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Mappaggio di geni malattia mediante analisi di linkage: l’esempio della Paraparesi Spastica Ereditaria Dipartimento di Biologia Universita’ degli Studi.

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Presentazione sul tema: "Mappaggio di geni malattia mediante analisi di linkage: l’esempio della Paraparesi Spastica Ereditaria Dipartimento di Biologia Universita’ degli Studi."— Transcript della presentazione:

1 Mappaggio di geni malattia mediante analisi di linkage: l’esempio della Paraparesi Spastica Ereditaria Dipartimento di Biologia Universita’ degli Studi di Padova

2 Analisi di linkage PARAMETRICA NON PARAMETRICA - No modello genetico - Caratteri complessi ASP: Affected Sib Pairs APM: Affected Pedigree Member - Preciso modello genetico modalità di eredità frequenze geniche penetranza di ciscun genotipo - Caratteri mendeliani Calcolo dei lod score (Morton 1955)

3 Lod score - A 2 punti: probabilità di linkage tra 2 loci (MLINK) probabilità che i due loci siano associati 0<  <0.5 probabilità che i due loci non siano associati  = 0.5 Lod score Z= log 10 Valori soglia Z> +3 accettare il linkage Z< -2 escludere il linkage - A più punti: localizzazione del gene malattia rispetto ad una batteria di marcatori (LINKMAP, GENEHUNTER)

4 Paraparesi Spastica Ereditaria (HSP) Malattia neurodegenerativa Esordio variabile (II- IV decade di vita) Progressiva spasticita' degli arti inferiori Aumento dei riflessi tendinei Patogenesi: degenerazione assonale tratti corticospinali e colonna dorsale ETEROGENEITA’ clinica genetica Forme non complicate Forme complicate Spastina Paraplegina AD-HSP AR-HSP X-linked HSP SPG 3 SPG 4 SPG 6 SPG 8 SPG 9 SPG 10 SPG 12 SPG 13 SPG 5 SPG 7 SPG 11 SPG 14 SPG 1 SPG 2 SPG15 L1CAM PLP

5 Paraplegina (Casari 1998) Spastina (Hazan 1999) SPG7 AR-HSP (De Michele 1998) mitocondrio ATPasi AAA, peptidasi M41 SPG4 AD-HSP (Hazan 1994) nucleo ATPasi AAA (ATPases Associated with various cellular Activities) Locus localizzazione funzione biochimica domini caratteristici

6 CARATTERISTICHE CLINICHE: Diagnosi: Paraparesi Spastica Ereditaria Esordio:  30 anni Altre caratteristiche: - piede cavo bilaterale - neuropatia motoria distale evidenziata da MCV nervo SPE  - disturbi cognitivi Famiglia con HSP complicata

7 Esclusione dei loci noti per la HSP a trasmissione autosomica recessiva

8 Simulazione di linkage Pedigree file 2. Parameter file Calcolo del lod score potenziale mediante i programmi SLINK e MSIM Modello di eredità: autosomica recessiva Frequenza dell’allele malattia: 1: Penetranza: 100% Alleli del marcatore simulato: 5 alleli equifrequenti Max lod score potenziale Z max = 2.82 a  = 0.0

9 Metodo: Genomewide Search microsatelliti (CA repeats) distribuiti in 28 pannelli - Range di lunghezza: basi - Elevata informatività (eterozigosità media: 0.8) - Distribuiti lungo il genoma con una distanza media di 10 cM - Marcati con molecole fluorescenti: FAM blu, HEX verde, NED giallo ABI PRISM Linkage Mapping set version 2 (PE Applied Biosystems) Caratteristiche dei marcatori

10 Metodica utilizzata Amplificazione in piastre da 96 pozzetti Pool di marcatori per un individuo Elettroforesi su sequenziatore ABI 373 Collection file Results file Lettura alleli Lod score Genescan Collection Genescan analysis 3.0 Geotyper MLINK

11 Genescan Analysis 3.0 file Genotyper file

12 Linkage Reporter % di Esclusione del genoma % di esclusione per ogni cromosoma

13 Regioni di positività Cromosoma 1 Cromosoma 3 Cromosoma 9

14 Report del cromosoma 3

15 Analisi della regione candidata 3q27-q28 selezione di ulteriori 15 marcatori microsatelliti localizzati nella regione di interesse dalla mappa di UDB: Unified DataBase for Human Genome Mapping

