CITOPLASMATICHE. SH3 SH2 KINASE DOMAIN PH Tec (Btk/Itk/Bmx) KINASE DOMAIN FAK/Pyk2 KINASE DOMAIN SH2 Jak Src (Blk, Lck, Lyn, Fyn, Fgr,

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1 TIROSIN CHINASI CITOPLASMATICHE

2 SH3 SH2 KINASE DOMAIN PH Tec (Btk/Itk/Bmx) KINASE DOMAIN FAK/Pyk2 KINASE DOMAIN SH2 Jak Src (Blk, Lck, Lyn, Fyn, Fgr, Hck, Yes) KINASE DOMAIN SH2 ZAP70/Syk (FERM) Focal adhesion targeting (paxillin binding) TIROSIN CHINASI CITOPLASMATICHE Abl/Arg KINASE DOMAIN SH3SH2 KINASE DOMAIN SH3SH2 Ac. miristico/palmitico Ac. miristico

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4 G. Steven Martin : THE HUNTING OF THE SRC, Nature Reviews Molecular Cell Biology 2, (2001)

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7 Src Integrine

8 FAK YP397 SH2 SH3 Src FAK e membri della famiglia del Src costituiscono un’unità di trasduzione del segnale da parte di molecole adesive definite INTEGRINE FAK SH2 SH3 Src SH1

9 Outside-in signaling

10 FAK Interazione con catena  delle integrine e fattori di crescita Interazione con fosfatidil inositolo (4,5) bisfosfato (PIP2) Interazione con proteine favorenti la polimerizzazione dell’actina (complesso Arp 2/3) Interazione con paxillina C dominio catalitico dominio FERM dominio FAT N YP Autofosforilazione Interazioni con altre proteine (Src, PI3 chinasi, PLC  SH2 YP Sito di interazione con Grb2 SH2 Poli-P Interazione con Cas SH3 F1 F2 F3

11 Anche FAK come Src viene attivata in seguito alla rottura di interazioni intermolecolari che la mantengono in uno stato inibito. Anche FAK come Src viene attivata in seguito alla rottura di interazioni intermolecolari che la mantengono in uno stato inibito.

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13 FAK YP397 SH2 SH3 Src PY PI3KAKT PROLIFERAZIONE E SOPRAVVIVENZA Il distacco da proteine della matrice extracellulare induce una forma di apoptosi (chiamata “anoikis”) che determina il fenomeno della cosiddetta “crescita dipendente dall’ancoraggio”

14 FAK YP397 SH2 SH3 SH1 Src YP925 Grb2 Poli-P Sos Ras Raf MAPK MAPK (ERK1/2) TRASCRIZIONE GENICAProliferazione e sopravvivenza cellulare Cas PY CrkPoli-P Dock180 Rac PAK JNK Polimerizzazione dell ’actina e protrusione del lamellopodio Movimento cellulare PI3-chinasi P PP P PP Fosfatidilinositolo 3,4,5 fosfato PH GEFs Rac, Cdc42 PIP5-chinasi  Fosfatidilinositolo 4,5 fosfato P P P P PLC  IP3 paxillina Interazione con altre Proteine cito- scheletriche e segna- lanti

15 FAK, Src e altre chinasi vengono inibite da tirosin fosfatasi che sono sensibili all’azione inibitoria di ROIs Protein fosfatasi attiva Protein fosfatasi inattiva FAK, Src, GF-Rs, MAP chinasi (JNK, ERKs) attive FAK, Src, GF-Rs, MAP chinasi (JNK, ERKs) inattive

16 La transizione epitelio-mesenchimale rappresenta una modificazione tipica dei tumori epiteliali metastatici An epithelial-mesenchymal transition (EMT) is a biologic process that allows a polarized epithelial cell, which normally interacts with basement membrane via its basal surface, to undergo multiple biochemical changes that enable it to assume a mesenchymal cell phenotype, which includes enhanced migratory capacity, invasiveness, elevated resistance to apoptosis, and greatly increased production of ECM components. The completion of an EMT is signaled by the degradation of underlying basement membrane and the formation of a mesenchymal cell that can migrate away from the epithelial layer in which it originated. (Kalluri and Weinberg, J. Clin. Invest. 119:1420, 2009)

