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By NA Fibrosi Cistica II Lezione 8. By NA * Il linkage e’ una relazione di vicinanza fra due loci ed e’ funzione della loro distanza. La definizione di.

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1 By NA Fibrosi Cistica II Lezione 8

2 By NA * Il linkage e’ una relazione di vicinanza fra due loci ed e’ funzione della loro distanza. La definizione di un linkage fra due loci si basa su calcoli statistici che permettono di quantizzare la probabilta’ che i risultati ottenuti non siano dovuti al caso. Nel caso dell’uomo l’analisi della progenie di una singola famiglia raramente fornisce informazioni sia per lo scarso numero di meiosi sia per la difficolta’ di risalire alla fase. Bisogna mettere insieme i dati provenienti da piu’ famiglie. Linkage-lod score Odds ratio= P di un assortimento genetico in una progenie se i geni sono associati P di un assortimento genetico nella progenie se i geni sono indipendenti Lod score: logaritmo in base 10 dei singoli rapporti di ogni famiglia, si possono cosi sommare. Un valore di 3 indica linkage. ( 1-    n  r (1/2) n+r

3 By NA LOD SCORE LOD SCORE (Z): logaritmo della probabilita ’ che i loci siano associati (data la frazione di ricombinazione  ) piuttosto che non associati (  0.5). La probabilita ’ complessiva di un gruppo di famiglie e ’ il prodotto delle probabilta ’ di ciascuna famiglia, percio ’ la somma dei lod score. Per  = 0.5,  Z=0:  infatti sono il rapporto fra probabilta ’ identiche e log 10 (1)=0. Z=3(1000:1) e ’ la soglia per accettare il linkage con una probabilita ’ di errore del 5%. Z=-2 esclude il linkage Frequenza di ricombinazione Z

4 By NA  1985: Analisi di linkage: il gene della fibrosi cistica (CF) viene associato ad un polimorfismo proteico (enzima paraossonasi) di cui si ignora la localizzazione. Fibrosi Cistica ancora storia Per una patologia autosomica recessiva l’analisi di linkage e’ ostacolata dal fatto che non si conosce la FASE, per cui il calcolo si effettua prima considerando che i 2 loci(allele polimorfico e locus malattia) siano in cis e poi in trans e il valore di lod score sara’ la media tra i due valori ottenuti. -/+ -/- -/+ -/+ -/-

5 By NA  1986: Furono trovati altri marcatori associati alla CF e il gene della paraossonasi viene mappato sul cromosoma 7.  Identificata la regione, utilizzando gli RFLP della regione, si restringe la mappatura di CF alla bande citogenetiche 7q Si definirono inoltre i marcatori fiancheggianti: oncogene MET prossimale e D7S8 (clone anonimo) distale * TRA OGNUNO DI QUESTI MARCATORI E IL GENE DELLA CF SONO STATI TROVATI DEI RICOMBINANTI.  NESSUNO DI QUESTI MARCATORI E’ IL REALE RESPONSABILE DELLA CF Met CF D7S8 Fibrosi Cistica ancora storia

6 By NA  1989: si riesce ad evidenziare la presenza di linkage disequilibrium per i marcatori XV2.c e KM19 che risulteranno far parte del 5’ del gene Fibrosi Cistica: ancora storia  1986-: si identificano altri polimorfismi nella regione e si fonda un consorzio per cumulare i dati raccolti in piu’ centri. Viene attuato prima il chromosme walking, successivamente, per ovviare alla brevita’ delle sonde disponibili, si passo’ al chromosme jumping  Cos’e’ il linkage disequilibrium?