16 I II D3S1262 D3S3651 D3S1580 D3S3530 D3S1294 D3S2747 D3S1601 D3S3663 D3S3669 D3S2305 D3S1305 D3S1265 cM SPG14 (4.5cM) Ricostruzione e analisi degli aplotipi

17 MULTIPOINT (Genehunter 1.3) Z max = 3.9 per D3S1601 Z > 3.00 tra D3S1580 e D3S3669 Lod score

18 Analisi di linkage Regione cromosomica candidata Gene malattia (mutazioni patogene) Clonaggio posizionale Costruzione di mappe genetiche e fisiche ad alta risoluzione Costruzione di contigui di cloni Identificazione e sequenziamento dei trascritti Ricerca di mutazioni patogene in pazienti Mappaggio EST sequenziamento e ricerca di ORF screening di librerie di cDNA “exon trapping” ricerca di isole CpG ipometilate

19 Limiti del clonaggio posizionale Dimensioni della regione N° di geni presenti Progetto Genoma Umano Mb Sviluppo di databases

20 Clonaggio posizionale-candidato (candidate positional cloning) Espressione Funzione omologia con altri geni umani omologia con geni in organismi modello (Topo, Drosophila...) Analisi della regione candidata mediante consultazione di DATABASE Individuazione dei geni noti Selezione dei geni candidati Ricerca di mutazioni patogene in pazienti

21 Regione candidata geni noti Programmi di predizione genica Ricerca di sequenze codificanti simili Ricerca di esoni (Genscan, Grail) Pacchetti di software (NIX) Database con previsioni (GENOME BROWSER, ENSEMBL) Analisi della proteina putativa (SMART, PFAM) Ricerca di omologie Ricerca di domini Sequenze segnale GENI NON NOTI

22 Databases

23 Analisi della regione critica 3q27-q28 47 cloni  70% sequenziato 6 Gap  0.1 Mb

24 8 Geni noti 13 UniGene Clusters (376 ESTs) 3q27 3q28 Hs Hs Hs Hs Hs Hs Hs Hs Hs Hs Hs Hs Hs LPP: lim domain-containing preferred translocation partner in lipoma TP63 : tumor protein CLDN1 : claudin 1 CLDN16 : claudin 16 IL1RAP : interleukin 1 receptor accessory protein FGF12/FGF12B: fibroblast growth factor 12 FLJ10718 PRO1446

25 LPP: lim domain-containing preferred translocation partner in lipoma TP63 : tumor protein CLDN1 : claudin 1 IL1RAP : interleukin 1 receptor accessory protein FGF12/FGF12B: fibroblast growth factor 12 Analisi dei geni noti CLDN16 : claudin 16 FLJ10718 PRO1446 Espressione Funzione Localizzazione Omologie con altri geni

26 FGF12 Espressione:  SN Altamente conservato (100% omologia nel topo) Funzione: implicato nello sviluppo e funzionamento del SN (Smallwood et al.1996) IL1RAP Funzione: trasduzione del segnale IL1- IL1RI Simile a IL1RAPL mutata in forme di ritardo mentale e disturbi cognitivi (Carrie et al. 1999) sIL1RAP mRNA mIL1RAP mRNA IL1RAP gene (A)n 5’ 3’ FGF12 mRNA FGF12 gene (A)n Ex 1A 3’ 5’ Ex 1B FGF12B mRNA (A)n 3’ 5’

27 Sequenziamento FGF12 e IL1RAP esclusione sequenze codificanti siti di splicing regioni 5’ e 3’ UTR Risultati Valutazione delle regioni regolative per FGF12 e IL1RAP Valutazione di nuovi geni identificati nella regione critica Analisi delle ESTs e dei trscritti parziali Prospettive

28 Giovanni Vazza Francesca Boaretto Michela Zortea Andrea Bozzato M. L. Mostacciuolo V. Sartori G.F. Micaglio Progetto finanziato dall’Universita’ degli Studi di Padova


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