17 EPITHELIAL-MESENCHIMAL TRANSITION MESENCHIMAL-EPITHELIAL TRANSITION

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19 giunzioni serrate (tight junction) giunzioni aderenti (adherens junctions) E-caderina  cat.  cat. p120 cat. F-actina vinculina p120 cat. microtubuli  cat. Rac Rho Movimento Previene endocitosi e de- gradazione E- caderina Migrazione nel nucleo e trascrizione geni implicati nella proliferazione cellulare E-caderina

20 giunzioni serrate (tight junction) giunzioni aderenti (adherens junctions)  cat.  cat. p120 cat. F-actina vinculina E-caderina Recettori per fattori di crescita: TGF  RI e II, IGF-1R, EGFR, c-Met L’aumentata stimolazione con fattori di crescita altera funzioni di E-caderine In diversi modi

21 L’aumentata stimolazione con fattori di crescita altera funzioni di E-caderine In diversi modi 1.Il promotore del gene per le E-caderine viene represso da repressori trascrizionali (Snail, Twist, Slug e altri) indotti da Recettori per GF e altre vie attivate nel corso di “progressione” tumorale (compreso Nf-  B). 2. Tirosin chinasi recettoriali (EGFR, IGF-1R, c-Met, FGF) e non recettoriali (c-Src) inducono fosforilazione e successiva ubiquitinilazione di E-caderine e catenina con conseguente degradazione nel proteosoma. La fosforilazione di E-caderina comporta anche il distacco di  e  catenine. 3. Proteasi (metallo-proteasi – MMP) proteolizzano E-caderine alterando contatti cellula-cellula. 4. Gli stessi segnali che “down-regolano” espressione di E-caderine aumentano espressione di N- caderine (il cosiddetto “caderin-switch”), che sono espresse da cellule mesenchimali e regolano positivamente il movimento cellulare.

22  cat.  cat. p120 cat. F-actina vinculina E-caderina Rac Cdc42 Rho movimento Sress fibers, focal adhesion

23 E-caderina  cat. P P P DEGRADAZIONE NUCLEO Trascrizione geni implicati in proliferazione e progressione GSK-3 Snail P P  cat. Repressione sintesi E-caderine Inibizione di GSK da parte di GF-Rs o altri stimoli favorisce la progressione neoplastica

24 Un meccanismo aggiuntivo di regolazione della funzione di  catenica è rappresentato da un suo aumento di espressione in cellule stimolate con proteine wnt (ampia famiglia di fattori di crescita poco caratterizzati) Gene onco-soppressore, la cui mutazione in cellule della linea germinale determina la Poliposi Adenomatosa Famigliare del Colon

25 a | In the absence of WNT signalling, -catenin levels in the cytoplasm and nucleus are low as a result of continuous phosphorylation by the serine/threonine kinases CK1 (casein kinase 1) and GSK3 (glycogen synthase kinase 3), leading to binding of -transducin-repeat-containing protein (TRCP) and to ubiquitylation and degradation by the proteasome. The destruction complex is composed of CK1 and GSK3, as well as the anchor proteins AXIN1 (axis inhibition protein 1 ) and APC (adenomatous polyposis coli). In the nucleus, TCF (T-cell factor) molecules are bound by co-repressors such as GRG/TLE (Groucho/transducin-like enhancer) proteins that shut off expression of WNT target genes. Other components of the repressor complex include CTbP (C-terminal binding protein) and HDACs (histone deacetylases). -catenin in the nucleus is inhibited from binding TCF by ICAT (cell autonomous inhibitor of -catenin and TCF). The Frizzled receptor complex — composed of Frizzled and LRP5 (LDL-receptor-related protein 5) or LRP6 — can also be actively inhibited by receptor-bound soluble inhibitors such as DKK1 (Dickkopf homologue 1). b | Upon binding of a lipid-modified WNT protein to the receptor complex, a signalling cascade is initiated. LRP is phosphorylated by CK1 and GSK3, and AXIN1 is recruited to the plasma membrane. The kinases in the -catenin destruction complex are inactivated and -catenin translocates to the nucleus to form an active transcription factor complex with TCF, leading to transcription of a large set of target genes. In the nucleus, -catenin binds to TCF and LEF factors and recruits co-factors such as legless (LGS; also known as BCL9) and Pygopus (PYGO), CBP/p300, Brahma and MED12 to initiate transcription99, 100, 101. DVL, mammalian homologue of Drosophila Dishevelled; PP2A, protein phosphatase 2A.