7 By NA  Il linkage e’ una relazione fra loci, mentre l’associazione e’ la relazione fra alleli. Associazione allelica significa che se degli individui hanno un certo allele in un locus, la probabilita’ di avere un particolare allele di un altro locus e’ statisticamente piu’ alta di quella legata al caso e/o alla frequenza del secondo allele nella popolazione. Es. un particolare antigene HLA e’ presente nel 78% della popolazione con artrite reumatoide, ma e’ presente nel 36% della popolazione generale. Linkage disequilibrium  L’associazione e’ un’ asserzione statistica che segnala la ricorrenza contemporanea di alcuni alleli o di fenotipi. L’associazione ha cause diverse,non necessariamente genetiche, mentre il linkage e’ una relazione specifica legata alla vicinanza fisica di due locus. Es. se il locus A e’ fisicamente associato ad un locus malattia, in una specifica famiglia un particolare allele di quel locus segrega con la malattia, in un altra e’ un altro allele, ma nella popolazione generale entrambi gli alleli sono presenti anche associati al gene normale.

8 By NA LINKAGE EQUILIBRIUM: l’associazione in cis o trans di 2 alleli su un cromosoma e’ casuale. Se definiamo APLOTIPO la particolare combinazione di alleli sul cromosoma, la frequenza di ogni aplotipo e’ pari al prodotto delle frequenza dei singoli alleli. LOCUS ALLELI FREQUENZA APLOTIPI FREQUENZA 1212 AaBbAaBb pqrspqrs ABAB AbAb aBaB abab pr ps qr qs  NON SEMPRE E’ COSI…. Linkage disequilibrium

9 By NA  Il linkage disequilibrium e’ una situazione per cui un particolare aplotipo e’ statisticamente piu’ probabile in un sottogruppo di una popolazione. Indica che la popolazione deriva da un comune ancestore o, nel caso delle mutazioni patogene, che la mutazione e’ avvenuta su un cromosoma ancestrale comune alla popolazione. Il linkage disequilibrium non ha niente a che fare con la presenza della mutazione patogena e’ una osservazione che facilita la mappatura genetica. Indica che fisicamente associato al locus A polimorfico c’e’ un altro locus che, quando mutato origina la malattia. Essendo un fenomeno legato all’origine comune degli individui della popolazione, in un’altra popolazione il disequilibrium riguardera’ un altro allele del locus A Linkage disequilibrium

10 By NA  E’ necessario considerare tutte le cause dell’associazione: il linkage disequilibrium e’ solo una delle cause Linkage disequilibrium * Causa-effetto e selezione naturale: Un certo allele rende piu’ suscettibili a manifestare la malattia o permette alle persone malate di sopravvivere e di avere figli * Errori per la stratificazione della popolazione o per mancata correzione statistica: se una popolazione e’ composta di sottoinsiemi geneticamente distinti entrambi i marker possono essere piu’ frequenti, ma senza che questo implichi un’associazione. Nel secondo caso i dati non vengono confermati da studi successivi

11 By NA Dati ottenuti su 114 famiglie britanniche con un figlio affetto. Il cromosoma CF, identificato perche’ presente nell’affetto, tende a portare gli alleli X1 e K2. Il gene della Fibrosi Cistica e’ stato clonato grazie alla presenza del linkage disequilibrium. CHR CF (254 con mut) CHR NORMALI (318 wild-type) APLOTIPO ALLELE di XV-2C ALLELE di KM-19 numeropercentualenumeropercentuale A B C D Incerto24 Fibrosi Cistica e linkage disequilibrium

12 By NA dell’effetto del fondatore il locus malattia e’ strettamente associato ai due marcatori XV-2C e KM-19 * Potrebbe essere causa dell’effetto del fondatore: la mutazione potrebbe essere comparsa in un antenato della popolazione Nord-Europea che portava l’aplotipo B e probabilmente gli eventi di ricombinazione non hanno avuto sufficiente tempo per rispristinare una situazione di equilibrio, cioe’ ad una associazione casuale. Cio’ significa anche che gli eventi di ricombinazione sono rari tra il gene CF e i due marcatori cioe’ il locus malattia e’ strettamente associato ai due marcatori XV-2C e KM-19 vantaggio selettivo nell’individuo * La presenza di un particolare aplotipo potrebbe conferire un vantaggio selettivo nell’individuo che lo porta (come accade per gli antigeni HLA: particolari aplotipi sembrano migliorare la risposta immunitaria e percio’ sono sottoposti a pressione selettiva)  La conoscenza del linkage disequilibrium oltre a dare una indicazione della localizzazione precisa del locus malattia, risulta utile per la consulenza: permette di calcolare con maggiore precisione il rischio di trasmissione. Es: normalmente 1/25 portatori nella popolozione nord-europea, ma se un individuo ha aplotipo BB il rischio e’ maggiore, mentre e’ molto ridotto per aplotipi AA. Possibili cause del linkage disequilibrium