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28 Dipartimento di Patologia Sezione di Patologia Generale Università di Verona

29 R. Ren, 5: Haematopoietic stem cell Common myeloid progenitors Chronic myeloid leukemia-chronic phase Granulocyte/macrophage progenitors Megakaryocyte/erythrocyte progenitors Common lymphoid progenitors Chronic myeloid leukemia-blast phase (70%) Chronic myeloid leukemia-blast phase (30%)

30 With the aid of several mediator proteins, BCR-ABL associates with Ras and stimulates its activation. The adaptor protein, growth factor receptor-bound protein 2 (GRB2), interacts with BCR-ABL through the proximal SRC homology 2 (SH2)-binding site that develops when the tyrosine 177 (Y177) residue of BCR-ABL is autophosphorylated. GRB2, when bound to BCR-ABL, interacts with the son of sevenless (SOS) protein. The resulting BCR–ABL–GRB2–SOS protein complex activates Ras. The adaptor proteins CRKL (CRK-like) and SHC (SH2-containing protein) can also mediate the BCR-ABL activation of Ras. Ras and the mitogen activated protein kinase (MAPK) pathway are coupled by Raf (a serine/threonine kinase). Raf catalyses the phosphorylation of the mitogen-activated and extracellular-signal regulated kinase kinases 1 and 2 (MEK1 and MEK2); this results in their activation. Through the stimulation of the Ras–Raf pathway, BCR-ABL increases growth factor- independent cell growth. BCR-ABL also associates with and activates the phosphatidylinositol-3 kinase (PI3K) pathway, suppressing programmed cell death and increasing cell survival. BCR-ABL is associated with components of the focal adhesion(that is, actin, paxillin and focal adhesion kinase, or FAK); the activation of CRKL– FAK–PYK2 leads to a decrease in cell adhesion. BCR-ABL also associates with the Janus kinase and signal transducer and activator of transcription (JAK–STAT) pathway. Finally, BCR-ABL activates pathways that lead to atypical responses to chemotactic factors, which leads to an increase in cell migration. BCR-ABL also associates with survival proteins that interact with the mitochondrial-based BCL2 family. CAS, p130 CRK-associated substrate; GAB2, GRB2-associated binding protein 2; SHIP, SH2-containing inositol-5-phosphatasePI3Kfocal adhesion Weisberg et al. 7:345, 2007

31 (Imatinib mesilato)

32 ITAM ( Immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif) : DExxYxxL/I(x) 6-7 YxxL/I TRASDUZIONE DEL SEGNALE DA PARTE DI RECETTORI IMMUNI

33 ITAM ITIM: I/VxxYxxL/V Fc  RIIA Fc  RIIB Immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif

34 TRASDUZIONE DEL SEGNALE DA PARTE DI RECETTORI IMMUNI

35 attivazione

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37 C-type lectins

38 ZAP70 Fyn/ Lck Syk Lyn Lyn/Hck/Fgr

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40

41

42

43 Abl

44 Lipide fosfatasi

45 Protein fosfatasi

46 YP SYK SFK ? SYK YP ITAM ANCHE ALCUNE FAMIGLIE DI INTEGRINE (  2 E  3) TRASDUCONO IL SEGNALE MEDIANTE UN MODULO BASATO SU ADATTATORI CON SEQUENZA ITAM E SYK


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