13 By NA Tecniche utilizzate Gene walking Chromosome jumping Zoo- blot RICERCA DELLE MUTAZIONI Clonaggio del gene della CF

14 By NA CFTR 1989: una volta clonato il gene putativo, bisogno’ dimostrare che era il gene della fibrosi cistica. Furono pertanto esaminati gli affetti e si trovo’ che il 70% dei cromosomi CF presentavano la delezione di una tripletta (  F508) senza che venisse alterata la ORF. Il prodotto del gene e’ stato definito CFTR( cystic fibrosis transmembrane conductance regulator). OUTIN Nterm NBD1NB21 RDomain Cterm ATP ADP+ Pi ATP

15 By NA La presenza in omozigosi della  F508 in individui gravemente affetti non era conclusiva, anche se molto convincente: la delezione avrebbe potuto essere un polimorfismo come altri in linkage disequilibrium strettissimo con il gene. La identificazione del coinvolgimento di CFTR nel trasporto dello ione cloro attraverso le membrane apicali e la caratterizzazione di alcune mutazioni il cui effetto era piu’ evidente sull’espressione del gene confermarono che CFTR era il gene della Fibrosi cistica. cloro CFTR Conferma del coinvolgimento di CFTR

16 By NA   Oggi sono state descritte oltre 700 mutazioni nel gene CFTR Molte vengono definite mutazioni private, perche’ individuate in una sola famiglia. In molti casi non e’ certo che siano patogene, potrebbero essere sequenze varianti in un cromosoma in cui e’ presente un allele CF. Non ci sono altre mutazioni molto frequenti, sono tutte mutazioni con frequenza che non supera qualche punto percentuale. Sono state trovate mutazioni di diverso genere lungo tutto il gene e probabilmente altre devono essere ancora scoperte  La presenza di centinaia di mutazioni diverse rende molto difficili i test diagnostici per la CF Screening per PCR e successiva amplificazione Amplificazione specifica con primer che legano sequenze mutate Diagnosi di CF

17 By NA SONO STATE TROVATE MUTAZIONI DI VARIO GENERE: * Mancata produzione della proteina(frameshift e non senso)  Mancato processamento della proteina e conseguente ripiegamento anomalo della stessa e incapacita’ di fuoriuscire nel lume cellulare(  F508) * Non corretta regolazione della proteina: il canale ionico e’ regolato tramite fosforilazione da parte di kinasi cAMP dipendenti, mutazioni nei domini regolatori della proteina portano al mancato funzionamento di questo sistema. * Mutazioni puntiformi che distruggono il canale stesso. * Alcuni soggetti presentano mutazioni in omozigosi e sono affetti piu’ gravemente. * Esistono anche casi di eterozigosi composta con mutazioni diverse nello stesso soggetto. Tipi di mutazione

18 By NA Ricerca delle mutazione nel gene CFTR Le mutazioni CF sono piu’ di 700, le piu’ comuni hanno frequenza diversa nelle popolazioni:  F508 va dal 50% nel mediterraneo all’85% in Danimarca e nei paesi baschi, in media il 70% degli ALLELI MUTATI sono  F508. Altre 12 mutazioni hanno una frequenza combinata del 15%. quindi le frequenze medie dei genotipi dei MALATI di fibrosi cistica sono : 49%  F508/  F508 21%  F508/mutaz. comune non  F508 21%  F508/mutaz.rara 4.5% mutaz. comune non  F508/mutaz. rara 2.25% mutaz. comune non  F508/ mutaz. comune non  F % mutaz. rara/mutaz. rara Circa il 90% degli affetti ha almeno un allele  F508 e sara’ comunque possibile in Europa identificare circa il 70% dei genotipi utilizzando i test per le mutazioni comuni


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